Utilizzo di una batteria di chimici ed ecotossicologici metodi per la valutazione dell'efficacia dei processi di trattamento delle acque reflue per rimuovere estrogenica Potenza

L'obiettivo generale della batteria di test qui delineati, tra cui la chimica analitica e i metodi in vitro e in vivo, è determinare l'efficacia delle tecnologie emergenti e nuove di trattamento delle acque reflue, per rimuovere i contaminanti estrogenici. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nell'ingegneria ambientale, ad esempio, quando si selezionano i processi di trattamento delle acque reflue più efficaci in una potenza estrogenica mobile delle acque reflue. Il vantaggio principale di queste tecniche, è che sono sensibili a concentrazioni molto basse di composti attivi, evidenziando così, le migliori tecnologie per proteggere la vita acquatica.

A dimostrare le procedure saranno il borsista post-dottorato, il dottor Chris Green, la studentessa laureata, Angela Pinzon, la ricercatrice, la dottoressa Alice Baynes, e il tecnico di ricerca senior, Nicola Beresford. Il processo SPE richiede una grande attenzione alla pulizia e all'ordine per prevenire la contaminazione del campione. Pre-pulire tutti i tubi, i rubinetti e le fritte con metanolo.

Prima di eseguire i campioni, collegare le linee di trasferimento al collettore di estrazione e sciacquare l'intero sistema con acqua deionizzata. Per eseguire i campioni, collegare prima le camicie delle valvole monouso, quindi collegare le cartucce SPE in stirene divinilbenzene. Quindi, pipettare cinque millilitri di acetato di etile in ciascun serbatoio per condizionare le cartucce.

Durante questa fase, assicurarsi che la SPE sia sigillata. Quindi, accendere la pompa del vuoto per una portata di 10 millimetri al minuto. Prima che le cartucce si asciughino, caricare cinque millilitri di metanolo, seguiti da cinque millilitri di acqua.

È molto importante che le cartucce SPE non si secchino. Dopo che l'acqua è quasi passata, spegnere la pompa e rabboccare d'acqua ogni serbatoio della cartuccia. Quindi, collegare i tubi in PTFE da 1/8 di pollice tra i serbatoi della cartuccia e i flaconi dei campioni in vetro.

A questo punto, impostare il vuoto su una portata inferiore a 10 millilitri al minuto e lasciare che l'intero campione passi attraverso la cartuccia. Quindi, asciugare accuratamente le cartucce SPE, fino a quando il contenuto della cartuccia non cambia colore. Utilizzare un vuoto o un flusso di gas.

A questo punto, caricare le fiale di raccolta in vetro da 10 millilitri pulite e asciutte in un rack e posizionare il rack all'interno del collettore di estrazione. Controllare che ogni rivestimento sia sopra una fiala. Caricare i serbatoi dei campioni con due volte quattro millilitri, per un totale di otto millilitri di diclorometano, accendere la pompa del vuoto e lasciare che il liquido passi attraverso l'SPE e nelle fiale di raccolta.

Quindi, utilizzare un concentratore per ridurre il volume di tutte le fiale di raccolta a un millilitro. Trasferire ogni campione in una fiala dell'autocampionatore e concentrarlo ulteriormente fino a 100 microlitri, utilizzando un'apparecchiatura di spurgo dell'azoto. La fase successiva del processo consiste nell'utilizzare la GPC per rimuovere le interferenze macromolecolari.

Innanzitutto, iniettare 95 microlitri dell'estratto del campione eluso, nell'HPLC dotato di GPC. Concentrare l'estratto di GPC fino a 200 microlitri, utilizzando un concentratore e l'apparecchio di spurgo dell'azoto, quindi riempirlo fino a due millilitri con esano. Quindi, collegare i rivestimenti delle valvole monouso, le cartucce di ammino viola e i serbatoi delle cartucce al collettore SPE e attraverso le fiale di raccolta in vetro da 10 millilitri.

Ora, caricare due millilitri di esano in ogni cartuccia, per condizionarli e scartare il solvente. Quindi, caricare l'estratto del campione GPC nel serbatoio e aspirarlo. Mettere da parte la raccolta dell'estratto e riposizionare la fiala nel cestello per raccogliere il lavaggio.

Quindi, passare due millilitri di acetato di etile ed esano al 30% in volume attraverso la cartuccia. Quindi, aggiungere altri due millilitri di acetato di etile ed esano, quindi scartare le raccolte di soluzione di lavaggio e rimettere la fiala di raccolta da 10 millilitri nel rack. Ora, aggiungi due millilitri di acetato di etile e acetone al 50% in volume in volume e avvia la pompa a una portata bassa, inferiore a due millilitri al minuto.

Dopo che il liquido è passato, aggiungi altri due millilitri di acetato di etile al 50% al serbatoio. Ora, usa un concentratore per ridurre il volume dell'estratto a un millilitro. Quindi, trasferire il campione in una fiala di vetro più piccola e utilizzare un'attrezzatura di spurgo con azoto per far evaporare l'estratto fino a farlo incipiente per aggiungere 100 microlitri di metanolo, mescolare bene il campione e trasferirlo in una fiala per autocampionatore con un inserto da 0,3 millilitri.

Quindi, eseguire l'analisi LC-MS/MS dell'estratto. Il giorno prima di iniziare il test, preparare un terreno di coltura fresco e inoculare con il tenax dock del ceppo HER usato. Il giorno seguente, prepararsi per il saggio, effettuando deliri seriali da 100 microlitri delle sostanze chimiche in esame o degli estratti degli effluenti, quindi la curva standard E2 in etanolo.

A questo punto, trasferire 10 aliquote da microlitro in una piastra sterile da 96 pozzetti etichettata. Quindi, lasciare la piastra scoperta per far evaporare l'etanolo. Quindi, preparare 50 millilitri di terreno di crescita, con 0,5 millilitri di soluzione CPRG.

Dalla coltura del lievito delle 24 ore, misurare la torbidità a 620 nanometri per stimare la densità cellulare. Quindi, aggiungere 40 milioni di cellule di lievito ai 50 millilitri di terreno di analisi. Trasferire il terreno di coltura inoculato in una vasca sterile e utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 200 microlitri di terreno in ciascun pozzetto della piastra di analisi.

Riposizionare il coperchio della piastra di analisi, sigillare i bordi con del nastro adesivo e agitare energicamente la piastra di analisi per due minuti utilizzando uno shaker per piastre. Quindi, incubare la piastra a 32 gradi Celsius, in una camera riscaldante ventilata naturalmente. Dopo tre giorni di incubazione, ripetere nuovamente il frullato, quindi lasciare riposare il lievito per circa un'ora.

Infine, misurare gli assorbenti di luce dai campioni, a 540 e 620 nanometri. I campioni d'acqua provenienti da un piano convenzionale di trattamento delle acque reflue per attivare il processo dei fanghi, sono stati analizzati utilizzando LCMS elettrospray a ioni negativi, l'etinilestradiolo era presente a una concentrazione superiore al livello previsto senza effetto. Utilizzando un trattamento avanzato dell'acqua, come il carbone attivo granulato o GAC, è stato possibile ridurre sostanzialmente i livelli di etinilestradiolo.

Tutti gli estratti di acque reflue sono stati analizzati con uno standard interno marcato isotopicamente, picco rosso, per consentire la quantificazione. Il test di screening da lievito a estrogeni era chiaramente sensibile all'estradiolo standard, ma non ha scelto alcuna risposta all'etanolo, che è essenzialmente il bianco. Le cellule di screening del lievito erano chiaramente sensibili all'effluente del processo a fanghi attivi, mentre l'effluente trattato con GAC produceva una risposta ridotta, era ancora biologicamente più attivo del bianco.

Utilizzando questa nuova tecnologia di trattamento delle acque reflue, sia la concentrazione di etanolo estradiolo, mostrata in blu, che l'attività estrogenica, mostrata in verde, sono state significativamente ridotte dal trattamento combinato con perossido di idrogeno e TAML. Gli impianti di trattamento delle acque reflue sono la principale fonte di contaminazione delle acque superficiali con sostanze estrogeniche. Nuovi modi per i processi di trattamento delle acque per migliorare questi effluenti richiedono test approfonditi dell'attività estrogenica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di una batteria di test chimici ed ecotossicologici, necessari per misurare l'attività estrogenica nei campioni d'acqua. È estremamente importante assicurarsi che la contaminazione dei campioni e degli estratti sia ridotta al minimo con un'attenta manipolazione dei campioni e degli estratti. Ad esempio, le plastiche di uso comune contengono composti estrogenici, quindi è fondamentale prevedere controlli negativi per verificare la presenza di contaminazioni chimiche, e controlli positivi per verificare che il metodo di estrazione abbia funzionato e che ci sia un buon recupero degli estrogeni addizionati.