Purificazione genoma a livello di extrachromosomal circolare DNA dalle cellule eucariotiche

Purificazione dell'intero genoma di DNA circolare extracromosomico da cellule eurcariotiche. Ciao, sono Rasmus. Qui presenterò l'intero schema per il metodo per la purificazione circolare del DNA.

Nella prima parte, le cellule di lievito vengono coltivate e raccolte. Quindi il DNA circolare viene purificato e amplificato in tre fasi. In primo luogo, mediante separazione in colonna dove i cerchi di DNA vengono purificati e arricchiti.

Quindi, mediante trattamento del DNA con esonucleasi per digerire tutto il DNA lineare rimanente, e infine mediante amplificazione dei cerchi di DNA utilizzando la polimerasi phi-29. Nella quinta parte di questo protocollo, i cerchi di DNA vengono sequenziati e le letture vengono mappate sul genoma di riferimento di Saccharomyces cerevisiae. Alla fine di questo video, ti mostreremo alcuni risultati rappresentativi.

Discuteremo le prospettive per gli studi futuri e i vantaggi dell'utilizzo di questo metodo. Prima parte, raccolta cellulare. La coltura starter viene coltivata a 30 gradi con agitazione alla massima densità, che è di circa 200 milioni di cellule per millilitro e viene raggiunta dopo 24-48 ore.

La coltura maturata viene trasferita in una provetta Falcon e pellettata mediante centrifugazione per tre minuti. Il surnatante viene rimosso. Il pellet di grandi dimensioni viene vorticato in tampone TE e ripellettato mediante centrifugazione.

Seconda parte, purificazione della colonna. In questa fase, utilizziamo un kit di purificazione a colonna disponibile in commercio che produce plasmidi altamente purificati dal DNA batterico genomico. Prima di utilizzare questo kit con il lievito, è necessario interrompere la parete cellulare.

Questo viene fatto risospendendo il pellet della cella lavata nel tampone L-1 dal kit. La sospensione cellulare viene trasferita in una provetta da microcentrifuga e le perle di vetro vengono aggiunte a un terzo del volume totale. Il campione viene agitato alla massima velocità per 10 minuti e le perle vengono rimosse mediante centrifugazione a 2.000 giri al minuto per 30 secondi.

Il surnatante viene trasferito in una nuova provetta. In questo metodo aggiungiamo plasmidi altamente diluiti al surnatante in tre diversi rapporti. Proponiamo di includere nel ciclo plasmidi altamente diluiti.

Questo può servire come guida di riferimento interna. Questo può essere utilizzato per controllare la qualità della purificazione e dell'amplificazione del DNA, nonché per eseguire una stima semi-quantitativa dei DNA non circolari per cellula utilizzando questi picchi di plasmidi. Dovrebbero essere aggiunti solo plasmidi altamente diluiti poiché influenzeranno la risoluzione della sequenza di altri DNA circolari.

La sospensione cellulare contenente plasmidi spiked viene trattata con la soluzione L-2 del kit e viene seguito il protocollo del kit. Dopo aver caricato la colonna, le proteine, i lipidi e il DNA cromosomico vengono rimossi lavando la colonna due volte. Il DNA circolare extra cromosomico è altamente arricchito nella frazione di eluato.

Terza parte, digestione lineare del DNA. In questa fase, utilizziamo un'esonucleasi per digerire il DNA lineare rimanente. Un'esonucleasi ATP dipendente ha come bersaglio specifico il DNA lineare a doppio filamento e il DNA a singolo filamento senza digerire il DNA circolare.

La specificità dell'esonucleasi per il DNA lineare è stata confermata mediante elettroforesi su gel dopo 29 ore di trattamento con DNasi. I risultati mostrano che il DNA genomico viene digerito mentre il DNA plasmidico rimane come indicato dalla freccia rossa. Il lievito contiene 16 cromosomi, lunghi fino a 1.500 kilobasi.

Quindi, per facilitare la digestione dell'esonucleasi, viene utilizzata una rara endonucleasi di taglio per ottenere un numero maggiore di estremità di DNA accessibili. Se si utilizza l'enzima di restrizione a base di ato NotI, ogni cromosoma viene scisso fino a sette volte come indicato. Il DNA purificato della colonna viene trattato con NotI a 37 gradi in un blocco riscaldante durante la notte.

Dopo l'inattivazione termica di NotI, il DNA scisso viene trattato con esonucleasi a 37 gradi secondo il protocollo del produttore. Dopo il trattamento con esonucleasi, gli enzimi vengono inattivati a 70 gradi per 30 minuti. Possono essere necessari diversi giorni per digerire tutto il DNA cromosomico lineare mediante ATP ed esonucleasi aggiuntivi Per garantire che tutto il DNA lineare sia completamente digerito, i campioni vengono analizzati con metodi PCR o qPCR utilizzando un gene di riferimento interno come ACTI.

Parte quarta, amplificazione del DNA. In questa fase, arricchiamo e amplifichiamo il DNA circolare utilizzando la phi-29 polimerasi. La reazione avviene a 30 gradi utilizzando oligonucleotidi esamero casuali e phi-29.

La polimerasi ha un'elevata fedeltà e attività di correzione delle bozze, garantendo un'amplificazione del DNA imparziale. Ogni polimerasi può, attraverso la replicazione del cerchio rotante, sintetizzare fino a 100 kilobasi di DNA. La polimerasi è anche altamente processuale e amplifica il DNA fino a 10 al nono di piega.

Quinta parte, sequenziamento. Seguendo il protocollo per una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione ad alto rendimento, il DNA viene sonicato a una dimensione media di 300 coppie di basi e sequenziato come letture single end a 141 nucleotidi. Le letture delle sequenze sono mappate sul genoma di riferimento di Saccharomyces cerevisiae, utilizzando il database gratuito Galaxy.

I dati sequenziati vengono caricati su Galaxy e le letture vengono mappate utilizzando l'allineatore a lettura corta Bowtie2, che consente la mappatura delle letture parziali. Parte sesta, risultati rappresentativi. Dopo il sequenziamento e la mappatura del genoma di riferimento di Saccharomyces cerevisiae, le letture possono essere visualizzate nel browser del genoma all'interno del software Galaxy.

Il DNA di origine circolare può, ad esempio, essere contato come regioni che contengono letture coerenti superiori a una kilobase, come indicato sullo schermo. Un esempio di una regione sul cromosoma quattro che contiene letture coerenti che si estendono su più di un kilobase è la regione con i geni trasportatori dell'esoso sei e sette. Quando si utilizza questo metodo su una popolazione di cellule di lievito, le reads mappate si trovano frequentemente in questo locus e la copertura delle reads suggerisce chiaramente che si è formato un cerchio di DNA tra i geni trasportatori dell'esoso parralog.

A causa dell'elevata omologia di sequenza tra i geni trasportatori dell'esoso, proponiamo che la ricombinazione omologa illegittima porti alla circolarizzazione di questo DNA. Nel modello per la mutazione circolare del DNA è quando il processo di riparazione del DNA viene eseguito in modo imperfetto. Ad esempio, se si verifica una rottura a doppio filamento in un elemento ripetitivo, allora la sequenza omologa sullo stesso cromatide può essere utilizzata come modello per la riparazione del DNA mediante ricombinazione omologa.

Dopo la resezione, l'invasione del filamento, la sintesi del DNA e la risoluzione di tutte le ingiunzioni, un cerchio di DNA può risalire dal genoma causando una delezione del DNA sul cromosoma. Gli effetti del trattamento del DNA con esonucleasi e phi-29 polimerasi possono essere visualizzati utilizzando la colorazione con ioduro di propidio. I controlli delle macchie del DNA genomico appaiono come nell'immagine a sinistra, mentre il DNA plasmidico appare come nell'immagine a destra.

Dopo 29 ore di trattamento con esonucleasi 400 nanogrammi di DNA genomico, la maggior parte del DNA viene digerita come indicato nell'immagine a sinistra. Questo risultato è confermato dall'elettroforesi su gel, come mostrato nell'immagine del gel a destra. Dopo 72 ore di trattamento con esonucleasi seguito dalla sintesi di DA da parte della polimerasi phi-29, è ancora possibile identificare milioni di copie di DNA.

Allo stesso modo, dopo 29 ore di trattamento con esonucleasi di 400 nanogrammi di DNA genomico, più altri 100 nanogrammi di DNA plasmidico, la maggior parte del DNA genomico viene digerita. Tuttavia, il DNA plasmidico non viene digerito come indicato dall'immagine del gel. Dopo il trattamento con phi-29 polimerasi del campione trattato con esonucleasi nelle 72 ore, la maggior parte del DNA amplificato appare come plasmidi colorati.

Così abbiamo prima esaminato i geni per il DNA circolare e siamo rimasti davvero sorpresi di trovare diverse centinaia di diversi tipi di campioni di DNA. Sì, è stato davvero sorpreso scoprire quanto siano comuni i cerchi di DNA nella popolazione di lieviti, e crediamo che questo metodo possa essere utilizzato per molti tipi di studi. Ovviamente, uno sarebbe guardare il tessuto umano.

Sappiamo che il gene può essere amplificato su un elemento acircolare e sul lievito, naturalmente, e anche sulle cellule tumorali. Penso che in generale sarà interessante osservare le cellule somatiche e indagare sul tipo di DNA circolare che troveremo lì e su come potremmo avere questo effetto. Notifica. Nelle cellule che invecchiano abbiamo cerchi che si accumulano con l'avanzare dell'età e ci aspettiamo che si trovino più geni sul DNA circolare.

E poi, in aggiunta, vorremmo esaminare i meccanismi molecolari che la circolarizzazione del DNA e la cosa ovvia da fare è guardare al lievito dove abbiamo mutanti che sono difettosi nella ricombinazione omologa e quindi non omologhi Nello studio di questi mutanti ci aspettiamo che la circolarizzazione del DNA abbia un profilo diverso dai diversi tipi di mutanti e speriamo che dagli studi sul lievito saremo in grado di imparare molto di più sulla circolarizzazione del DNA. Quindi, rispetto ad altri metodi, questo metodo è molto più sensibile. Potrebbe essere effettivamente in grado di trovare il cerchio del DNA in circa una su 10.000 cellule.

E per quanto ne so dagli studi del processo fatti a lungo. Gli alleli mutanti devono normalmente raggiungere una proporzione compresa tra l'uno e il 10% della popolazione prima di poter essere rilevati. Esatto, e con questa tecnica non è necessario avere alcuna conoscenza preliminare dei cerchi di DNA formati, a differenza delle tecniche Oppure i cerchi di DNA devono essere in qualche modo legati e quindi si possono facilmente rilevare come amplificazioni mediante sequenziamento o colorazione cromosomica.

Sì, quindi immagino che il vantaggio principale sia la sensibilità e spero che possiamo fare molte cose interessanti con questo metodo.