Name: In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Scopri l'assaggio di trascrizione in vitro per studiare la regolazione trascrizionale e testare agenti antibatterici. Questo metodo consente la visualizzazione diretta dei prodotti di trascrizione su gel di sequenziamento RNA.

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Questo lavoro riconosce una sovvenzione per l'inizio della carriera della facoltà dell'Università di Newcastle (CM).

Attenzione: Gli esperimenti prevedono l&#39;utilizzo della radioattivo dell&#39;isotopo 32 P e nessun lavoro dovrebbero essere intraprese fino a quando tutte le condizioni di sicurezza adeguate sono state soddisfatte. In generale il personale sono tenuti a frequentare un corso di sicurezza e sottoposti pratica supervisionata prima di esperimenti usando reagenti radioattivi. Si prega di indossare dispositivi di protezione individuale (dosimetro thermoluminescent, occhiali di sicurezza, guanti, camici camera radiazioni, pantaloni a figura intera, chiuso-toe scarpe) quando si esegue la reazione. 1. Preparazione di materiali necessari al test <ol><li> Ottenere il proteine ​​necessarie per il dosaggio di trascrizione. <ol><li> Per l&#39;esperimento descritto qui, sovrapproduzione e purificare E. coli RNAP in laboratorio come descritto 11, o ottenere da una fonte commerciale (Materials List). Nota: entrambi forniscono risultati simili. Altri metodi per la purificazione di RNAP nativo o affinità etichettati possono anche essere usate 12,13. Sigma / fattori Nusa possono essere ottenuti come ddescritto nella precedente lavoro 14,15. </li></ol></li><li> Acqua Preparazione di dietilpirocarbonato (DEPC) trattati Nota: In alternativa, l&#39;acqua RNase-free può essere ottenuto da fonti commerciali (Materials List). <ol><li> Aggiungere 1 ml dietilpirocarbonato (DEPC) a 1 L di acqua purificata (0,1% v / v) e miscelare notte. </li><li> acqua DEPC autoclave e suggerimenti per due volte. </li></ol></li><li> DNA stampo Preparazione <ol><li> Purificare plasmide pSG1154 16 e / o 17 pIA226 utilizzando un kit di purificazione plasmide (Elenco materiali) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Per amplificare il modello per le analisi di trascrizione run-off (un frammento di 360 bp che comprende la regione xyl promotore P), assemblare una reazione di PCR in ghiaccio tra cui 25 microlitri 2x PCR mix (Elenco materiali), 2 ml ciascuno dei primer (5 micron) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(in avanti) e 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (reverse), 1 ml pSG1154 plasmide preparation (250 mM) e 20 ml di acqua depurata). <ol><li> Oppure, in alternativa, per i singoli saggi di trascrizione rotonde, amplificare un frammento di 447 bp che comprende la regione R promotore λ P da pIA226 17. Impostare una reazione di PCR in ghiaccio con 25 microlitri 2x PCR mix, 2 ml ciascuno dei primer (5 micron): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(in avanti) e 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (reverse), pIA226 1 ml 17 miniprep (250 mM) e 20 ml di acqua depurata). Nota: Questo modello manca citosina fino alla posizione +26 nt, che è il 26 ° nucleotide dal sito di inizio della trascrizione. Pertanto, trascrizione utilizzando questo modello consentirà apertura, passaggio promotore e stallo al +26 nt per formare un complesso di allungamento trascrizione stabile (CE), quando solo ATP, UTP e GTP sono presenti nella reazione. </li></ol></li><li> Impostare una reazione PCR con le seguenti condizioni: 95 °; C per 30 sec, 50 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec, ripetendo per 30 cicli. </li><li> Purificare il prodotto utilizzando un kit PCR clean-up (Materials List) secondo le istruzioni del produttore ed eluire in 100 microlitri di buffer di trascrizione per il saggio di trascrizione. </li><li> Determinare la concentrazione modello di DNA utilizzando un fluorospectrometer (Materials List). </li></ol></li><li> NTP Preparazione Nota: PTR possono essere ottenuti da diverse fonti commerciali (Materials List). <ol><li> Sciogliere PTR (≥99% puro) in acqua DEPC trattati per fare 1 m stock, aliquota 1 ml della soluzione in provette da 1,5 ml (50 ml in ciascun tubo) e conservare a -20 ° C. </li><li> Ordine α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) prima dell&#39;esperimento. 32 P ha una breve emivita di 14.29 giorni. Nota: Usando UTP alpha-marcato evita confrontando l&#39;intensità delle bande di diversa lunghezza. </li></ol></li><li> Preparazione RNA Ladder <ol><li> Montare il followreazione ing a temperatura ambiente: 0,5 mg di RNA Template Mix (Materials List), 80 mm tampone HEPES pH7.5, 12 mm MgCl 2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 ul a- 32 P UTP, 0,5 microlitri T7 RNAP (Elenco materiali), acqua DEPC trattati a 20 ml. </li><li> Lasciare reazione di procedere a 37 ° C per 1 ora. Utilizzare immediatamente o conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di RNA Sequencing Gel <ol><li> Gel di Preparazione <ol><li> Pulire le piastre da un apparato gel di sequenziamento (Materials List) due volte con etanolo al 70% e acqua purificata, e assemblare la cella con un pettine e due distanziatori. Nota: Un piatto può essere rivestito con siliconatura reagente (Materials List) per facilitare la rimozione di gel nel passaggio 4.2. </li><li> Sciogliere 33,6 g di urea in 22 ml di acqua e 16,4 ml di borato EDTA (TBE) tampone / (54 g tris (idrossimetil) aminomethane / 5x Tris; acido borico 27,5 g; 10 ml di 1 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 7,4 in 1 L di acqua) con un agitatore magnetico. </li><li> Aggiungere 16 ml di 40% / soluzione acrilamide bis-acrilamide (19: 1) per la soluzione di urea e filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. </li><li> Aggiungere 514 microlitri al 10% (w / v) di persolfato di ammonio appena preparato in acqua seguita da 51,4 ​​microlitri N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethylethylenediamine (TEMED) alla soluzione filtrata. </li><li> Capovolgere delicatamente la soluzione di gel al fine di evitare un eccessivo aerazione e iniettare immediatamente e senza intoppi nella cella di sequenziamento preconfezionata posizionato orizzontalmente dal foro di iniezione fondo. Fare attenzione a evitare di fare le bolle durante l&#39;iniezione. </li><li> Consentire 1-1,5 ore finché il gel sia completamente indurito prima dell&#39;uso in un test di trascrizione. Il gel può essere conservato a temperatura ambiente per due o tre giorni, quando avvolto con tessuto bagnato acqua sulla parte superiore della cella sequenziamento. </li></ol></li></ol> 3. Trascrizione di reazione <ol><li> Trascrizione Allungamento Assay Pausa <ol><li> Formazione di un complesso di allungamento trascrizione <ol><li> Aggiungere 1 ml di RNAP nucleo dell&#39;enzima (1 mM magazzino in tampone trascrizione) in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 1 ml di purificato sigma-70 fattore (σ 70; 3 micron magazzino nel buffer di trascrizione) per la RNAP e incubare in ghiaccio per 10 minuti in modo da formare RNAP oloenzima. </li><li> Aggiungere 3 ml 500 nM template purificato DNA (λ P R promotore dal prodotto pIA226 PCR) in tampone di trascrizione alla holoenzyme RNAP e incubare a 37 ° C per 5 minuti per formare il complesso aperto. </li><li> Preparare una miscela di componenti di reazione in un&#39;altra provetta da 1,5 ml con 5 ml di 10x tampone di trascrizione (Elenco materiali: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 50% glicerolo, pH 7,9 a DEPC trattati acqua), 2 ml di 250 micron ciascuna GTP e UTP, 1 ml di 1 mm ATP, e 1 ml di α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Aggiungere acqua trattata DEPC a 41 ml. Note: inibitore RNasi (Materials List) può essere usato per ridurre la contaminazione RNasi. </li><li> Trasferire la soluzione della miscela nella provetta contenente il complesso aperto e incubare a 37 ° C per 15 minuti per formare il complesso di trascrizione allungamento fermato a +26 nt. </li><li> Spostare la reazione a temperatura ambiente (~ 21 ° C) e aggiungere 1 ml di 2,5 mg / ml rifampicina ad una concentrazione finale di 50 pg / ml. </li><li> Aggiungere 1 ml di 0,1 mM purificati Nusa alla miscela di reazione e incubare per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2 ml di 250 mM CTP nella miscela di reazione per fare un volume finale di 50 microlitri e misurare il tempo di reazione usando un timer. </li><li> Trasferimento 5 ml di soluzione di reazione in 2 ml di tampone RNA gel di carico (95% formammide, 0,05% blu di bromofenolo e lo 0,05% xilene cianolo) a 30, 60, 120, 240, 480 e 1.200 sec per placare la reazione. </li><li> Smaltire le punte 32 P UTP e tubi in un cont rifiuti radioattiviAiner. </li></ol></li></ol></li><li> Trascrizione iniziazione Assay <ol><li> La formazione della Open Complex <ol><li> Diluire purificato σ 70-0,5 micron. </li><li> Ripetere i punti 3.1.1.1 al 3.1.1.3 utilizzando 0,5 micron (invece di 3 micron) purificato σ 70, e il modello di DNA (la regione xyl promotore P dal prodotto pSG1154 PCR). </li></ol></li><li> L&#39;inibizione di test iniziazione di trascrizione <ol><li> Aggiungere l&#39;inibitore progettato per impedire la formazione di RNAP oloenzima di enzima nucleo RNAP prima dell&#39;aggiunta σ 70 (dopo il passo 3.1.1.1), seguita da passi 3.1.1.2 e 3.1.1.3 di esaminare se l&#39;inibitore è in grado di interrompere oloenzima formazione. </li><li> In alternativa, dopo la fase 3.1.1.2, aggiungere l&#39;inibitore di esaminare se sia in grado di inibire in modo competitivo σ 70 legame RNAP. </li><li> Utilizzare la stessa quantità di DMSO, il solvente dell&#39;inibitore, invece dell&#39;inibitore stock nelle reazioni di controllo. </li></ol></li><li> Il completamento della reazione <ol><li> Sciogliere eparina in acqua ad una concentrazione stock di 1 mg / ml e magazzino a -20 ° C. Nota: L&#39;eparina è un concorrente di DNA che può sequestrare RNAP che non ha formato un complesso aperto. Una volta che il complesso aperto è formato, eparina non può entrare nel sito di legame al DNA di RNAP e inibire la trascrizione dal complesso aperto preformato. Pertanto, l&#39;eparina è richiesta solo per i dosaggi turno unico; non è necessario per le analisi multi-rotonde. </li><li> Preparare la miscela di reazione con 5 ml di 10x tampone di trascrizione (Elenco materiali), 1 ml di 1 mg / ml di soluzione di eparina, 1 ml di 10 mm ciascuna ATP, GTP, e CTP, 2,5 mM UTP, e 1 ml di α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Aggiungere acqua trattata DEPC a 45 ml. </li><li> Mescolare la miscela di reazione con la trascrizione complesso aperto, rotazione impulso e incubare a 37 ° C per 20 min. </li><li> Trasferire 10 microlitri della reazione cosìluzione in 5 ml di tampone RNA gel di carico (95% formammide, 0,05% blu di bromofenolo e lo 0,05% xilene cianolo) per placare la reazione. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Esecuzione e sviluppo RNA Gel <ol><li> L&#39;esecuzione del gel poliacrilammide denaturazione <ol><li> Attivare il gel a 50 ° C e 50 W in 1x tampone TBE per circa 1,5 ore fino a quando la temperatura del gel e il buffer è stabile a 50 ° C. </li><li> campioni di calore a 90 ° C per 30 sec e spostarli sul ghiaccio prima di carico sul gel. </li><li> Caricare i campioni nei pozzetti sulla parte superiore del gel fianco una corsia contenente 2 microlitri scaletta RNA (diluizione 1: 100). </li><li> Attivare il gel a 50 W e 50 ° C in 1x tampone TBE fino a quando il colorante blu bromofenolo raggiunge ~ 2/3 verso il basso il gel. </li></ol></li><li> Trattamento Gel <ol><li> Aprire lentamente e con attenzione separare la piastra superiore dalla cella sequenziamento. Fare molta attenzione per evitare di rompere il gel. </li><li> Cut chromatography carta (Materials List) in base alle dimensioni del gel dall&#39;alto verso il colorante blu di bromofenolo. Utilizzare un contatore Geiger per confermare la posizione approssimativa di trascritti di RNA marcati radioattivamente. </li><li> coprire con cura il gel con la carta da filtro, e premere con decisione fino a quando il gel aderisce alla carta da filtro. Tagliare e gettare il fondo del gel di rifiuti radioattivi come PTR non costituite corrono al fondo del gel, che può essere molto caldo. </li><li> Posizionare un pezzo di dimensioni simili di carta da filtro sul letto di essiccazione di una macchina per essiccamento sotto vuoto, e adagiare il foglio gel rivestito su di esso con il gel verso l&#39;alto. </li><li> Coprire il gel con una pellicola trasparente e asciutto a 60 ° C per 1,5 ore. </li><li> Avvolgere l&#39;altro lato della carta da filtro rivestito gel di involucro di plastica e posizionare su un piatto fosforo fotostimolabile nel caso di imaging, con il tempo di esposizione appropriata, che può variare da 1 ora a seconda overnight sull&#39;efficienza reazione. </li><li> Immagine la piastra di fosforo conuno scanner imager in base alle istruzioni del produttore. Determinare l&#39;intensità della banda relativa utilizzando il software ImageJ secondo il manuale del software. </li><li> Utilizzare un contatore Geiger per controllare la contaminazione radioattiva nella zona di lavoro, pulire gli elementi sospetti e la zona con il tessuto e un detergente e smaltire il tessuto nel contenitore di smaltimento. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In tutti gli organismi, la trascrizione è un processo strettamente regolata. In vitro di trascrizione sono stati sviluppati per fornire una piattaforma per testare gli effetti dei fattori di trascrizione, piccole molecole e gli inibitori della trascrizione. In questo lavoro metodo, un saggio per la trascrizione batterica generale è stato descritto. saggi di trascrizione in combinazione con il sequenziamento elettroforesi su gel di trascrizioni sono molto importanti per gli studi meccanicistici in quanto consent...

La trascrizione è il processo in cui l&#39;RNA è sintetizzato da un modello di DNA specifico. Nelle cellule eucariotiche sono tre RNAPs distinte: RNAP che trascrive rRNA precursori, RNAP II è responsabile della sintesi di mRNA e di alcuni piccoli RNA nucleari, e la sintesi di rRNA 5S e tRNA viene eseguita da RNAP III. Nei batteri, c&#39;è solo un RNAP responsabile della trascrizione di tutte le classi di RNA. Ci sono tre fasi di trascrizione: inizio, allungamento e terminazione. La trascrizione è uno dei processi più altamente regolamentati nella cellula. Ogni fase del ciclo di trascrizione rappresenta un punto di controllo per la regolazione dell&#39;espressione genica 1. Per l&#39;inizio, RNAP deve associare a un fattore sigma per formare holoenzyme, che è necessario per dirigere l&#39;enzima a siti specifici chiamato promoters 2 per formare un complesso promotore aperta. Successivamente, una grande suite di fattori di trascrizione sono responsabili per la regolamentazione oattività f RNAP durante le fasi di allungamento e di terminazione. Il fattore di trascrizione qui esaminato è la proteina altamente conservata ed essenziale, Nusa. Esso è coinvolto nella regolazione della trascrizione pausa e risoluzione, così come anti-terminazione durante rRNA sintesi 3-5. In vitro di trascrizione sono stati sviluppati come potenti strumenti per studiare le fasi complesse di regolazione durante la trascrizione 6. In generale, un frammento lineare di DNA comprendente un promotore è richiesto come modello per la trascrizione. Il DNA templato è solitamente generato mediante PCR o linearizzazione un plasmide. proteine ​​purificate e PTR (tra cui uno radioattivo NTP a fini di rilevazione) sono poi aggiunti e dei prodotti analizzati dopo il periodo di incubazione richiesto. Utilizzando i modelli appropriati e condizioni di reazione, tutte le fasi della trascrizione sono stati esaminati utilizzando questo approccio che ha permesso la caratterizzazione molecolare dettagliato della trascription nel corso dell&#39;ultimo mezzo secolo 7. In combinazione con le informazioni sulla struttura 3-dimensionale delle RNAP è stato anche possibile sondare il meccanismo molecolare di inibizione della trascrizione da antibiotici e lead antibiotico, e utilizzare queste informazioni per lo sviluppo di nuovi farmaci migliorati 8-10. In questo lavoro fornendo esempi di come saggi di trascrizione possono essere utilizzati per determinare il meccanismo di regolazione mediante trascrizione allungamento / fattore di terminazione Nusa, e come il meccanismo di azione di un romanzo piombo inibitore inizio della trascrizione può essere determinato.

<table><tbody><tr><td>Ottenere le proteine necessarie per il saggio</td><td></td><td></td><td></td> di trascrizione</tr><tr><td>E. coli RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Preparazione di acqua</td><td></td><td></td><td></td>trattata</tr> con <tr><td>DEPC dietilpirocarbonato (DEPC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza RNasi&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi Ambion</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Procedura guidata per la preparazione</td><td></td><td></td><td></td>del modello di DNA</tr><tr><td>&nbsp; Plus&nbsp;SV Minipreps Sistema di purificazione del DNA</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td></td><td></td><td></td>PCR</tr><tr><td>Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System&nbsp;</td><td>Spettrometro fluorometrico Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>rNTP ad alta purezza</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-32P UTP&nbsp;</td><td>PerkinElmer&nbsp; &nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>Preparazione</td></tr><tr><td>della scala di RNA composto radioattivo&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&ndash; 1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Preparazione</td><td></td><td></td><td></td>del gel</tr><tr><td>Cellula di sequenziamento dell'acido nucleico Sequi-Gen GT</td><td>Bio-Rad&nbsp; &nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>urea&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(idrossimetil)amminometano&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>154563</tr><tr><td>acido borico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td>Acido etilendiamminertetraacetico <td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% acrilammide/bis-acrilammide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>persolfato di ammonio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Saggio </td><td></td> di trascrizione Sigma-Aldrich T9281 <td></td></tr><tr><td></td> Cloruro di potassio Sigma-Aldrich&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formammide&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>blu bromofenolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xilene cianolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>eparina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasina Ribonucleasi</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di trascrizione&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Glicerolo DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td> &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Carta</td><td></td><td></td><td></td>da filtro</tr><tr><td>Whatman&nbsp; Carta per cromatografia Chr da 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Decontaminante</td><td></td><td></td><td></td>radioattivo</tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Trattamento in gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imager Typhoon Trio+</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in drug discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro trascrizione sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati per molti anni per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella trascrizione. Questo processo richiede multi-subunità DNA-dipendente RNA polimerasi (RNAP) e una serie di fattori di trascrizione che agiscono per modulare l&#39;attività di RNAP durante genica. gel elettroforesi sequenziamento dei trascritti radiomarcati viene utilizzato per fornire informazioni meccanicistica dettagliate su come procede trascrizione e quali parametri possono incidere su di essa. In questo lavoro descriviamo il protocollo per studiare come il fattore di allungamento essenziale Nusa regola la pausa di trascrizione, così come un metodo per identificare un agente antibatterico mira trascrizione iniziazione attraverso l&#39;inibizione della formazione di oloenzima RNAP. Questi metodi possono essere utilizzati come una piattaforma per lo sviluppo di approcci aggiuntivi per esplorare il meccanismo di azione dei fattori di trascrizione che rimangono ancora chiaro, così come nuovi agen antibattericots mira trascrizione che è un obiettivo sottoutilizzato della droga in ricerca e sviluppo di antibiotici.

efficienza della trascrizione può essere determinata misurando il livello di radiazione nelle bande in diversi momenti. Il saggio pausa per testare la funzione di fattore di Nusa visualizzazione della pausa, terminazione attivata, e prodotti (Figura 1A) run-off. Alla presenza del dominio N-terminale di Nusa (Nusa NTD; residui di aminoacidi 1-137), l&#39;aspetto dei prodotti di RNA è stato significativamente ritardato rispetto al esperimento di controllo manca NUSA. Soppr...

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per esaminare funzionalmente la trascrizione e l'attività inibitoria di agenti antibatterici che mirano alla trascrizione batterica.

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

L'obiettivo generale di questo saggio di trascrizione in vitro è studiare i complessi passaggi regolatori durante la trascrizione, fornendo una piattaforma per testare gli effetti dei fattori di trascrizione, delle piccole molecole e degli inibitori della trascrizione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in biologia molecolare, come i meccanismi precisi associati alla regolazione della trascrizione, la funzione dei fattori di trascrizione con meccanismi sconosciuti e gli effetti degli inibitori normali della trascrizione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione diretta di tutti i prodotti della trascrizione lungo una linea temporale da un singolo gel di sequenziamento dell'RNA.Iniziare questa procedura pulendo le piastre di un apparato per gel di sequenziamento due volte con etanolo al 70% e acqua purificata. Assemblare la cella con un pettine e due distanziali. Sciogliere 33,6 grammi di urea in 22 millilitri di acqua e 16,4 millilitri di buffer TBE 5 volte utilizzando un agitatore magnetico.Aggiungere 16 millilitri di una soluzione di acrilamide al 40% alla soluzione di urea e filtrare attraverso un filtro da 0,45 micro

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Abbiamo sviluppato un DNA-binding, dosaggio quantitativo basato su ELISA per misurare le interazioni tra fattori di trascrizione con il DNA. Alta specificità per la proteina RUNX2 è stato raggiunto con un consenso DNA riconoscimento oligonucleotide e anticorpo monoclonale specifico. Rilevamento colorimetrico con una reazione substrato anticorpo enzimatico accoppiato stata monitorata in tempo reale.

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Gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e il suo analogo freebase presentano bassa citotossicità cellulare micromolare. Questo manoscritto descrive una reazione di trascrizione di RNA, RNA di imaging con un gel bromuro di etidio macchiate e quantificare RNA con spettroscopia UV-Vis, al fine di valutare l'inibizione della trascrizione da corroles e dimostra un metodo semplice di valutare le proprietà anticancro candidati.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

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Valutare l&#39;efficacia delle Cancer Drug Sensibilizzazione<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Qui descriviamo un saggio genetico reporter basato su cellule come uno strumento prezioso per lo screening di librerie chimiche per composti che modulano i meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitati attraverso 3' UTR.

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Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus

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In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

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Screening farmacologico basato sulla trascrittomica efficiente in termini di costi

Scopri l'assaggio di trascrizione in vitro per studiare la regolazione trascrizionale e testare agenti antibatterici. Questo metodo consente la visualizzazione diretta dei prodotti di trascrizione su gel di sequenziamento RNA.

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

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