Preparazione di singole colonie-coorte e trattamento ormonale di lavoratore api per analizzare Fisiologia associati con il ruolo e / o sistema endocrino

L'obiettivo generale di queste procedure è quello di esaminare la fisiologia delle api operaie in associazione con il ruolo dei lavoratori e lo stato del loro sistema endocrino. È un metodo che è stato ampiamente utilizzato per l'analisi del comportamento delle operaie, può anche aiutare a rispondere a domande chiave sulla relazione tra fisiologia e ruolo delle api operaie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente facile da eseguire.

Per creare due colonie a coorte singola, inizia con tre colonie standard e raccogli le api operaie appena emerse da ciascuna delle tre. Usando una pinzetta, ispeziona regolarmente le colonie per l'aspetto del puby nelle cellule periferiche ricoperte con occhi marroni e cuticole pigmentate. Una volta trovata, la maggior parte del puby emergerà nei prossimi giorni.

Quindi spazzolare via gli adulti dai favi e rimuovere i favi dalla colonia. Combina uno di questi favi di ciascuna delle tre colonie in una scatola dell'alveare nucleare vuota. Stabilisci due di queste scatole per alveari e incubale a 33 gradi Celsius con un'umidità relativa di almeno il 60%Nei prossimi tre giorni, raccogli circa 3.000 operaie appena emerse da ogni nuova scatola per alveare.

Per approssimare il numero di api in ogni raccolta, pesare cinque operaie appena emerse selezionate a caso e utilizzare la loro massa media rispetto alla massa delle operaie raccolte per stimare il numero di api. Prepara nuove scatole dell'alveare con un favo carico di miele e polline di una colonia non manipolata e un altro favo vuoto. Successivamente, etichettare i toraci di circa 900 operaie in ogni nuova colonia utilizzando pennarelli per poster a base d'acqua.

Quindi trasferisci la collezione di api operaie in queste nuove scatole dell'alveare e aggiungi una regina. Da sei a otto giorni dopo aver creato le colonie a coorte singola, raccogli alcune delle loro api nutrici e raccoglitrici precoci per l'analisi. Per raccogliere le api nutrici, usa una pinzetta per selezionare le api che mettono la testa nelle celle del favo per prendersi cura della covata.

Raccoglili per il torace. Per raccogliere le bottinatrici, usa una rete per insetti per catturare le operaie che tornano ai loro alveari con carichi di polline sulle zampe posteriori. Per classificare gli HPG delle api, trasferire una collezione di 10-15 api in una gabbia per insetti e anestetizzarle a quattro gradi Celsius per 10-15 minuti fino a quando le api non possono volare o camminare.

Quindi trasferire le api sul ghiaccio per raffreddarle in uno stato completamente anestetizzato dopo circa cinque minuti. Quindi lasciare le api sul ghiaccio fino al momento del bisogno. Ora, seziona le loro teste dai loro corpi con forbici e pinzette.

In una capsula di Petri, fissare le teste nella cera dentale usando spilli per insetti. Per fare ciò, utilizzare due perni inseriti nella base delle antenne. Ora, immergi le teste fisse in soluzione salina per insetti e trasferisci il piatto in uno stereoscopio.

Usando una pinzetta sottile e un bisturi chirurgico, rimuovi la cuticola anteriore dalla testa per accedere alle aree intorno al cervello. Quindi, rimuovere il tessuto tracheale membranoso bianco sotto la cuticola per esporre gli HPG. Quindi seziona gli HPG dalla testa tirandoli fuori lentamente usando una pinzetta.

Classificare gli HPG con aseni grandi e circolari sviluppati e considerarli come provenienti da api nutrici. Classificate gli HPG con aseni piccoli e distorti come rimpiccioliti e considerate che provengano da api bottinatrici. Classifica gli HPG che non corrispondono né sviluppati né rimpiccioliti come intermedi.

Utilizzare gli HPG sviluppati e rimpiccioliti per l'estrazione dell'RNA per confrontare la loro espressione genica. Raccogli le api nutrici dalle colonie tipiche come descritto in precedenza. Anestetizzare le api nutrici a quattro gradi Celsius per circa 30 minuti.

Quindi, usando una pinzetta, immobilizza le api sulla cera dentale su una piastra di Petri. Una volta immobilizzate, iniettare le teste delle api nutrici con un microlitro di soluzione 20E. A tale scopo, utilizzare una micropipetta capillare calibrata.

Collegare il puntale di iniezione a un tubo di gomma e collegare il puntale della micropipetta da 200 microlitri all'estremità opposta del tubo. Quindi, caricare un microlitro di soluzione 20E su un pezzo di parafilm. Quindi utilizzare l'aspirazione della bocca per aspirare la soluzione nella punta di iniezione.

Successivamente, inserire la punta di iniezione nella base delle antenne e iniettare la soluzione espirando sul tubo. In alternativa, utilizzare una macchina a iniezione automatizzata, se disponibile. Allevare le api iniettate in gabbie per insetti a 35 gradi Celsius in condizioni di buio e umidità.

Includi l'acqua di miele per il nutrimento e monitora la sopravvivenza secondo necessità. Raccogli i favi contenenti puby da una colonia e incubali a 35 gradi Celsius con il 60% o più di umidità relativa per un massimo di un giorno. Raccogli le api appena emerse dai favi e applica i segni di vernice sul loro torace usando la vernice per poster.

Quindi riporta queste api alle loro colonie. Dopo sei giorni, raccogli le operaie verniciate dalle colonie e anestetizzale a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Una volta anestetizzate, immobilizzare le api utilizzando una pinzetta e cera dentale come descritto in precedenza.

Quindi applicare da uno a cinque microlitri di metoprene e acetone sulle testine utilizzando una micropipetta resistente all'acetone. Allevare le api in gabbie come descritto in precedenza. Se si osserva un'elevata mortalità, ridurre il volume dell'acetone a un microlitro.

I lavoratori che soddisfano i criteri comportamentali per il comportamento infermieristico o il comportamento di foraggiamento sono stati raccolti da colonie di una singola coorte ed è stato stimato il loro sviluppo di HPG. Sulla base delle estrazioni di HPG RNA e RTPCR quantitativo, l'espressione di MRJP2 è stata arricchita nelle api nutrici e di Hbg3 nelle bottinatrici precoci. Alle operaie selezionate è stato iniettato il 20E e sono state contate le api sopravvissute.

Sette giorni dopo l'iniezione, circa il 60-80% delle api iniettate era vivo. L'iniezione di controllo ha avuto risultati simili. L'analisi quantitativa della RTPCR mostra che l'iniezione di 20E ha diminuito l'espressione di MRJP2 negli HPG.

Lo stesso è accaduto con l'Hbg3 negli HPG. Oltre al 20E, è stato esaminato l'effetto dell'applicazione topica di metoprene sull'espressione di MRJP2 e Hbg3 negli HPG. Dopo l'applicazione topica, la maggior parte delle api è sopravvissuta fino a sette giorni.

L'RNA raccolto da questi sopravvissuti mostra che l'applicazione di metoprene ha inibito l'espressione di MRJP2 e ha migliorato l'espressione di Hbg3. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare colonie di una singola coorte e trattare le api con ormoni per analizzare la fisiologia delle operaie associata ai ruoli e al sistema endocrino. Una volta padroneggiato, il e la classificazione dell'HPG possono essere eseguiti in cinque minuti se eseguiti correttamente.

Mentre si tenta l'iniezione di una soluzione ormonale, è importante ricordare di ridurre al minimo i danni delle api mediante anestesia e iniezione al fine di mantenere in vita le api durante l'allevamento. Non dimenticare che lavorare con le api mellifere può essere pericoloso e che precauzioni come indossare tute e guanti da api dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione della raccolta delle api e la manipolazione delle colonie.