Un semplice citometria a flusso metodo per misurare il glucosio assorbimento e glucosio Expression Transporter per monociti sottopopolazioni nel sangue intero

L'obiettivo generale di questa metodologia è misurare l'assorbimento del glucosio e del suo trasportatore in diverse sottopopolazioni di monociti. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come ad esempio: qual è l'importanza del metabolismo delle cellule immunitarie nell'esito delle malattie? I principali vantaggi di queste tecniche sono la rapidità, la facilità di esecuzione, l'assenza di materiali reattivi e la necessità di un solo piccolo volume di sangue.

Entro un'ora dal prelievo dei campioni di sangue, contenuti in provette con anticoagulante citrato ACD-B, posizionare i campioni all'interno di una cappa biologica. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di sangue da ciascun campione in provette di polipropilene singole e trattare le cellule con due millilitri di soluzione di lisi 1X su ghiaccio, miscelando delicatamente mediante pipetta. Dopo 15 minuti, centrifugare le cellule e procedere con altre due centrifugazioni in tampone di lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, utilizzare una pipetta per rimuovere con attenzione la maggior quantità possibile dei soprannatanti e risospendere i pellet in 100 microlitri di buffer di lavaggio su ghiaccio. Per identificare le specifiche sottopopolazioni di monociti, colorare le cellule con cinque microlitri degli anticorpi appropriati ogni 100 microlitri di cellule, per 30 minuti su ghiaccio al buio. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni due volte in soluzione di lavaggio e fissare le cellule con 200 microlitri di formaldeide allo 0,5% in PBS.

Quindi, analizzare le cellule entro 24 ore su un citometro a flusso in grado di rilevare quattro colori. Per valutare l'assorbimento di glucosio delle sottopopolazioni di monociti, trasferire 90 microlitri di sangue da ciascun campione in provette di polipropilene singole e aggiungere 10 microlitri dell'analogho fluorescente di glucosio di interesse al sangue. Agitare delicatamente le provette per mescolare e coprire i campioni con carta d'alluminio.

Successivamente, posizionare le cellule a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti, seguiti dal loro immediato trasferimento sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere quattro millilitri di soluzione lisante FACS ai tubi e centrifugare le cellule. Quindi, eseguire una seconda centrifugazione in buffer di lavaggio.

Decantare il soprannatante e colorare le cellule con gli anticorpi specifici di interesse per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Successivamente, lavare i campioni con quattro millilitri di tampone di lavaggio ghiacciato, risospendere i pellet in 200-300 microlitri di PBS ghiacciato e analizzare i tubi entro 10 minuti. Per l'analisi citometrica in flusso, utilizzare innanzitutto i campioni di controllo non colorati e quelli colorati singolarmente per impostare la compensazione.

Successivamente, nel software appropriato per l'analisi di singola cellula, aprire il primo campione in un grafico di scatter forward rispetto allo scatter laterale e delimitare i monociti come illustrato. Quindi, fare doppio clic sulla popolazione di monociti selezionata e delimitare la popolazione negativa per CD3. A questo punto, fare doppio clic sulla popolazione negativa per CD3 e impostare l'asse x per visualizzare la colorazione per CD14 e l'asse y per visualizzare la colorazione per CD16.

Successivamente, per misurare l'assorbimento di glucosio o del suo trasportatore in una specifica sottopopolazione di monociti, generare gli istogrammi appropriati. Quindi, laddove esistano popolazioni cellulari definite, utilizzare i campioni controllo FITC igG per impostare la finestra e determinare la percentuale totale di monociti positivi per CD14 in ciascun campione. Qui viene mostrata la strategia iniziale di gating per l'isolamento dei monociti mediante lo scatter cellulare ed esclusione dei linfociti T, effettuata selezionando la popolazione negativa per CD3.

I monociti vengono quindi selezionati in base all'espressione di CD14 da sola, oppure in combinazione con CD16, per identificare i monociti totali o le sottopopolazioni monocitarie. Possono essere osservate popolazioni distinte di monociti positivi per il trasportatore del glucosio Glut-1 e positivi per CD14, in particolare nei globuli bianchi circolanti ottenuti da individui sieropositivi per HIV. Cellule positive per CD14 e per Glut-1 possono inoltre essere osservate all'interno di specifici sottoinsiemi monocitari in individui non infetti da HIV, sebbene tali popolazioni siano più evidenti nei pazienti sieropositivi per HIV.

Come previsto dai dati sull'espressione dei trasportatori del glucosio, anche l'analogo del glucosio 2-NBDG viene assorbito in quantità maggiori dalle cellule di individui positivi al virus dell'immunodeficienza umana. Una volta appresa, questa tecnica può essere completata in un'ora e mezza se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante limitare l'esposizione alla luce in tutte le regioni.

Dopo il rilevamento dell'assorbimento di analoghi del glucosio, le cellule possono essere marcate con anticorpi specifici per la superficie cellulare al fine di identificare popolazioni immunitarie specifiche di interesse. Dopo il suo sviluppo, questo metodo può essere utilizzato per determinare in che modo l'HIV influisce sul metabolismo delle cellule immunitarie e può essere esplorato anche da altri ricercatori in diversi ambiti, come l'immunologia, la virologia e la ricerca sul cancro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come rilevare il trasportatore del glucosio uno e l'assorbimento del glucosio nelle cellule immunitarie.

Ricordare che, quando si lavora con agenti infettivi, è necessario adottare le normali procedure di sicurezza.