Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare la disponibilità di monociti e ridurre al minimo la variabilità nelle densità cellulari ottenute durante la differenziazione indotta da MCSF di monociti umani del sangue in macrofagi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla biologia dei macrofagi umani. Il principale vantaggio di questa strategia è che colture di macrofagi derivati da monociti umani possono essere facilmente ottenute riducendo la dipendenza dalla disponibilità di donatori.

Inoltre, la densità desiderata di cellule macrofagiche e colture omogenee possono essere ottenute in modo costante. Per iniziare questa procedura, ottenere le cellule mononucleate mediante leucaferesi da donatori umani e quindi arricchire i monociti mediante elutriazione centrifuga a controflusso continuo delle cellule mononucleate. Successivamente, contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Successivamente, centrifugare i monociti in un tubo in polipropilene da 15 millilitri per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere il soprannatante e risospendere delicatamente le cellule in FBS seguito da Dimetilsulfossido per ottenere una concentrazione finale di 90%FBS, 10%Dimetilsulfossido e 50 × 10⁶ cellule per millilitro. Successivamente, aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a un singolo criotubo.

Posizionare i criotubi in un contenitore per congelamento cellulare e trasferirlo nel congelatore a meno 80 gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire il contenitore in un serbatoio di azoto liquido per criotubi per la conservazione a lungo termine. In questo passaggio, scongelare un criotubo di cellule mantenendolo brevemente in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Quando la sospensione cellulare si è scongelata per circa il 70%, rimuoverla immediatamente dal bagno a temperatura ambiente e trasferirla a temperatura ambiente. Dopo che la sospensione cellulare si è completamente scongelata, trasferire un millilitro del contenuto del cryofile in 50 millilitri di mezzo RPMI 1640 contenente L-glutammina 2 millimolare, M-CSF 50 nanogrammi per millilitro, IL-10 25 nanogrammi per millilitro e FBS 10% a 37 gradi Celsius. Successivamente, trasferire 25 millilitri di sospensione di monociti in due fiasche di coltura cellulare in plastica da 75 centimetri quadrati.

Incubare le colture a 37 gradi Celsius per 48 ore. Ricordare di non cambiare il mezzo prima delle 48 ore; altrimenti, le cellule non si attaccheranno correttamente e verranno rimosse con il lavaggio. Dopo 48 ore, lavare le colture tre volte con 10 millilitri di mezzo RPMI 1640 preriscaldato.

Rimuovere delicatamente il mezzo di coltura per evitare di staccare le cellule debolmente aderenti. Successivamente, aggiungere mezzo completo e coltivare le cellule per una settimana. Cambiare il mezzo ogni due giorni fino a quando i monociti si differenziano e proliferano in modo efficiente, raggiungendo la confluenza.

Ora, risciacquare i macrofagi differenziati nel fiasco tre volte con 10 millilitri di DPBS a 37 gradi Celsius senza calcio e magnesio. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di soluzione di tripsina 0,25% EDTA a 37 gradi Celsius. Successivamente, collocare il fiasco in un incubatore per colture cellulari per 10-15 minuti.

In seguito, circa il 90% dei macrofagi dovrebbe essere arrotondato e staccato. Quindi, aggiungere 10 millilitri di mezzo RPMI 1640 contenente il 10% di FBS per arrestare la tripsinizzazione. Se necessario, utilizzare un coltello per cellule per rimuovere completamente le cellule.

A volte, in questa procedura, molti macrofagi rimangono aderenti. Questi macrofagi possono essere rimossi dopo la tripsinizzazione passando un distaccatore cellulare sulla superficie della fiasca. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare di macrofagi dalla fiasca in un tubo polipropilenico da 15 millilitri.

Centrifugare per cinque minuti a temperatura ambiente e scartare il soprannatante. Quindi, risospendere delicatamente i macrofagi in un millilitro di mezzo completo. In base al numero di cellule, aggiungere ulteriore mezzo completo per raggiungere la densità cellulare desiderata per la semina.

Quindi, seminare i macrofagi in 1,5 millilitri di mezzo per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Una concentrazione di 1 × 10⁵ cellule in 1,5 millilitri di mezzo per pozzetto produce di solito una coltura quasi confluenziale. Dopo il seminamento, incubare i macrofagi durante la notte a 37 °C per consentire l'adesione cellulare prima di utilizzarli negli esperimenti.

Questa figura mostra le immagini microscopiche in contrasto di fase di monociti freschi criopreservati durante la loro differenziazione indotta da MCSF in macrofagi, a basso ingrandimento. Le immagini dei monociti sono state acquisite al terzo e al settimo giorno di coltura nella fiala, e all'ottavo giorno, un giorno dopo il loro raccolto e ripiastrellamento nella piastra di coltura a 12 pozzetti. Qui viene mostrato il confronto tra monociti freschi e criopreservati utilizzati per produrre macrofagi ad alto ingrandimento.

Le vacuoli in fase di allentamento sono macropinosomi. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come criopreservare e successivamente differenziare i monociti umani con MCSF in macrofagi. Successivamente, i macrofagi possono essere coltivati a densità cellulari desiderate per esperimenti.