La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e misurare l'attecchimento in vivo delle cellule del sangue trapiantate nelle nicchie del midollo osseo ricevente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione di processi cellulari come l'homing, l'espansione e la localizzazione in diverse nicchie di midollo osseo di cellule ematopoietiche del donatore dopo il trapianto. Utilizzato in combinazione con i modelli animali ingegnerizzati, questo approccio può aiutare a definire percorsi molecolari critici per la rigenerazione delle cellule ematopoietiche.

A differenza dell'istologia o di altre tecniche di imaging, la microscopia intravitale consente di catturare le interazioni cellula-cellula in un animale vivo a livello cellulare e in tempo reale. Abbiamo deciso di utilizzare questo metodo per determinare se il microambiente del midollo osseo fosse il sito iniziale dello sviluppo della malattia mieloproliferativa causata dalla perdita di segnalazione di Notch. Le sfide per le persone che non conoscono questa tecnica includono la riduzione al minimo degli artefatti respiratori, il posizionamento e la stabilizzazione ottimali della testa ed evitare la saturazione dell'immagine.

Una o due ore prima del trapianto, spruzzare un topo EGFP lisizzato con etanolo al 70%. Successivamente, usa le forbici chirurgiche per praticare un'incisione nella pelle di ciascuna gamba intorno alla caviglia e le pinze chirurgiche per rimuovere la pelle e il pelo insieme per esporre il tessuto muscolare pulito. Rimuovi quanto più muscolo possibile dalle gambe.

Quindi tagliare le ossa delle articolazioni del ginocchio e della caviglia e utilizzare spugne di garza per rimuovere il tessuto muscolare rimanente dai femori e dalle tibie. Sciacquare le ossa pulite in una piastra a sei pozzetti contenente DMEM integrato con il 10% di FBS. Quindi trasferire tutte e quattro le ossa delle zampe posteriori in 10 millilitri di EDTA freddo in PBS in un mortaio e schiacciare le ossa con un pestello.

Triturare le cellule del midollo osseo per ottenere una sospensione a cellula singola e filtrare il liquame attraverso un filtro da 70 micron in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Sciacquare il filtro con due o tre millilitri di PBS. Quindi centrifugare le celle e risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM fresco più il 10% di FBS.

Per l'iniezione, centrifugare la sospensione cellulare, quindi contare e regolare la concentrazione di cellule a 1,5 volte 10 al settimo cellulare per millilitro in IMDM senza siero. Metti le celle sul ghiaccio. Da cinque a sei ore dopo la seconda dose di radiazioni, iniettare tre volte 10 al sesto di cellule del midollo osseo nella vena caudale di ciascun animale ricevente irradiato.

Aggiungi il punto temporale appropriato dopo il trapianto. Posizionare il mouse ricevente anestetizzato su un termoforo a 37 gradi Celsius e confermare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi. Applicare l'unguento sugli occhi dell'animale e somministrare 100 microlitri del marcatore fluorescente appropriato attraverso la vena della coda.

Successivamente, utilizzare un piccolo tagliacapelli elettrico per rimuovere i peli dalla superficie dorsale della testa dell'animale, seguito dall'applicazione di una crema depilatoria. Dopo cinque minuti, rimuovere la crema con una garza e risciacquare la soluzione rimanente con soluzione fisiologica. Disinfettare il cuoio capelluto con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%.

Quindi utilizzare pinze sottili e forbici per praticare un'incisione cutanea della linea mediana da 10 a 20 millimetri sul cuoio capelluto per esporre la superficie dorsale del cranio sottostante. Utilizzando la seta chirurgica 5-0, posizionare due punti di sutura su ciascun lato dell'incisione creando un lembo per esporre il calvario per l'imaging. Applicare una goccia di olio sul cranio esposto.

Con il topo in posizione supina, immergere il cuoio capelluto esposto in un piatto con fondo di vetro riempito di olio da microscopio. Quindi posizionare l'animale su un tavolino di imaging multifotone con il calvario sopra l'obiettivo e coprire l'animale con un termoforo a 37 gradi Celsius. È essenziale che la testa rimanga stabilizzata nella posizione corretta durante l'acquisizione dell'immagine multifotone.

Utilizzare un dispositivo stereotassico o fissare il mouse con del nastro adesivo, a seconda dei casi. Utilizzando un sistema confocale invertito modificato per l'imaging multifotone, sintonizzare il laser a due fotoni a 830 nanometri. Quindi, apri il software di acquisizione delle immagini appropriato.

Nel menu delle impostazioni di acquisizione, verificare che sia selezionata la modalità di scansione unidirezionale e impostare la velocità di scansione su quattro microsecondi per pixel, la frequenza dei fotogrammi su 512 x 512 pixel e lo zoom su 1,5. Seleziona il watt 20X in un obiettivo da 0,95. Apri la finestra dell'elenco dei coloranti e seleziona due fotoni.

Quindi selezionare lo specchio RDM690 nella finestra del controller del microscopio. Nella finestra del percorso della luce e dei dadi, selezionare la casella dell'unità laser due per verificare se l'otturatore laser a due fotoni è aperto. Seleziona Lampada EPI e scegli il cubo filtro B/G EPI.

Quindi focalizzare l'obiettivo sul campione per visualizzare il flusso vascolare nella nicchia del midollo osseo calvariare, utilizzando la biforcazione della vena centrale e la sutura coronarica come punti di riferimento. Utilizzando la modalità non descansionata, selezionare tre rivelatori esterni e acquisire immagini del campione a una velocità di scansione di quattro microsecondi per pixel senza media e con una potenza laser costante e un guadagno del rivelatore per utilizzare l'intera gamma dinamica del rivelatore con una saturazione minima. Dopo aver raccolto una serie di sezioni attraverso la profondità del tessuto, aprire l'apposito software dedicato alla quantificazione e visualizzazione delle immagini 3-4D.

Visualizza in modo interattivo le pile Z utilizzando l'algoritmo di rendering 3D appropriato secondo le istruzioni del produttore. Quindi utilizzare il modulo di segmentazione dell'oggetto spot per segmentare le celle GFP e applicare l'elaborazione aritmetica dello stack per eliminare le celle GFP false positive nei canali verde e rosso. Infine, utilizzare il modulo di segmentazione della superficie per riformare la segmentazione del sistema vascolare e della superficie ossea, applicando algoritmi di distanza di tensione X da punto a superficie per calcolare le distanze delle cellule da una qualsiasi delle superfici distali, se necessario.

Qui, le pile Z raccolte da ciascuna delle sei regioni standard del calvario del midollo osseo sono state renderizzate come proiezione 3D di massima intensità, proiezione 3D delle ombre inclusa la componente ossea e immagini segmentate 3D, consentendo la quantificazione delle cellule e la misurazione delle loro distanze dall'osso e dai vasi. In questo esperimento, l'imaging in vivo delle cellule mieloidi nel microambiente del midollo osseo difettoso di Notch ha rivelato che le cellule GFP lisate dal donatore hanno un'efficienza di homing simile nel tipo selvatico e nei riceventi knockout a 24 ore dopo il trapianto, mentre mostrano un attecchimento diverso in punti temporali successivi. L'analisi della dinamica dell'espansione dei progenitori mieloidi ha mostrato che le cellule trapiantate di midollo osseo in modo adattivo si espandono più rapidamente e in numero maggiore nei riceventi knockout a due settimane dal trapianto.

Le cellule del midollo osseo del donatore nei riceventi wild type si sono espanse più tardi, ma in numero due volte superiore rispetto alle cellule del donatore e ai riceventi knockout a quattro settimane, un momento in cui le cellule del donatore nel midollo osseo knockout sono diminuite perché sta entrando rapidamente in circolazione. E che entro sei settimane, le differenze nel numero di cellule del donatore nel midollo osseo calvario si livellano. Inoltre, l'analisi della segmentazione 3D della regione medio-bassa del calvaria knockout e wild type a sei settimane dal trapianto di midollo osseo indica che le cellule GFP lisate sono localizzate alla stessa distanza dall'osso in entrambi i tipi di animali riceventi, ma è interessante notare che risiedono più distanti dal sistema vascolare nei topi knockout.

Una volta padroneggiato, l'imaging intravitale del midollo osseo può essere completato in un'ora e 30 minuti per topo se eseguito correttamente. Durante l'utilizzo di questo approccio, è importante ricordare di campionare più aree del midollo osseo del calvario per topo e di analizzare almeno tre topi per esperimento per affrontare eventuali variazioni intra e intercampione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come combinare il trapianto di midollo osseo e l'imaging intravitale per determinare la cinetica dell'attecchimento di una specifica sottopopolazione di sangue nel microambiente del midollo osseo.