Name: Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Impara la microiniezione di nefrotossine in Danio rerio per modellare il danno renale acuto. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale del danno cellulare e della rigenerazione nel rene.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione DP2OD008470 NIH. Inoltre, la RAM è stato sostenuto in parte da fondi messi a disposizione dalla University of Notre Dame Graduate School. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche, il Centro per la ricerca Zebrafish, e il Centro per le cellule staminali e la medicina rigenerativa presso l&#39;Università di Notre Dame. Ringraziamo in modo particolare i membri del laboratorio per impegnarsi discussioni circa la biologia di rene e il loro utile feedback su questo lavoro.

Le procedure per lavorare con embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l&#39;Università di Notre Dame. 1. preparazione di soluzioni <ol><li> Fare una soluzione 50x magazzino di E3 mezzi dell&#39;embrione mescolando 73,0 g di NaCl, 3,15 g KCl, 9.15 g CaCl 2, e 9,95 g MgSO 4 a 5 L di acqua distillata, e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Per la coltura di embrioni di zebrafish, diluire la soluzione 50x magazzino di E3 mezzi embrione stock ad una soluzione di lavoro 1x con acqua distillata, quindi aggiungere 200 ml di 0,05% blu di metilene per ogni 1 L di 1x E3 di agire come fungicida, e conservare a RT. </li><li> Fare una soluzione pigmentazione blocco di E3 mezzi embrione con 0,003% 1-fenil-2-tiourea (PTU) mediante la combinazione di 40 ml di 50x E3 azione con 0,06 mg PTU. Quindi portare il volume a un totale di 2 L con acqua distillata. </li><li> Mescolare la O E3 / PTU / N a temperatura ambiente per ottenere la polvere PTU in soluzione. Poi memorizzare l&#39;E3 / PTU aRT. Nota: L&#39;E3 / PTU ha una durata di circa una settimana, e le soluzioni più anziani saranno meno efficace nel bloccare lo sviluppo pigmentazione nelle larve zebrafish. </li><li> Effettuare una soluzione anestetica del 0,2% Tricaine (MS-222) aggiungendo 1 g di Tricaine a 500 ml di acqua distillata e regolare il pH a 7,2 con 1 M Tris, pH 9,5. </li><li> Preparare per ottenere una soluzione di metilcellulosa 2% per l&#39;imaging ponendo una soluzione di 1x E3 (senza blu di metilene), con 1/10 volume di 0,2% Tricaine aggiunto a 4 ° C. Nota: La soluzione metilcellulosa è una soluzione di spessore, chiaro che viene utilizzato per stabilizzare delicatamente embrioni vivi per la microscopia. Dopo l&#39;esecuzione manipolazioni gli embrioni possono essere lavati in 1x E3 di sciogliere la metilcellulosa senza ferire l&#39;animale e consentendo la microscopia in fasi successive nello stesso campione. </li><li> Quando raffreddato a 4 ° C, mescolare la soluzione 1x E3 / Tricaine energicamente su un piatto mescolare e aggiungere gradualmente la giusta quantità di metilepolvere di cellulosa, pur continuando a mescolare energicamente. Aggiungere gradualmente la polvere alla soluzione per evitare la formazione di aggregati insolubili metilcellulosa. </li><li> Dopo tutta la polvere viene miscelato nella soluzione di metilcellulosa / E3 / tricaine 2%, mescolare la soluzione composita in C stanza fredda 4 ° O / N. Nota: La temperatura fredda è migliore per sciogliere completamente la polvere. Se la soluzione non è chiara dopo una notte, agitare per una giornata lavorativa supplementare e / o un secondo O / N. </li><li> Per rimuovere le bolle d&#39;aria dalla soluzione / tricaine E3 2% metilcellulosa /, un&#39;aliquota il composto in provette da 1,5 ml e girano ad alta velocità (12.000 xg) a 4 ° C per 30 minuti o fino a 2 ore. </li><li> Mettere la soluzione / E3 / Tricaine metilcellulosa 2% a 4 ° C per una conservazione a lungo termine. Nota: Prima di utilizzo, le aliquote devono essere pre-riscaldato a temperatura ambiente per lavorare con i campioni di zebrafish. </li></ol> 2. Preparazione di strumenti <ol><li> Preparare uno strumento embrione manipolatore, utilizzato per Podi posizionamento a embrioni per la microiniezione, allegando una punta di caricamento del gel sulla punta di un ago da dissezione dritto 5 &quot;, e fissare con nastro adesivo o colla. </li><li> Preparare aghi microiniezione con un estrattore ago, dalla prima immissione un fuoco lucido 10 centimetri in vetro borosilicato con filamento nello strumento e fissare il vetro borosilicato stringendo le maniglie. </li><li> Tirare il vetro borosilicato alla moda aghi fine-conici. Utilizzare le seguenti impostazioni: riscaldare 540, tirare 245, velocità 200, e il tempo 125. </li><li> Luogo aghi all&#39;interno di una capsula di Petri, li sospensione su una striscia di plastilina per proteggere le punte degli aghi, e mantenere il piatto coperto per evitare l&#39;accumulo di polvere. </li><li> Per finire di preparare l&#39;ago per microiniezioni, utilizzare un bordo lama di rasoio o pinza sottile per tagliare l&#39;estremità tirato dell&#39;ago per creare una punta tagliente iniezione angolare con un diametro di circa 0,05-0,1 mm. </li><li> Per rendere il vassoio microiniezione, preparare un 1,5% di agarosio soluzione / E3 in un 100 ml beuta e sciogliere l&#39;agarosio riscaldando il E3 a ebollizione in una microonda indi si lascia raffreddare a temperatura ambiente per circa 10 min. </li><li> Versare la soluzione di agarosio / E3 raffreddato in una capsula Petri di fare una fondazione con una profondità di circa 0,5 CM. Quando questo è solidificato versare un secondo strato con una profondità di circa 0,3 cm ed inserire lo stampo embrione ben prefabbricati e consentire l&#39;agarosio solidificare a temperatura ambiente. Nota: Quando si inserisce lo stampo nello strato / E3 superiore agar, ponendo lo stampo in agar con un angolo di diminuire il numero di bolle d&#39;aria. </li><li> Quando l&#39;intero vassoio microiniezione ha fissato, sollevare l&#39;embrione prefabbricata ben modellare lentamente e accuratamente con un scoopula, quindi riempire il piatto con la soluzione E3 e conservare a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparazione Embrione <ol><li> Impostare serbatoi accoppiamento zebrafish inserendo divisori nelle camere di accoppiamento e riempire con acqua del sistema. </li><li> Posizionare un pesce su ciascun lato del divisore such che ciascuna camera di accoppiamento contiene una femmina e uno di pesce di sesso maschile, e coprire ciascuna camera di accoppiamento. </li><li> La mattina seguente, togliere i divisori per consentire la deposizione delle uova. </li><li> Controllare il pesce dopo circa 30 minuti, e dopo il ritorno gli adulti per l&#39;acquario, raccogliere i loro embrioni facendo passare l&#39;acqua della vasca di accoppiamento attraverso una multa strumento colino rete metallica. </li><li> Invertire il filtro su una capsula di Petri e risciacquare con E3 per raccogliere gli embrioni. </li><li> Incubare gli embrioni a 28,5 ° CO / N. </li><li> Quando embrioni hanno raggiunto la fase 24-26 somite 26, decantare maggior parte dei media E3 e poi dechorionate aggiungendo 100 ml di 50 mg / ml pronase per ogni piatto di embrioni e incubando il piatto a RT (23 ° C) per circa 15 min. Nota: Ci vorranno circa 24-25 ore dal momento della fecondazione per gli embrioni di raggiungere la fase 24-26 somite se sono raccolti nel modo descritto e incubata O / N a 28,5 ° C. </li><li> Riempire il piatto conE3 e poi miscelare delicatamente per rimuovere i chorions dagli embrioni. </li><li> Decantare il E3 / pronasi e sciacquare il piatto con 25 ml di E3 fresco. passo risciacquo Ripetere per rimuovere tutti Pronasi. </li><li> Per bloccare lo sviluppo di pigmentazione, decantare il E3 e sostituire con 25 ml di fresco E3 / PTU quando gli embrioni hanno raggiunto 24 ore dopo la fecondazione. Nota: Per gli esperimenti che abbracciano diversi giorni, sostituire la soluzione E3 / PTU con mezzi freschi una volta al giorno per mantenere il piatto pulito. </li></ol> 4. la microiniezione di soluzione nefrotossina <ol><li> Il giorno dell&#39;iniezione, preparare la soluzione nefrotossina desiderata con il controllo del veicolo appropriato. </li><li> Vortex o mescolare gentilmente per garantire il farmaco (s) è / sono in soluzione, controllando i lati del tubo e superiore della colonna d&#39;acqua. Nota: Le soluzioni nefrotossina possono essere preparati per contenere tracce di fluorescente destrano coniugato a monitorare l&#39;efficienza microiniezione e anche valutare la clearance renale a Collpunti di tempo confluente 20,28. </li><li> Caricare un ago microiniezione rifinito con ~ 2-3 ml di nefrotossina infilando una punta fine caricamento del gel nella parte posteriore dell&#39;ago e di sospendere l&#39;ago verticalmente con un pezzo di nastro per consentire la soluzione per riempire la punta dell&#39;ago rifilato dalla forza di gravità. </li><li> Una volta che la punta dell&#39;ago è pieno, garantire l&#39;ago caricato nel micromanipolatore. </li><li> Testare il volume microiniezione mettendo una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e iniettare nell&#39;olio per valutare la dimensione delle gocce. Un volume di iniezione di 500 pl ha un diametro di 0,1 mm. </li><li> Rimuovere il piatto di embrioni dal termostato, e anestetizzare con l&#39;aggiunta di circa 5 ml di 0,2% Tricaine al piatto dell&#39;embrione. </li><li> Per garantire la completa anestesia, toccare delicatamente embrione con la punta dello strumento dell&#39;embrione manipolatore. La mancanza di movimento indica anestesia sufficiente. </li><li> Dopo anestesia successo, il trasferimento di embrioni allo stampo di iniezione con un trasfER pipetta. </li><li> Manovri ogni embrione in una diversa e dello stampo mettendo la testa nella zona più profonda del pozzo in modo che il tronco appoggia lungo la depressione e la coda sporge dalla depressione. </li><li> Inserire l&#39;ago riempito in micromanipolatore e posizionare la punta dell&#39;ago accanto ad un embrione. </li><li> inserire delicatamente l&#39;ago nel vaso coda spostando il joystick in avanti e premere il pedale del piede per fornire la microiniezione. Nota: iniezione di successo può essere desunta dal guardando il liquido entrare circolazione. Inoltre, co-iniezione della nephrotoxicant con fluorescente destrano coniugato consente al ricercatore di verificare iniezione di successo successivamente alla procedura. </li><li> Delicatamente tirare indietro il joystick per rimuovere l&#39;ago dall&#39;embrione. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, trasferire gli embrioni per un piatto pulito e risciacquare per rimuovere il Tricaine e sostituirlo con fresco E3 / PTU. </li><li> Incubare l&#39;embrione fino al punto desiderato tempo di asinis morfologia, che può essere documentata dalla fotografia in metilcellulosa mezzo di montaggio, o di un processo per l&#39;analisi sperimentale, se lo desideri. Nota: Il recupero di embrioni deve essere valutato per determinare la percentuale di individui con edema, che indica comunemente danno renale. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un svariato numero di agenti terapeutici sono stati associati con AKI 29. Ci sono stati notevoli progressi della ricerca nella comprensione del danno indotto da molti composti individuali, come la gentamicina aminoglicosidi 30 e il cisplatino chemioterapico ampiamente usato 31,32. Alcuni cambiamenti patologici coinvolti in queste condizioni, tuttavia, rimangono oggetto di studio in corso. Una sfida emergente rimane la comprensione di come più farmaci influenzano negativamente i pazienti,...

Aki è una perdita improvvisa della funzione renale che può portare a conseguenze per la salute devastanti 1. AKI è un problema sanitario rilevante in tutto il mondo a causa della sua elevata incidenza di circa il 20% tra i pazienti ospedalizzati, con tassi ancora più elevati di 30-50% nei casi di terapia intensiva e gli anziani, e il tasso di mortalità del 50-70% 1-3. Purtroppo, la prevalenza di AKI è in aumento e si prevede a crescere ulteriormente nel prossimo decennio, in parte a causa della diversità dei fattori che possono indurre AKI, che includono stress post-operatorio, ischemia, e l&#39;esposizione a nefrotossine come antibiotici e farmaci chemioterapici 4. AKI comporta danni cellulari improvvisa all&#39;interno del rene, che si verificano comunemente in nefroni, che sono le unità funzionali essenziali, e sono composti da un filtro del sangue e un tubulo segmentato che drena l&#39;urina in collettori centrali 1. Quando un numero significativo di nefroni sonodanneggiato durante AKI, gli effetti immediati di una interruzione della clearance rifiuti dalla circolazione, e il flusso del fluido ridotta o abolita attraverso nefroni a causa di ostruzione da cellule morte e morenti 1. Nel corso del tempo, l&#39;ostruzione tubolare può portare alla degenerazione di intere nefroni, che riduce in modo permanente la funzione renale 1. Alterazioni fisiologiche nel rene seguenti AKI coinvolgono anche eventi infiammatori complessi che possono portare a cicatrici cronica 1. Nonostante questi risultati, nefroni hanno una certa capacità di subire rigenerazione dopo AKI che ricostituisce il 5,6 tubolare dell&#39;epitelio. Mentre vi è stata una comprensione molecolare crescente di rigenerazione nefrone, i meccanismi rimangono sfuggente in molti aspetti e impongono prosecuzione degli accertamenti 7. La misura in cui AKI si traduce in un danno renale permanente rimane sconosciuta. La ricerca attuale suggerisce il potenziale rigenerativo per il rene è lapiù alto dopo meno gravi casi di AKI, mentre gli episodi più pronunciati o ripetute portano alla malattia renale cronica (CKD) e culminano nella malattia renale allo stadio terminale (ESRD) che richiede il trapianto salva-vita o la dialisi 8,9. Inoltre, gli individui già affetti da insufficienza renale cronica sono ad un ancora più elevato rischio di contrarre una grave episodio di AKI 8,9. Nel loro insieme, è chiaro che ha continuato la ricerca di base e clinica è fondamentale per comprendere, trattare e prevenire AKI. La ricerca con modelli animali è stato determinante per apprezzare la progressione delle alterazioni locali e ambientali che si verificano durante AKI 10. Per espandere questa comprensione e sviluppare nuove terapie, il modello animale zebrafish è stato impiegato in una varietà di modi 11,12. I nefroni del rene zebrafish, sia l&#39;embrione e adulti, mostrano un alto grado di conservazione con i mammiferi 13-16. Inoltre, lesioni epiteliali nefrone in zebrafish assomiglia al processo di vertebrati superiori, per cui la distruzione locale del cellule tubulari è seguita da proliferazione intratubulare e ristabilimento di architettura nefrone 17-19. Nell&#39;embrione, però, ingenti danni tubulo dalle nefrotossine come cisplatino è associata a letalità 20,21. In confronto, gli adulti zebrafish sopravvivono AKI e mostrano capacità rigenerative sostanziali nel rene. Ad esempio, dopo l&#39;esposizione al gentamicina antibiotici aminoglicosidi, zebrafish rigenerare tubulo danno epiteliale e far crescere nuove unità nefrone così 22-24. Mentre questi studi AKI gentamicina indotta hanno fornito preziose informazioni, la comprensione danno renale da diversi nefrotossine rimane fondamentale per apprezzare gli effetti e la risposta a diversi tipi di danni 25. L&#39;embrione zebrafish, a causa della sua dimensione, trasparenza, e trattabilità genetica, ha molti vantaggi per gli studi nefrotossina &lt;sup&gt; 25, in cui il metodo di microiniezione 20,21 viene utilizzato per gestire la molecola (s) per indagini. Nefroni sono formate da 24 ore dopo la fecondazione (HPF) e cominciano a filtrare il sangue di circa il 48 HPF 26,27. Così, la rapida formazione e la funzione del rene embrionale facilita analisi sperimentale. Tuttavia, il processo di microiniezione ha sfide tecniche e non ci può essere una ripida curva di apprendimento per padroneggiare la tecnica. In questo articolo il video, si descrive come eseguire microiniezioni e fornire suggerimenti sulla risoluzione dei problemi al fine di migliorare il tasso di iniezioni di successo.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>American Bioanalytical American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>N-feniltiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato (tricaina)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vetro borosilicato</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Piastre di Petri monouso, sterili, Corning:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;( vassoio per microiniezione) 150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a bassa temperatura</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta per microdissezione</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>Micrometro RS-5010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>2280-24</td><td></td></tr></tbody></table>

nefrotossina microiniezione in zebrafish per creare un modello danno renale acuto

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

I reni sono suscettibili di nuocere dall&#39;esposizione a sostanze chimiche che filtrano dal flusso sanguigno. Questo può portare a lesioni d&#39;organo associata ad un rapido declino della funzione renale e lo sviluppo della sindrome clinica nota come danno renale acuto (AKI). agenti farmacologici usati per trattare le circostanze mediche che vanno da un&#39;infezione batterica al cancro, quando somministrato singolarmente o in combinazione con altri farmaci, possono avviare AKI. Zebrafish sono un modello animale utile per studiare gli effetti chimici sulla funzione renale in vivo, in quanto costituiscono un rene embrionale composto di unità funzionali nefrone che sono conservati con vertebrati superiori, compreso l&#39;uomo. Inoltre, zebrafish può essere utilizzata per eseguire schermi genetici e chimici, che offrono opportunità per chiarire gli aspetti cellulari e molecolari di AKI e sviluppare strategie terapeutiche, come l&#39;identificazione di molecole nefroprotettivo. Qui, dimostriamo come microiniezione nelzebrafish può essere utilizzato come un paradigma per gli studi nefrotossina.

Una stazione di microiniezione istituito comprende uno stereomicroscopio, micromanipolatore e regolatore di pressione (Figura 1A). Transilluminazione della piastra iniezione è preferibile visualizzare campioni durante questa procedura (Figura 1B). Preparazione dell&#39;ago iniezione coinvolge tirando il vetro borosilicato appropriata, seguita preparando il bordo con taglio e back-caricare l&#39;ago fine. In modo ottimale, la punta dell&#39;ago è smussato...

lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare il pesce zebra per osservare l'effetto di nefrotossine come la gentamicina o il cisplatino al fine di modellare un danno renale acuto. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che il modello di pesce zebra permette l'acquisizione in tempo reale di immagini del danno cellulare e della rigenerazione successiva al danno renale acuto. Per iniziare questa procedura, preparare uno strumento per la manipolazione degli embrioni al fine di posizionarli per la microiniezione, fissando un puntale per caricamento gel all'estremità di un ago da dissezione dritto lungo cinque pollici e assicurandolo con nastro adesivo o colla istantanea.Successivamente, preparare alcuni fini aghi microiniettori affusolati tirando i vetri borosilicati lucidati a fuoco con filamento mediante un estrattore di pipette. Quindi, utilizzare un rasoio o il bordo di pinzette fini per tagliare le punte degli aghi, creando punte di iniezione acute e angolari. Successivamente, posizionare gli aghi su una striscia di argilla modellabile all'interno di una piastra di Petri per proteggere le loro punte.Per preparare il vassoio di microiniezione, preparare una soluzione al 1,5% di agarosio in soluzione E3 in un matraccio Erlenmeyer da 100 millilitri, sciogliendo l'agarosio con la soluzione E3 nel microonde. Successivamente, lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente per circa dieci minuti. Versare la soluzione di agarosio E3 raffreddata in una piastra di Petri per ottenere un supporto di spessore pari a circa 0,5 centimetri.Dopo che si &egrave; solidificato, versare uno strato superiore di soluzione di agarosio E3. Quindi, inserire lo stampo prefabbricato per i pozzetti degli embrioni nell'agar, con un angolo tale da evitare la formazione di bolle d'aria, e lasciare solidificare l'agarosio a temperatura ambiente. Una volta che l'intero vassoio per microiniezioni si &egrave; indurito, rimuovere lentamente e con attenzione lo stampo prefabbricato per i pozzetti degli embrioni, quindi riempire la piastra con soluzione E3 e conservare a quattro gradi Celsius.In questo procedimento, preparare i serbatoi per l'accoppiamento dei zebrafish inserendo delle partizioni nelle camere di accoppiamento e riempiendole con acqua del sistema. Successivamente, posizionare un pesce su ciascun lato della partizione, in modo che ogni camera di accoppiamento contenga una femmina e un maschio, quindi coprire entrambe le camere. La mattina seguente, rimuovere le partizioni per consentire la deposizione delle uova.Dopo circa 30 minuti, verificare la presenza di embrioni sul fondo del serbatoio. Successivamente, restituire i pesci all'acquario e raccogliere i loro embrioni facendo passare l'acqua del serbatoio per l'accoppiamento attraverso un setaccio a maglia fine. Poi, capovolgere il setaccio su una piastra di Petri e risciacquarlo con E3 per raccogliere gli embrioni.Successivamente, incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius durante la notte. Quando gli embrioni raggiungono lo stadio di 24-26 somiti, versare via la maggior parte del mezzo E3. Quindi, dechorionarli aggiungendo mezzo E3, seguito da 100 microlitri di pronasi a 50 milligrammi per millilitro per ogni piastra di embrioni, quindi incubare gli embrioni a 28 gradi Celsius per 15 minuti.Dopo 15 minuti, riempire la piastra con E3 e quindi agitare delicatamente per staccare le corioni dagli embrioni. Successivamente, versare con cautela l'E3 contenente la pronasi e risciacquare la piastra con 25 millilitri di E3 fresco. Per bloccare lo sviluppo della pigmentazione, sostituire l'E3 con 25 millilitri di E3 fresco contenente PTU 24 ore dopo la fecondazione. Per esperimenti che si estendono per diversi giorni, sostituire la soluzione di E3 con PTU con mezzo fresco una volta al giorno per mantenere la piastra pulita.Nel giorno dell'iniezione, preparare la soluzione del nefrotossico desiderato con il relativo controllo veicolare. Vortexare o mescolare delicatamente. Successivamente, controllare le pareti del tubo e la parte superiore della colonna d'acqua per assicurarsi che i farmaci siano completamente sciolti nella soluzione.Caricare un ago da microiniezione tagliato con due o tre microlitri di nefrotossina inserendo delicatamente un'accurata punta per caricamento di gel nell’estremità posteriore dell'ago e sospendere l'ago verticalmente con un pezzo di nastro in modo che la soluzione riempia per gravità la punta tagliata dell'ago. Una volta riempita la punta dell'ago, fissare saldamente l'ago caricato nel micromanipolatore. Verificare il volume della microiniezione posizionando una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e iniettando nell'olio per valutare la dimensione della goccia.Successivamente, rimuovere la piastra con gli embrioni dall'incubatrice e anestetizzarli aggiungendo cinque millilitri di tricaina allo 0,2% nella piastra degli embrioni. Trasferire quindi gli embrioni nel mold per iniezioni utilizzando una pipetta di trasferimento. Posizionare ogni embrione in una diversa pozzetta del mold, con la testa nell'area più profonda della pozzetta in modo che il tronco si adagi lungo la depressione e la coda sporga leggermente.Ora, inserire l'ago riempito nel micromanipolatore e posizionare la punta dell'ago accanto a un embrione. Inserire delicatamente l'ago nella vena della coda per la microiniezione. Il passaggio più critico della procedura è la microiniezione.Per garantire il successo, l'ago deve essere tagliato con un angolo acuto e deve essere posizionato con attenzione accanto all'embrione. Se l'iniezione ha successo, si dovrebbe vedere il liquido entrare in circolo. La co-iniezione del nefrotossico con destrina marcate con fluorescenza permetterebbe al ricercatore di verificare l'avvenuta iniezione al termine della procedura.Successivamente, rimuovere delicatamente l'ago dall'embrione. Trasferire l'embrione in una piastra pulita e risciacquare per eliminare la tricaina con E3 PTU fresco. Quindi, incubare l'embrione fino al tempo desiderato per valutare la morfologia, che può essere documentata mediante fotografie in un mezzo di montaggio a base di metilcellulosa.O procedere all'analisi sperimentale come desiderato. Si noti che il recupero degli embrioni dovrebbe essere valutato ogni 12-24 ore dopo l'iniezione per determinare la percentuale di individui con edema, che comunemente indica un danno renale. La trasparenza dell'embrione di pesce zebra facilita la procedura di microiniezione e può essere ulteriormente migliorata mediante trattamento chimico con PTU a 24 hpf, al fine di ridurre lo sviluppo della pigmentazione durante un tipico periodo sperimentale.Qui, i campioni di embrioni sono stati lasciati sviluppare fino alla fase delle 72 hpf, quindi sono stati sottoposti a iniezione fittizia, microiniezione con soluzione salina o microiniezione con gentamicina a 2,5 milligrammi per millilitro. Successive osservazioni in vivo sono state effettuate a uno e due giorni dall'iniezione, utilizzando un microscopio stereo con illuminazione tramite transilluminazione. Rispetto agli embrioni sottoposti a iniezione fittizia o con soluzione salina, solo gli individui iniettati con gentamicina hanno mostrato lo sviluppo di edema.In questo caso, l'edema pericardico suggerisce un'abrogazione della normale funzionalità renale, in linea con osservazioni precedentemente pubblicate. Successivamente a questa procedura, altri metodi come l'ibridazione C2 su preparati interi possono essere eseguiti per valutare i cambiamenti nell'espressione genica dopo l'esposizione a nefrotossine.

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Biologia

Descriviamo una tecnica di microinjecting l'aminoglicoside, gentamicina, in 2 giorni dopo fetilization (DPF) larve di zebrafish per indurre danno renale acuto (AKI). Abbiamo anche descritto un metodo per intero immunoistochimica montaggio, plastica embedding e sezionamento delle larve di zebrafish per visualizzare il danno mediato AKI.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

Danno renale acuto (AKI) negli esseri umani è un problema comune clinico causato da un danno alle cellule epiteliali che costituiscono nefroni renali e AKI è associata ad elevati tassi di mortalità del 50-70% 1. A seguito di distruzione delle cellule epiteliali, nefroni hanno una limitata capacità di rigenerarsi, anche se i meccanismi e le limitazioni che guidano questo fenomeno sono ancora poco compresi. In questo articolo video, descriviamo la nostra tecnica di ablazione laser mirato delle...

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Questo video dimostra la microiniezione endovenosa di nefrotossine nella vena caudale di un embrione di zebrafish per studiare i loro effetti chimici sulla funzione renale.

Microiniezione endovenosa di nefrotossine nell'embrione di zebrafish: una tecnica per rilasciare agenti nefrotossici nel flusso sanguigno dell'embrione di zebrafish

Il rene adulto zebrafish è un sistema eccellente per gli studi di rigenerazione e malattie renali. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive le diverse metodologie che possono essere implementate per valutare la composizione nefrone tubulo e per valutare il riassorbimento renale.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

Qui presentiamo un metodo affidabile per studiare la rigenerazione renale adulta inducendo un danno renale acuto mediante iniezione di gentamicina. Dimostriamo che il danno dipende dal dosaggio di gentamicina e dalla temperatura ambientale utilizzando l'ibridazione in situ per marcare lhx1a+ sviluppando nuovi nefroni.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

Questo lavoro presenta un nuovo modello in vivo di lesioni segmentali del rene utilizzando gengive transgenici GFP reni. Il modello permette l'induzione dell'ablazione mirata delle cellule epiteliali del rene per mostrare i meccanismi cellulari di lesioni nefroniche e di riparazione.

Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

Questo protocollo descrive le procedure per indurre la lesione renale acuta (AKI) nel pesce zebra adulto usando il cisplatino come agente nefrotossico. Abbiamo dettagliato i passaggi per valutare la riproducibilità della tecnica e due tecniche per analizzare l'infiammazione e la morte cellulare nel tessuto renale, citometria del flusso e TUNEL, rispettivamente.

Modello di lesione renale acuta indotto dal cisplatino nel pesce zebra adulto

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l'introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l'esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Questo video mostra come morfolino o mRNA possono essere iniettati in embrioni di pesce zebra alla unicellulare stadio per diminuire o aumentare il livello di prodotti specifico gene durante lo sviluppo successivo.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

Impara la microiniezione di nefrotossine in Danio rerio per modellare il danno renale acuto. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale del danno cellulare e della rigenerazione nel rene.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

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