Utilizzo di una batteria di chimici ed ecotossicologici metodi per la valutazione dell'efficacia dei processi di trattamento delle acque reflue per rimuovere estrogenica Potenza

L'obiettivo generale della serie di test descritti in questo articolo, comprese le metodiche di chimica analitica e metodi in vitro e in vivo, è determinare l'efficacia delle tecnologie emergenti e innovative per il trattamento delle acque reflue nel rimuovere contaminanti estrogenici. Queste metodiche possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'ingegneria ambientale, ad esempio nella selezione dei processi di trattamento delle acque reflue più efficaci in relazione alla variabilità della potenza estrogenica delle acque reflue. Il principale vantaggio di queste tecniche è che sono sensibili a concentrazioni molto basse di composti attivi, evidenziando così le migliori tecnologie per la protezione della vita acquatica.

Le procedure saranno dimostrate dal ricercatore postdottorato, dott. Chris Green, dalla studentessa laureanda, Angela Pinzon, dalla ricercatrice, dott.ssa Alice Baynes, e dalla tecnica senior di ricerca, Nicola Beresford. Il processo di SPE richiede una rigorosa attenzione alla pulizia e all'ordine al fine di prevenire la contaminazione dei campioni. Pulire preventivamente tutte le provette, i rubinetti e i fritti con metanolo.

Prima di analizzare i campioni, collegare i tubi di trasferimento al collettore di estrazione e risciacquare l'intero sistema con acqua deionizzata. Per analizzare i campioni, collegare innanzitutto i foderi monouso per valvola, quindi collegare le cartucce SPE in stirene-divinilbenzene. Successivamente, pipettare cinque millilitri di acetato di etile in ciascun serbatoio per condizionare le cartucce.

Durante questo passaggio, assicurarsi che l'SPE sia sigillato. Quindi, accendere la pompa a vuoto per ottenere una portata di 10 millimetri al minuto. Prima che le cartucce si asciughino, aggiungere cinque millilitri di metanolo, seguiti da cinque millilitri di acqua.

È molto importante che le cartucce per estrazione in fase solida non si secchino. Dopo che l'acqua è stata in gran parte aspirata, spegnere la pompa e riempire nuovamente ogni serbatoio della cartuccia con acqua. Successivamente, collegare tubi in PTFE da 1/8 di pollice tra i serbatoi delle cartucce e i flaconi in vetro per il campione.

Ora, regolare il vuoto su una portata inferiore a 10 millilitri al minuto e lasciare che l'intero campione passi attraverso la cartuccia. Successivamente, asciugare completamente le cartucce di estrazione in fase solida finché il contenuto della cartuccia non cambia colore. Utilizzare un vuoto o un flusso di gas.

Ora, caricare fiale di raccolta in vetro pulite e asciutte da 10 millilitri su un portaprovette e posizionare il portaprovette all'interno del manifold di estrazione. Verificare che ogni inserto sia posizionato sopra una fiala. Riempire i serbatoi del campione con due volte quattro millilitri, per un totale di otto millilitri di diclorometano, accendere la pompa del vuoto e lasciare che il liquido passi attraverso la SPE e vada a finire nelle fiale di raccolta.

Quindi, utilizzare un concentratore per ridurre il volume in tutti i vial di raccolta a un millilitro. Trasferire ogni campione in un vial per autosampler e concentrarlo ulteriormente fino a 100 microlitri, utilizzando un apparecchio a flusso di azoto. La fase successiva del processo consiste nell'utilizzare la cromatografia su gel per rimuovere le interferenze macromolecolari.

Per prima cosa, iniettare 95 microlitri dell'estratto del campione eluito nell'HPLC dotato di GPC. Concentrare l'estratto GPC fino a 200 microlitri, utilizzando un concentratore e l'apparato per l'evaporazione con flusso di azoto, quindi portare a due millilitri con esano. Successivamente, montare sul manifold per SPE i liner monouso, le cartucce amino purple e i serbatoi per cartucce, nonché i viali di raccolta in vetro da 10 millilitri.

Ora, aggiungere due millilitri di esaano in ciascuna cartuccia per condizionarle e scartare il solvente. Successivamente, caricare l'estratto del campione GPC nel serbatoio ed aspirarlo attraverso. Mettere da parte la raccolta dell'estratto e sostituire la provetta nel portaprovette per raccogliere il lavaggio.

Successivamente, fai passare due millilitri di acetato di etile e esano al 30 percento in volume attraverso la cartuccia. Poi, aggiungi altri due millilitri di acetato di etile e esano, quindi scarta le raccolte della soluzione di lavaggio e riposiziona la provetta da raccolta da 10 millilitri nel supporto. Ora, aggiungi due millilitri di acetato di etile e acetone al 50 percento in volume nel serbatoio e avvia la pompa a un flusso basso, inferiore a due millilitri al minuto.

Dopo che il liquido è passato, aggiungere altri due millilitri di acetato di etile al 50 percento al serbatoio. Utilizzare ora un concentratore per ridurre il volume dell'estratto a un millilitro. Successivamente, trasferire il campione in una provetta di vetro più piccola ed evaporare l'estratto fino a incipiente seccatura mediante apparecchiatura per evaporazione con azoto. Aggiungere 100 microlitri di metanolo, mescolare accuratamente il campione e trasferirlo in una provetta per autosampler con inserto da 0,3 millilitri.

Quindi, eseguire l'analisi LC-MS/MS dell'estratto. Il giorno precedente l'inizio del saggio, preparare un mezzo di crescita fresco e inocularlo con il ceppo di HER conservato su tenax. Il giorno successivo, prepararsi per il saggio effettuando diluizioni seriali di 100 microlitri delle sostanze chimiche in esame o degli estratti di effluente, e successivamente la curva standard di E2 in etanolo.

Ora, trasferire aliquote di 10 microlitri in una piastra sterile da 96 pozzetti etichettata. Successivamente, lasciare la piastra scoperta per far evaporare l'etanolo. Poi, preparare 50 millilitri di mezzo di crescita, aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione CPRG.

Dal coltura di lieviti di 24 ore, misurare la torbidezza a 620 nanometri per stimare la densità cellulare. Successivamente, aggiungere 40 milioni di cellule di lievito ai 50 millilitri di mezzo saggio. Trasferire il mezzo saggio inoculato in una vaschetta sterile ed utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 200 microlitri di mezzo in ciascun pozzetto della piastra saggio.

Sostituire il coperchio della piastra del saggio, sigillare i bordi con del nastro e agitare vigorosamente la piastra per due minuti utilizzando uno shaker per piastre. Successivamente, incubare la piastra a 32 gradi Celsius in un armadio riscaldante con ventilazione naturale. Dopo tre giorni di incubazione, ripetere l'agitazione, quindi lasciare sedimentare il lievito per circa un'ora.

Infine, misurare l'assorbanza luminosa dei campioni a 540 e 620 nanometri. Campioni d'acqua provenienti da un impianto convenzionale di trattamento delle acque reflue per attivare il processo di fanghi attivi sono stati analizzati mediante LCMS con elettrospray a ioni negativi: l'etinilestradiolo era presente a una concentrazione superiore al livello predetto di assenza di effetti. Utilizzando trattamenti avanzati delle acque, come il carbonio attivo granulare, o GAC, è stato possibile ridurre sostanzialmente i livelli di etinilestradiolo.

Tutti gli estratti di acque reflue sono stati analizzati utilizzando uno standard interno marcato isotopicamente, picco rosso, per consentire la quantificazione. Il saggio di screening lievito-estrogeni è risultato chiaramente sensibile all'estradiolo standard, ma non ha mostrato alcuna risposta all'etanolo, che sostanzialmente rappresenta il bianco. Le cellule del test di screening con lievito hanno risposto in modo evidente all'effluente del processo di fanghi attivi, mentre l'effluente trattato con carbone attivo granulare (GAC) ha prodotto una risposta ridotta, sebbene fosse comunque più attivo dal punto di vista biologico rispetto al bianco.

Utilizzando questa nuova tecnologia di trattamento delle acque reflue, sia la concentrazione di etinilestradiolo, mostrata in blu, sia l'attività estrogenica, mostrata in verde, sono state significativamente ridotte dal trattamento combinato con perossido di idrogeno e TAML. Gli impianti di trattamento delle acque reflue rappresentano la principale fonte di contaminazione delle acque superficiali con sostanze estrogeniche. Nuovi approcci per migliorare i processi di trattamento dell'acqua richiedono test approfonditi dell'attività estrogenica.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di una serie di test chimici ed ecotossicologici necessari per misurare l'attività estrogenica in campioni d'acqua. È estremamente importante assicurarsi che la contaminazione dei campioni ed estratti sia ridotta al minimo mediante un'accurata manipolazione di campioni ed estratti. Ad esempio, le plastiche comunemente utilizzate contengono composti estrogenici; pertanto, è essenziale includere controlli negativi per verificare la contaminazione chimica e controlli positivi per accertare che il metodo di estrazione abbia funzionato e che vi sia un buon recupero degli estrogeni aggiunti artificialmente.