Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere un metodo che può essere utilizzato per studiare la formazione automatizzata del doppio strato lipidico utilizzando un film sottile di polidimetilsilossano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei nanobiosensori per quanto riguarda le interazioni membrana-proteina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la formazione del doppio strato lipidico è automatizzata e riproducibile.

Per iniziare, preparare la soluzione tampone combinando cloruro di potassio, tris cloridrato e EDTA in acqua distillata. Quindi, regolare il PH della soluzione a 8,0. Quindi, filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 micron e sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 gradi Celsius per 15 minuti.

Successivamente, preparare la soluzione lipidica per la pre-verniciatura sciogliendo il 3% del lipide in una miscela composta da due parti di decano e otto parti di esadecano in volume. Mescolare la soluzione per una notte utilizzando un rotatore. Inoltre, preparare la soluzione lipidica per la formazione della membrana sciogliendo lo 0,1% del lipide nella stessa miscela di due parti di decano e otto parti di esadecano in volume.

Mescola questa soluzione anche per una notte su un rotatore. Per preparare un film sottile PDMS, mescolare nove parti di prepolimero con una parte di agente indurente in una tazza di miscelazione. Mettere cinque grammi di questa miscela in una capsula di Petri e centrifugare la teglia a 800 giri/min per 10 secondi per formare una pellicola spessa da 200 a 250 micron.

Quindi, posizionare la capsula di Petri in un essiccatore sottovuoto e tirare un vuoto di 100 millitorr per due ore per rimuovere le bolle d'aria residue. Quindi, cuocere il film sottile in forno per cinque ore a 70 gradi Celsius per polimerizzare il PDMS. Una volta raffreddato, tagliare il film sottile polimerizzato in quadrati di due centimetri per due centimetri e utilizzare un punzone di 500 micron di diametro per creare una piccola apertura al centro del quadrato.

Quindi, utilizzare una micropipetta per predipingere le aperture con un microlitro della soluzione lipidica al 3%. Per creare la camera a membrana lipidica nera, è necessario progettare due blocchi simmetrici per la camera utilizzando un software di disegno 3D. Quindi, fabbricare la camera utilizzando un blocco di PTFE e una macchina CNC.

Per assemblare la camera, posizionare il film sottile PDMS preverniciato tra i due blocchi di PTFE, in modo tale che l'apertura sul film sottile PDMS sia centrata con il foro nella camera. Utilizzare vetro di copertura e grasso sottovuoto per sigillare i bordi esterni della camera. Una volta sigillata, immobilizzare la camera assemblata utilizzando dadi e bulloni.

È importante assicurarsi che la camera sia ben sigillata in modo che non vi siano perdite di liquido. Utilizzando una pipetta, depositare 0,5 microlitri della soluzione lipidica allo 0,1% sull'apertura del film sottile PDMS, assemblato con la camera. Quindi, posizionare la camera in un ambiente raffreddato a una temperatura inferiore a 10 gradi Celsius e conservarla fino al momento del bisogno.

Per formare una membrana lipidica nera con autoassemblaggio accelerato, estrarre la camera dal frigorifero e aggiungere due millilitri di soluzione tampone su ciascun lato della camera. Mettere da parte la camera per 10 minuti fino a quando il precursore della membrana congelato non si scongela. Quindi, posizionare la camera su un micromanipolatore per controllare con precisione l'elevazione rispetto alla sorgente luminosa e al microscopio.

Utilizzando un illuminatore alogeno a fibre ottiche, illuminare un lato della camera per illuminare l'apertura del film sottile PDMS. Dall'altro lato, posiziona un obiettivo 20x in linea con l'apertura e osserva il centro dove il colore diventa più luminoso dell'anulus. Per la misurazione elettrica, preparare gli elettrodi di cloruro d'argento ponendo un filo d'argento di 208 micrometri di spessore in una soluzione di ipoclorito di sodio per almeno un minuto.

Quindi, collegare gli elettrodi a un amplificatore per microelettrodi. Quindi, posizionare gli elettrodi di cloruro d'argento su ciascun lato della camera, in modo che si trovino nella soluzione tampone. Utilizzando un software di elettrofisiologia, applicare una forma d'onda triangolare da 10 millivolt attraverso la membrana per acquisire un'onda quadra.

Registrare le proprietà elettriche della membrana facendo clic sul pulsante di registrazione. Continuare la registrazione fino a quando non si osserva un'onda quadra uniforme. Quindi, esci dalla registrazione facendo clic sull'icona del quadrato nero.

Due metodi possono essere impiegati per incorporare la gramicidina A nel doppio strato lipidico. In primo luogo, la gramicidina A può essere aggiunta direttamente alla soluzione lipidica prima di stendere la soluzione lipidica sull'apertura del film sottile PDMS. In secondo luogo, la soluzione di gramicidina A può essere aggiunta alla camera quando si forma un doppio strato lipidico.

Per osservare le attività del canale della gramicidina A, applicare 100 millivolt attraverso la membrana a una frequenza di campionamento di 5 kilohertz per misurare il potenziale di tenuta della membrana. Registrare le proprietà elettriche come fatto in precedenza, facendo clic sul pulsante di registrazione. Man mano che vengono mostrate le attività dei canali ionici, continuare a registrare fino a quando non si osservano vari salti di corrente per confermare l'incorporazione dei canali ionici.

Una volta confermato, esci dalla registrazione facendo clic sull'icona del quadrato nero. Al termine della registrazione, filtrare i dati con un filtro di bessel passa-basso a 100 hertz utilizzando un software di elettrofisiologia. Osservare i salti di corrente nei dati filtrati sul potenziale di mantenimento.

Questi salti rappresentano la dimerizzazione di un canale ionico della gramicidina A. Quando il precursore di membrana congelato è stato portato a temperatura ambiente per scongelare, la formazione del doppio strato lipidico è facilitata dall'estrazione del solvente idrofobico nel film sottile PDMS. Questa sequenza di immagini mostra la formazione di un doppio strato lipidico, che si autoassembla quando viene riscaldato dalla sua forma congelata.

Qui, la conduttanza elettrica illustra l'incorporazione e la dimerizzazione della gramicidina A.Dopo la dimerizzazione, la gramicidina A forma un canale ionico e i livelli di conduttanza salgono a 28 picosiemi, il che è coerente con i risultati dei rapporti precedenti e mostra l'incorporazione immediata di questo antibiotico nel doppio strato. La nostra tecnica di formazione della membrana fornisce un potente strumento per lo studio della membrana cellulare e dei nanocanali, in contrasto con le tecniche convenzionali che hanno un potenziale limitato per l'applicazione pratica. Il nostro sistema non richiede alcuna esperienza né per la formazione della membrana né per l'incorporazione dei canali ionici, il che lo rende adatto per lo screening di farmaci e le applicazioni di biorilevamento.