Purificazione genoma a livello di extrachromosomal circolare DNA dalle cellule eucariotiche

Purificazione su scala genomica di DNA circolare extracromosomico da cellule eucariotiche. Ciao, sono Rasmus. Qui presenterò l'intero schema del metodo per la purificazione del DNA circolare.

Nella prima parte, le cellule di lievito vengono coltivate e raccolte. Successivamente, il DNA circolare viene purificato e amplificato in tre passaggi. Primo, mediante separazione su colonna, in cui i cerchi di DNA vengono purificati ed arricchiti.

Successivamente, mediante il trattamento del DNA con esonucleasi per digerire tutto il DNA lineare rimanente e, infine, tramite l'amplificazione dei cerchi di DNA utilizzando la polimerasi phi-29. Nella quinta parte di questo protocollo, i cerchi di DNA vengono sottoposti a sequenziamento e le letture vengono mappate sul genoma di riferimento di Saccharomyces cerevisiae. Alla fine di questo video, vi mostreremo alcuni risultati rappresentativi.

Discuteremo le prospettive per studi futuri e i vantaggi dell'utilizzo di questo metodo. Parte uno, raccolta delle cellule. La coltura iniziale viene coltivata a 30 gradi con agitazione fino alla densità massima, che è di circa 200 milioni di cellule per millilitro e viene raggiunta dopo 24-48 ore.

La coltura in crescita viene trasferita in un tubo Falcon e pellettata mediante centrifugazione per tre minuti. Il soprannatante viene rimosso. Il pellet grande viene vortexato in tampone TE e ripellettato mediante centrifugazione.

Seconda parte, purificazione con colonna. In questo passaggio, utilizziamo un kit commerciale per la purificazione con colonna che consente di ottenere plasmidi altamente purificati dal DNA genomico batterico. Prima di utilizzare questo kit con lieviti, è necessario rompere la parete cellulare.

Questo viene effettuato risospendendo il pellet cellulare lavato nel tampone L-1 del kit. La sospensione cellulare viene trasferita in una provetta da microcentrifuga e le perle di vetro vengono aggiunte fino a un terzo del volume totale. Il campione viene vortexato alla velocità massima per 10 minuti e le perle vengono rimosse mediante centrifugazione a 2.000 giri al minuto per 30 secondi.

Il soprannatante viene trasferito in un nuovo tubo. In questo metodo aggiungiamo plasmidi altamente diluiti al soprannatante in tre rapporti diversi. Proponiamo di includere il plasmide altamente diluito nel ciclo.

Questi possono fungere da guide di riferimento interne. È possibile utilizzarli per verificare la qualità della purificazione e dell'amplificazione del DNA e, inoltre, effettuare una stima semiquantitativa del numero di DNA non circolari per cellula utilizzando questi plasmidi di spike-in. Si dovrebbero aggiungere solo plasmidi altamente diluiti, poiché potrebbero influenzare la risoluzione di sequenza di altri DNA circolari.

La sospensione cellulare contenente i plasmidi aggiunti viene trattata con la soluzione L-2 del kit e si segue il protocollo del kit. Dopo il caricamento della colonna, proteine, lipidi e DNA cromosomico vengono rimossi lavando la colonna due volte. Il DNA circolare extracromosomico è fortemente arricchito nella frazione eluita.

Parte tre, digestione del DNA lineare. In questo passaggio, utilizziamo un'esonucleasi per digerire il DNA lineare rimanente. Un'esonucleasi dipendente dall'ATP targetizza specificamente il DNA lineare a doppio e a singolo filamento senza digerire il DNA circolare.

La specificità dell'esonucleasi per il DNA lineare è stata confermata mediante elettroforesi su gel dopo 29 ore di trattamento con DNasi. I risultati mostrano che il DNA genomico viene digerito mentre il DNA plasmidico rimane, come indicato dalla freccia rossa. Il lievito contiene 16 cromosomi, lunghi fino a 1.500 chilobasi.

Pertanto, per facilitare la digestione da parte dell'esonucleasi, si utilizza un endonucleasi raro in grado di produrre un numero maggiore di estremità del DNA accessibili. Se si impiega l'enzima di restrizione NotI, ciascun cromosoma viene tagliato fino a sette volte, come indicato. Il DNA purificato mediante colonna viene trattato con NotI a 37 gradi in un blocco riscaldante per tutta la notte.

Dopo l'inattivazione termica di NotI, il DNA tagliato viene trattato con esonucleasi a 37 gradi secondo il protocollo del produttore. Dopo il trattamento con esonucleasi, gli enzimi vengono inattivati termicamente a 70 gradi per 30 minuti. Possono essere necessari diversi giorni per digerire completamente tutto il DNA cromosomico lineare mediante aggiunta di ATP ed esonucleasi. Per assicurarsi che tutto il DNA lineare sia completamente digerito, i campioni vengono analizzati mediante metodi PCR o qPCR utilizzando un gene di riferimento interno come ACTI.

Quarta parte, amplificazione del DNA. In questo passaggio, arricchiamo e amplifichiamo il DNA circolare utilizzando la polimerasi phi-29. La reazione avviene a 30 gradi utilizzando oligonucleotidi esameri casuali e la phi-29.

La polimerasi possiede un'elevata fedeltà e attività di correzione, garantendo un'amplificazione del DNA priva di bias. Ogni polimerasi può, mediante la replicazione circolare a rotolo, sintetizzare fino a 100 chilobasi di DNA. La polimerasi è inoltre altamente processiva, amplificando il DNA fino a 10 alla nona volta.

Parte quinta, sequenziamento. Seguendo il protocollo per una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione ad alto rendimento, il DNA viene sonnicato fino a una dimensione media di 300 paia di basi e sequenziato come letture singole di 141 nucleotidi. Le letture di sequenza vengono mappate sul genoma di riferimento di Saccharomyces cerevisiae utilizzando il database gratuito Galaxy.

I dati sequenziati vengono caricati su Galaxy e le letture vengono mappate utilizzando l'allineatore di brevi letture Bowtie2, che consente il mappaggio di letture parziali. Parte sesta, risultati rappresentativi. Dopo il sequenziamento e il mappaggio sul genoma di riferimento di Saccharomyces cerevisiae, le letture possono essere visualizzate nel browser genomico all'interno del software Galaxy.

Il DNA di origine circolare può, ad esempio, essere conteggiato come regioni che contengono letture coerenti di oltre un chilobase, come indicato sullo schermo. Un esempio di regione sul cromosoma quattro che contiene letture coerenti estese per oltre un chilobase è la regione con i geni del trasportatore di esosi sei e sette. Quando questo metodo viene applicato a una popolazione di cellule di lievito, letture mappate si trovano frequentemente in questo locus e il coverage delle letture suggerisce chiaramente la formazione di un cerchio di DNA tra i geni paraloghi del trasportatore di esosi.

A causa dell'elevata omologia di sequenza tra i geni dei trasportatori di esosi, proponiamo che una ricombinazione omologa illegittima porti alla circolarizzazione di questo DNA. Nel modello di mutazione del DNA circolare, il processo di riparazione del DNA avviene in modo imperfetto. Ad esempio, se si verifica una rottura a doppio filamento in un elemento ripetitivo, la sequenza omologa presente nello stesso cromatidio può essere utilizzata come stampo per la riparazione del DNA mediante ricombinazione omologa.

Dopo la resezione, l'invasione del filamento, la sintesi del DNA e la risoluzione di tutte le giunzioni, un cerchio di DNA può formarsi staccandosi dal genoma, causando una delezione del DNA sul cromosoma. Gli effetti del trattamento del DNA con esonucleasi e polimerasi phi-29 possono essere visualizzati utilizzando la colorazione con ioduro di propidio. I controlli di colorazione del DNA genomico appaiono come nell'immagine a sinistra, mentre il DNA plasmidico appare come nell'immagine a destra.

Dopo 29 ore di trattamento con esonucleasi di 400 nanogrammi di DNA genomico, la maggior parte del DNA è digerita, come indicato nell'immagine a sinistra. Questo risultato è confermato dall'elettroforesi su gel, mostrata nell'immagine del gel a destra. Dopo 72 ore di trattamento con esonucleasi seguito dalla sintesi di DA mediante la polimerasi phi-29, possono ancora essere identificate milioni di copie di DNA.

Allo stesso modo, dopo 29 ore di trattamento con esonucleasi di 400 nanogrammi di DNA genomico, più ulteriori 100 nanogrammi di DNA plasmidico, la maggior parte del DNA genomico viene digerita. Tuttavia, il DNA plasmidico non viene digerito, come indicato dall'immagine del gel. Dopo il trattamento con la polimerasi phi-29 del campione trattato con esonucleasi per 72 ore, la maggior parte del DNA amplificato appare come plasmidi colorati.

Abbiamo quindi esaminato inizialmente i geni alla ricerca di DNA circolare ed è stato davvero sorprendente trovare diverse centinaia di tipi diversi di campioni di DNA. Sì, è stato davvero sorprendente scoprire quanto siano comuni i circoli di DNA nella popolazione di lieviti, e riteniamo che questo metodo possa essere utilizzato per molti tipi di studi. Ovviamente, uno di questi sarebbe l'analisi di tessuti umani.

Sappiamo che un gene può essere amplificato su elementi acircolari e nei lieviti, ovviamente, e persino nelle cellule tumorali. Credo che in generale sarà interessante analizzare le cellule somatiche e indagare quale tipo di DNA circolare troveremo in esse e come potremmo influenzare questo fenomeno. Circolarizzazione. Nelle cellule invecchiate abbiamo cerchi che si accumulano con l'avanzare dell'età e ci aspettiamo che vengano individuati ulteriori geni sul DNA circolare.

E inoltre, desideriamo analizzare i meccanismi molecolari alla base della circolarizzazione del DNA; un approccio ovvio consiste nello studio del lievito, in cui disponiamo di mutanti difettivi nella ricombinazione omologa e nella ricombinazione non omologa. Studiando questi mutanti, ci aspettiamo che il profilo di circolarizzazione del DNA sia diverso a seconda del tipo di mutante; speriamo che da questi studi sul lievito si possa apprendere molto di più sulla circolarizzazione del DNA. Rispetto ad altri metodi, questo è molto più sensibile e potrebbe consentire effettivamente di rilevare il circolo di DNA in circa una cellula su 10.000.

E per quanto ne so da studi basati su prove condotte approfonditamente, gli alleli mutanti devono normalmente raggiungere una proporzione compresa tra l'1 e il 10% della popolazione prima di poter essere rilevati. Giusto, e con questa tecnica non è necessario avere alcuna conoscenza preliminare sui cerchi di DNA formati, a differenza di altre tecniche in cui i cerchi di DNA devono essere in qualche modo legati, per poi poterli rilevare facilmente come amplificazioni mediante sequenziamento o colorazione cromosomica.

Sì, quindi immagino che il vantaggio principale sia la sensibilità e spero che possiamo fare molte cose interessanti con questo metodo.