Un semplice citometria a flusso metodo per misurare il glucosio assorbimento e glucosio Expression Transporter per monociti sottopopolazioni nel sangue intero

L'obiettivo generale di questa metodologia è misurare l'assorbimento del glucosio e del suo trasportatore su diverse sottopopolazioni di monociti. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio Qual è l'importanza del metabolismo delle cellule immunitarie negli esiti della malattia? I principali vantaggi di queste tecniche sono che sono veloci, facili da eseguire, non richiedono materiale reattivo e richiedono solo un piccolo volume di sangue.

Entro un'ora dalla raccolta dei campioni di sangue, in provette anticoagulanti ACD-B al citrato, collocare i campioni in una cappa di sicurezza biologica. Quindi, aggiungere 100 microlitri di sangue da ciascun campione in provette di polipropilene individuali e trattare le cellule con due millilitri di soluzione lisanti 1X su ghiaccio, pipettando delicatamente per mescolare. Dopo 15 minuti, centrifugare le cellule e seguire con altre due centrifughe nel tampone di lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, utilizzare una pipetta per rimuovere con cura la maggior quantità possibile di surnatanti e risospendere i pellet in 100 microlitri di tampone di lavaggio su ghiaccio. Per identificare le sottopopolazioni specifiche di monociti, colorare le cellule con cinque microlitri di anticorpi appropriati per 100 microlitri di cellule, per 30 minuti sul ghiaccio al buio. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni due volte in soluzione di lavaggio e fissare le cellule con 200 microlitri di formaldeide allo 0,5% in PBS.

Quindi, analizza le cellule entro 24 ore su un citometro a flusso in grado di rilevare quattro colori. Per valutare l'assorbimento del glucosio delle sottopopolazioni di monociti, trasferire 90 microlitri di sangue da ciascun campione in singole provette di polipropilene e aggiungere 10 microlitri dell'analogo fluorescente del glucosio di interesse per il sangue. Agitare delicatamente le provette per mescolare e coprire i campioni con un foglio di alluminio.

Quindi, posizionare le celle a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti, quindi trasferirle immediatamente nel ghiaccio. Quindi, aggiungere quattro millilitri di soluzione di lisi FACS alle provette e centrifugare le cellule. Quindi, eseguire una seconda centrifugazione nel tampone di lavaggio.

Decantare il surnatante e colorare le cellule con gli anticorpi appropriati di interesse per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Quindi, lavare i campioni in quattro millilitri di tampone di lavaggio ghiacciato, risospendere i pellet in 200-300 microlitri di PBS ghiacciato e analizzare le provette entro 10 minuti. Per l'analisi citofluorimetrica, utilizzare prima i campioni di controllo non colorati e colorati individualmente per impostare la compensazione.

Successivamente, nel software di analisi a singola cellula appropriato, aprire il primo campione in un grafico di dispersione forward by side e bloccare i monociti come illustrato. Quindi, fare doppio clic sulla popolazione di monociti gated e bloccare la popolazione CD3-negativa. Ora fai doppio clic sulla popolazione CD3-negativa e imposta l'asse x per visualizzare la colorazione CD14 e l'asse y per visualizzare la colorazione CD16.

Successivamente, per misurare l'assorbimento del glucosio o del suo trasportatore in una specifica sottopopolazione di monociti, generare gli istogrammi appropriati. Quindi, dove esistono popolazioni cellulari definite, utilizzare i campioni di igG FITC di controllo per impostare il cancello e determinare la percentuale totale di monociti CD14-positivi in ciascun campione. Qui, viene mostrata la strategia iniziale di gating per isolare i monociti mediante dispersione cellulare e l'esclusione delle cellule T mediante gating all'interno della popolazione CD3-negativa.

I monociti vengono quindi controllati per l'espressione di CD14 da soli o in combinazione con CD16 per identificare i monociti totali o le sottopopolazioni di monociti. Popolazioni distinte di monociti positivi al trasportatore del glucosio Glut-1 CD14-positivi possono essere osservate, in particolare nei globuli bianchi circolanti ottenuti da individui HIV-positivi. Le cellule CD14-positive Glut-1 positive possono essere osservate anche all'interno di specifici sottogruppi di monociti in individui non infetti da HIV, sebbene queste popolazioni siano più pronunciate nei pazienti HIV-positivi.

Come previsto dai dati di espressione del trasportatore del glucosio, l'analogo del glucosio 2-NBDG viene utilizzato in quantità maggiori anche dalle cellule di individui HIV-positivi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro un'ora e mezza se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante limitare l'esposizione alla luce a tutte le regioni.

Dopo l'assorbimento dell'analogo del glucosio, le cellule possono essere colorate con anticorpi di superficie cellulare per identificare specifiche popolazioni immunitarie che ti interessano. Dopo il suo sviluppo, questo metodo può essere utilizzato per determinare come l'HIV influisce sul metabolismo delle cellule immunitarie, può anche essere esplorato da altri ricercatori, in diversi campi, come l'immunologia, la virologia e la ricerca sul cancro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare il trasportatore del glucosio uno e l'assorbimento del glucosio nelle cellule immunitarie.

Non dimenticare che quando si lavora con agenti infettivi, è necessario utilizzare procedure di sicurezza standard.