Caratterizzazione funzionale dei macrofagi regolatori che inibiscono l'immunità reattiva dell'inferta

L'obiettivo generale di questa procedura in vitro è quello di caratterizzare fenotipicamente e funzionalmente popolazioni di macrofagi isolate da cuori allotrapiantati in un modello di trapianto di massa. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nell'immunità che troviamo su come migliorare il successo nella sopravvivenza e nella tolleranza degli allografi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio di come uno specifico sottogruppo di microfagi isolati con allografo cardiaco infiltrato in tessuto modula la risposta dei tessuti dell'ospite.

Dopo aver generato una sospensione unicellulare dall'allotrapianto, bloccare qualsiasi legame non specifico sulle cellule mieloidi con uno o due microlitri di anticorpo monoclonale bloccante il recettore FC per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, colorare le cellule con gli appropriati anticorpi di superficie cellulare mieloide coniugati a fluorescenza per 45 minuti a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce. Quindi lavare le celle due volte in terreno RPMI mediante centrifugazione.

E risospendere il pellet in blu tripano per il conteggio. Quindi, diluire le cellule a una concentrazione di 10-6 cellule per millilitro in terreno fresco. E filtra le cellule attraverso un colino da 70 micron in un tubo a fondo tondo da cinque millilitri.

Poco prima della selezione, colorare le cellule con DAPI come marcatore di vitalità e impostare il citometro a flusso sui parametri di selezione dei macrofagi appropriati. Posizionare provette coniche da cinque millilitri contenenti un millilitro di terreno RPMI per raccogliere le cellule selezionate e caricare la provetta del campione sul citometro. Nel software del citometro a flusso, selezionare un esperimento vuoto con un pannello vuoto e impostare un diagramma a punti di dispersione in avanti rispetto a quello laterale.

Gate sui leucociti, esclusi i detriti cellulari e i grumi con la dispersione più bassa in avanti e lateralmente. Da questo gate padre, creare un nuovo grafico a punti che visualizzi la dispersione laterale rispetto a DAPI e il gate sulle celle negative DAPI. Su questa popolazione appena gated , creare un dot plot che mostri CD11b rispetto a CD45 e gate sui macrofagi e neutrofili doppi positivi CD11b CD45.

Quindi crea un grafico a punti finale che mostra Ly6C rispetto a Ly6G per consentire il gating della popolazione desiderabile e ordinare le celle. Al termine della cernita, confermare la purezza e la vitalità dei campioni. Raccogliere le celle selezionate mediante centrifugazione e risospendere il pellet per il conteggio in terreno RPMI fresco.

Diluire le popolazioni di macrofagi alla concentrazione appropriata per la semina cinque volte da 10 al quarto macrofagi per 100 microlitri di terreno completo per pozzetto, in una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti. Quindi posizionare le cellule in un incubatore per colture cellulari per almeno 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Per isolare la T, metti il mouse knock-in in posizione supina.

Per prima cosa praticare un'incisione cutanea sulla linea mediana, tagliando accuratamente il peritoneo e allargando delicatamente la pelle. Raccogli i linfonodi periferici e la milza e posiziona i tessuti in un filtro da 100 micrometri sopra un tubo conico da 50 millilitri. Utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 millilitro, premere delicatamente i tessuti linfoidi attraverso il filtro e sciacquare il filtro con un terreno RPMI fresco fino a quando la rete non è pulita.

Raccogliere la sospensione a cella singola mediante centrifugazione e ri-soppiantare il pellet in due millilitri di tampone di lisi ACK. Dopo cinque minuti a quattro gradi Celsius, neutralizzare il tampone di lisi con due millilitri di terreno RPMI fresco e centrifugare le cellule. Risospendere il pellet in 200 microlitri di terreno fresco e trasferire le cellule in un tubo a fondo tondo da cinque millilitri per filtrare con gli anticorpi appropriati per la colorazione superficiale delle cellule T.

Dopo 45 minuti a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce, lavare le celle due volte in terreno RPMI fresco e contare le celle per esclusione del blu di tripano. Successivamente, diluire le cellule colorate con CD8 a una volta 10 per la sesta di cellule per millilitro in CFSE per cinque minuti in un bagno d'acqua a 20 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, neutralizzare il CFSE con due millilitri di terreno RPMI e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Risospendere le cellule in una volta da 10 a 10 cellule T colorate con CD8 per millilitro di concentrazione media RPMI e filtrare tutti i campioni cellulari attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in provette a fondo tondo da cinque millilitri. Quindi etichettare le cellule con DAPI e preparare il citometro a flusso per lo smistamento come appena dimostrato. Per l'isolamento delle cellule T CD4 positive, impostare un dot plot a dispersione diretta rispetto a quello laterale per il gating sui linfociti, escludendo i detriti e le grandi cellule mieloidi granulari.

Da questo gate padre, creare un dot plot che visualizzi la dispersione laterale rispetto a DAPI e il gate sulle celle negative DAPI. Su questa popolazione appena controllata, creare un dot plot che mostri la dispersione laterale rispetto a CD4 e un dot plot che mostri CD8 rispetto a CFSE. Quindi ordina le popolazioni di cellule T gated.

Al termine della cernita, confermare la purezza e la vitalità dei campioni e raccogliere le cellule mediante centrifugazione per il conteggio. Diluire le cellule a due volte 10-al sesto di cellule T per millilitro di concentrazione di RPMI e 100 microlitri di cellule T in terreno RPMI completo in ciascun pozzetto di macrofagi per una co-coltura di 96 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Infine, aggiungi cinque microlitri di microlitri di microsfere magnetiche CD3 CD28 per attivare ed espandere le cellule T.

I macrafagi Ly6G-macragi ottenuti da riceventi tollerati esercitano un effetto soppressivo sulle cellule T CD8 positive, con una modesta attività soppressiva osservata anche dalle cellule Ly6C intermedie Ly6CG positive. Tuttavia, solo le cellule Ly6Clo Ly6G promuovono l'espansione in vitro di Foxp3 positivo per CD4 positivo. Insieme, questi dati supportano la conclusione che i macrofagi Ly6Clo Ly6G negativi infiltranti CD11B infiltranti l'innesto possiedono molte delle proprietà riportate per essere associate alle cellule soppressori derivate dai monociti, inclusa la loro capacità di inibire la proliferazione delle cellule T CD8 e di promuovere l'espansione di Foxp3 TReg CD4 positivo.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere la purezza al fine di stabilire dati conclusivi sulla capacità soppressiva di ciascun sottogruppo di macrofagi. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'utilizzo di cancelli di arricchimento commerciali possono essere utilizzati per isolare diverse popolazioni di leucociti di interesse. Lo smistamento dei macrofagi è la parte più lunga di questa procedura, ma una volta padroneggiata, questa parte della tecnica può essere completata in otto ore se eseguita correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la capacità soppressiva dei macrofagi infiltranti nel modello di simulazione di trapianto di organi solidi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare diverse popolazioni di macrofagi in un allogramma del cuore di topo selezionato.