Name: Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Impara a coltivare macrofagi umani derivati da monociti differenziati con M-CSF. Questo metodo riduce la variabilità tra i donatori e garantisce densità cellulari consistenti per studi di biologia dei macrofagi.

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Il Dipartimento di Medicina Trasfusionale, Centro Clinico, National Institutes of Health, ha fornito monociti elutriati. Questo lavoro è stato supportato dal Programma di ricerca intramurale, dal National Heart, Lung, and Blood Institute, dal National Institutes of Health.

Leucaferesi è stata effettuata sotto protocollo di ricerca di un soggetto umano approvato da un National Institutes of Health revisione istituzionale bordo. 1. Isolamento e Crioconservazione dei monociti <ol><li> Ottenere cellule mononucleate da leucaferesi di donatori umani, e arricchire monociti dal continuo controcorrente centrifugazione dilavamento delle cellule mononucleari come descritto nei riferimenti 7,8. Ottenere circa 100 x 10 6 cellule elutriated (circa 80 - 90% monociti) in tampone elutriation specificato dal costruttore. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> monociti centrifuga in un tubo da 15 ml in polipropilene a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere le cellule in FBS seguite da dimetilsolfossido per ottenere una concentrazione finale di 90% FBS / 10% dimetilsolfossido e 50 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aggiungere ogni ml di sospensione cellulare to un individuo esageratamente. </li><li> Mettere i cryovials in un contenitore di congelamento delle cellule e trasferire ad un -80 ° C freezer per 24 ore prima del trasferimento a un serbatoio di stoccaggio esageratamente azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 2. La differenziazione dei monociti in macrofagi <ol><li> Scongelare un esageratamente di cellule trasferendo rapidamente a bagnomaria C 37 ° e poi subito la rimozione quando la sospensione cellulare è stato scongelato circa il 70%. </li><li> Subito dopo completa scongelamento a temperatura ambiente, trasferire i 1 ml contenuti esageratamente in 50 ml di 37 ° C riscaldata Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 2 mM L-glutammina, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleuchina-10 (IL-10), e del 10% FBS (mezzo completo). </li><li> Trasferimento 25 ml di sospensione dei monociti in ciascuno dei due 75 cm 2 palloni di plastica di coltura cellulare. </li><li> Incubare culture in un 37 ° cultura incubatore di cellule C con 5% di CO 2/95% di aria per 48 ore. </li><li> Sciacquare il cultures 3 volte con 10 ml di RPMI 1640 medium (pre-riscaldato a 37 ° C), rimuovere delicatamente il terreno di coltura per evitare di spostare tutte le cellule debolmente collegate. </li><li> Dopo il risciacquo, aggiungere mezzo fresco completa, cambiando media ogni 2 giorni fino monociti differenziano e proliferare in misura sufficiente a diventare confluenti. Ciò richiede circa una settimana di coltura. </li></ol> 3. Raccolta macrofagi di avviare esperimenti <ol><li> Risciacquare macrofagi differenziati in boccetta 3 volte con 10 ml di pre-riscaldato soluzione salina tamponata con fosfato di 37 ° C Dulbecco senza Ca 2 + e Mg 2+ prima di aggiungere 10 ml preriscaldata acido etilendiamminotetraacetico tripsina-soluzione 37 ° C 0,25% (EDTA). </li><li> Posto pallone in coltura incubatore cellulare per 10 - 15 minuti momento in cui circa il 90% dei macrofagi dovuto arrotondati e distaccato. Verificare questo esame microscopico del pallone. </li><li> Aggiungere 10 ml di RMPI 1640 medium contenente il 10% FBS per stripsinizzazione superiore. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare macrofagi dal pallone in un tubo da 50 ml polipropilene, centrifugare 300 xg per 5 min, e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere delicatamente i macrofagi in 1 ml di terreno completo. </li><li> Mescolare 10 ml di sospensione cellulare macrofagi con 10 microlitri soluzione Trypan Blue e determinare il numero di cellule macrofagi e vitalità (tipicamente&gt; 95%) con un emocitometro. </li><li> Sulla base del numero di celle (di solito circa 15 - 18 x 10 5 macrofagi), aggiungere ulteriore mezzo completo per ottenere la densità cellulare di semina desiderata. Nota: 1 x 10 5 macrofagi in 1,5 ml di mezzo per pozzetto di una piastra 12 pozzetti produrrà una cultura quasi confluenti. </li><li> Dopo la semina, incubare macrofagi durante la notte in un 37 ° C incubatore di coltura cellulare con il 5% di CO 2/95% di aria per permettere l&#39;adesione cellulare. Poi, iniziare gli esperimenti desiderati. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Generazione di tipi definiti macrofagi può chiarire alcuni dei risultati contrastanti ottenuti dai ricercatori nello studio della biologia dei macrofagi. L&#39;uso di varie condizioni di coltura e fattori di differenziazione per generare macrofagi umani primari possono portare a tipi molto diversi macrofagi, un fatto che non può essere apprezzata dal ricercatore. Ad esempio, i macrofagi a volte sono generate da monociti umani non usando il siero, siero umano da solo, siero umano integrato con M-CSF, FBS da solo, o FBS c...

Lo studio dei macrofagi in coltura è un modello utile per comprendere la funzione di queste cellule nell'infiammazione come avviene nelle placche aterosclerotiche. Quando la ricerca si concentra sulle malattie umane che coinvolgono i macrofagi, è utile studiare i macrofagi umani primari piuttosto che i macrofagi non umani per evitare differenze di specie. Inoltre, gli effetti della trasformazione cellulare possono essere evitati utilizzando macrofagi primari piuttosto che linee cellulari di macrofagi. A questo scopo, i macrofagi differenziati dai monociti isolati dal sangue umano servono come mezzo per ottenere macrofagi umani primari. 
I macrofagi tissutali possono essere residenti all'interno dei tessuti o possono essere derivati da monociti che migrano nel tessuto e si differenziano in macrofagi 1. Sono stati definiti due tipi di macrofagi umani derivati dai monociti che differiscono non solo per la morfologia ma anche per l'espressione genica e la funzione cellulare 2. Questi due tipi sono ottenuti da monociti che si differenziano in macrofagi in presenza di M-CSF + siero fetale bovino (FBS) e monociti che si differenziano in macrofagi in presenza di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) + FBS 2-6. Nella nostra esperienza (osservazione non pubblicata), l'uso di siero umano piuttosto che FBS genera il tipo GM-CSF indipendentemente dal fatto che M-CSF o GM-CSF siano inclusi nel mezzo di differenziazione. I macrofagi di tipo M-CSF tendono ad essere più allungati dei macrofagi di tipo GM-CSF, che assomigliano alle uova fritte nella loro morfologia. Gli investigatori dovrebbero riconoscere che i macrofagi derivati dai monociti M-CSF e GM-CSF umani non sono gli stessi dei cosiddetti macrofagi derivati dal midollo osseo di topo M1 e M2 6.
Durante la ricerca utilizzando macrofagi differenziati M-CSF derivati da monociti umani, abbiamo riscontrato difficoltà legate alla disponibilità di monociti per avviare esperimenti e variazioni nelle densità cellulari ottenute dei macrofagi durante la differenziazione dei monociti in macrofagi. Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato il seguente protocollo in cui i monociti vengono congelati fino a quando non sono necessari per l'uso e i monociti vengono differenziati in massa in macrofagi che possono quindi essere rimossi dai flaconi di coltura e piastrati alle densità cellulari desiderate per ottenere colture più uniformi da un esperimento all'altro.

<table><tbody><tr><td>Piastra di coltura a 12 pozzetti Cellbind</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, matraccio T-75, coltura tissutale trattata</td><td>Greiner Bio-One North America</td><td>658157</td><td></td></tr><tr><td>terreno di coltura RPMI 1640</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>riscaldato a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>375418</tr><tr><td>DPBS senza Ca2+ e Mg2+&nbsp;</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica in polipropilene da 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro a luce intensa migliorato Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>610031</td><td>http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td></tr><tr><td>Congelamento cellulare CoolCell LX contenitore</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td>anche altri contenitori di congelamento dovrebbero essere adeguati per questa fase</td></tr><tr><td>Sistema di stoccaggio dell'azoto liquido, CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>7400</td><td>qualsiasi serbatoio di azoto liquido dovrebbe essere adeguato</td></tr></tbody></table>

cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Per l'inizio degli esperimenti, i monociti freschi o congelati vengono coltivati in fiasche per 1 settimana con M-CSF per indurre la loro differenziazione in macrofagi. Quindi, i macrofagi possono essere raccolti e seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti. L'uso di un numero definito di macrofagi piuttosto che di un numero definito di monociti per avviare colture di macrofagi per esperimenti produce colture di macrofagi in cui la densità cellulare desiderata può essere raggiunta in modo più coerente. L'uso di monociti crioconservati riduce la dipendenza dalla disponibilità del donatore e produce colture di macrofagi più omogenee.

La vitalità dei monociti freschi o crioconservati era superiore al 95%, come determinato con Trypan Blue colorazione 9. Figura 1 e Figura 2 confronta ad ingrandimenti inferiori e superiori, rispettivamente, l&#39;andamento di fresco e crioconservato (cioè, congelato) differenziazione dei monociti in macrofagi. Si noti che il fresco confrontato con monociti crioconservati mostrano una sottopopolazione di differenziare ...

Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Il protocollo utilizza la crioconservazione dei monociti accoppiata alla loro differenziazione di massa in macrofagi. Quindi i macrofagi raccolti possono essere seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare la disponibilità di monociti e ridurre al minimo la variabilità nelle densità cellulari ottenute durante la differenziazione indotta da MCSF di monociti umani del sangue in macrofagi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla biologia dei macrofagi umani. Il principale vantaggio di questa strategia è che colture di macrofagi derivati da monociti umani possono essere facilmente ottenute riducendo la dipendenza dalla disponibilità di donatori.Inoltre, la densità desiderata di cellule macrofagiche e colture omogenee possono essere ottenute in modo costante. Per iniziare questa procedura, ottenere le cellule mononucleate mediante leucaferesi da donatori umani e quindi arricchire i monociti mediante elutriazione centrifuga a controflusso continuo delle cellule mononucleate. Successivamente, contare le cellule utilizzando un emocitometro.Successivamente, centrifugare i monociti in un tubo in polipropilene da 15 millilitri per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere il soprannatante e risospendere delicatamente le cellule in FBS seguito da Dimetilsulfossido per ottenere una concentrazione finale di 90%FBS, 10%Dimetilsulfossido e 50 × 10⁶ cellule per millilitro. Successivamente, aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a un singolo criotubo.Posizionare i criotubi in un contenitore per congelamento cellulare e trasferirlo nel congelatore a meno 80 gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire il contenitore in un serbatoio di azoto liquido per criotubi per la conservazione a lungo termine. In questo passaggio, scongelare un criotubo di cellule mantenendolo brevemente in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.Quando la sospensione cellulare si è scongelata per circa il 70%, rimuoverla immediatamente dal bagno a temperatura ambiente e trasferirla a temperatura ambiente. Dopo che la sospensione cellulare si è completamente scongelata, trasferire un millilitro del contenuto del cryofile in 50 millilitri di mezzo RPMI 1640 contenente L-glutammina 2 millimolare, M-CSF 50 nanogrammi per millilitro, IL-10 25 nanogrammi per millilitro e FBS 10% a 37 gradi Celsius. Successivamente, trasferire 25 millilitri di sospensione di monociti in due fiasche di coltura cellulare in plastica da 75 centimetri quadrati.Incubare le colture a 37 gradi Celsius per 48 ore. Ricordare di non cambiare il mezzo prima delle 48 ore; altrimenti, le cellule non si attaccheranno correttamente e verranno rimosse con il lavaggio. Dopo 48 ore, lavare le colture tre volte con 10 millilitri di mezzo RPMI 1640 preriscaldato.Rimuovere delicatamente il mezzo di coltura per evitare di staccare le cellule debolmente aderenti. Successivamente, aggiungere mezzo completo e coltivare le cellule per una settimana. Cambiare il mezzo ogni due giorni fino a quando i monociti si differenziano e proliferano in modo efficiente, raggiungendo la confluenza.Ora, risciacquare i macrofagi differenziati nel fiasco tre volte con 10 millilitri di DPBS a 37 gradi Celsius senza calcio e magnesio. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di soluzione di tripsina 0,25% EDTA a 37 gradi Celsius. Successivamente, collocare il fiasco in un incubatore per colture cellulari per 10-15 minuti.In seguito, circa il 90% dei macrofagi dovrebbe essere arrotondato e staccato. Quindi, aggiungere 10 millilitri di mezzo RPMI 1640 contenente il 10% di FBS per arrestare la tripsinizzazione. Se necessario, utilizzare un coltello per cellule per rimuovere completamente le cellule.A volte, in questa procedura, molti macrofagi rimangono aderenti. Questi macrofagi possono essere rimossi dopo la tripsinizzazione passando un distaccatore cellulare sulla superficie della fiasca. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare di macrofagi dalla fiasca in un tubo polipropilenico da 15 millilitri.Centrifugare per cinque minuti a temperatura ambiente e scartare il soprannatante. Quindi, risospendere delicatamente i macrofagi in un millilitro di mezzo completo. In base al numero di cellule, aggiungere ulteriore mezzo completo per raggiungere la densità cellulare desiderata per la semina.Quindi, seminare i macrofagi in 1,5 millilitri di mezzo per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Una concentrazione di 1 × 10⁵ cellule in 1,5 millilitri di mezzo per pozzetto produce di solito una coltura quasi confluenziale. Dopo il seminamento, incubare i macrofagi durante la notte a 37 °C per consentire l'adesione cellulare prima di utilizzarli negli esperimenti.Questa figura mostra le immagini microscopiche in contrasto di fase di monociti freschi criopreservati durante la loro differenziazione indotta da MCSF in macrofagi, a basso ingrandimento. Le immagini dei monociti sono state acquisite al terzo e al settimo giorno di coltura nella fiala, e all'ottavo giorno, un giorno dopo il loro raccolto e ripiastrellamento nella piastra di coltura a 12 pozzetti. Qui viene mostrato il confronto tra monociti freschi e criopreservati utilizzati per produrre macrofagi ad alto ingrandimento.Le vacuoli in fase di allentamento sono macropinosomi. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come criopreservare e successivamente differenziare i monociti umani con MCSF in macrofagi. Successivamente, i macrofagi possono essere coltivati a densità cellulari desiderate per esperimenti.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra l'innesco dei monociti primari nei macrofagi. I monociti umani primari possono essere isolati e differenziati in un fenotipo pro-infiammatorio M1-simile utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) o in un fenotipo antinfiammatorio M2-simile utilizzando il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF).

Coltura in vitro e differenziazione dei monociti primari in macrofagi

In questo video, dimostriamo una procedura per indurre la differenziazione e la polarizzazione di monociti derivati dal sangue periferico in macrofagi M1 o M2. L'incubazione con fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, lipopolisaccaride e interferone-gamma produce macrofagi M1 pro-infiammatori, mentre l'incubazione con fattore stimolante le colonie di macrofagi e interleuchina-4 induce la produzione di macrofagi M2 antinfiammatori.

Differenziazione e polarizzazione di cellule derivate da monociti in cellule simili ai macrofagi

Derivate da monociti macrofagi sono cellule importanti del sistema immune innato. Qui, descriviamo un facile da...

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Le cellule del midollo osseo coltivate con il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF) generano una coltura eterogenea contenente macrofagi e cellule dendritiche (DC). Questo metodo evidenzia l'utilizzo del legame MHCII e ialuronano (HA) per differenziare i macrofagi dalle DC nella coltura GM-CSF. I macrofagi in questa cultura hanno molte somiglianze con i macrofagi alveolari.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Presentato qui è un protocollo ottimizzato per isolare, coltivare, tradurre e differenziare i monociti primari umani da individui infettati dall'HIV e dai controlli sani.

Isolamento, trasfezione e cultura dei monociti umani primari

Presentato qui è un protocollo per rilevare la produzione di trap extracellulari macrofalo (MET) nella coltura di cellule vive utilizzando microscopia e colorazione a fluorescenza. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per esaminare specifici marcatori proteici MET mediante colorazione immunofluorescenza.

Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

I macrofagi associati al tumore M2-like (TAM) sono associati alla progressione del tumore e alla prognosi sfavorevole nel cancro. Questo protocollo serve come guida dettagliata per differenziare e polarizzare in modo riproducibile le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi simili a M2 entro 14 giorni. Questo modello è la base per studiare gli effetti antinfiammatori della TAM all'interno del microambiente tumorale.

Differenziazione e polarizzazione dei macrofagi in un fenotipo M2-like utilizzando una linea cellulare di leucemia THP-1 simile a un monocita umano

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

I monociti e i macrofagi sono cellule immunitarie molto plastiche e riprogrammabili, cruciali per la salute e la malattia. Percepiscono e rispondono a un'ampia gamma di stimoli adottando specifici programmi di differenziazione e fenotipi. Abbiamo standardizzato un modello in vitro per studiare la polarizzazione e la riprogrammazione dei macrofagi, fornendo uno strumento prezioso per la ricerca.

Riprogrammazione del modello di macrofagi derivati da monociti umani per saggi in vitro

Impara a coltivare macrofagi umani derivati da monociti differenziati con M-CSF. Questo metodo riduce la variabilità tra i donatori e garantisce densità cellulari consistenti per studi di biologia dei macrofagi.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

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