Name: Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Impara la formazione automatizzata di doppi strati lipidici utilizzando film sottili di polidimetilsilossano. Questo metodo riproducibile facilita lo studio delle interazioni membrana-proteina nei nanobiosensori.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato supportato dal Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) e dalle sovvenzioni della National Research Foundation (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) dalla National Research Foundation of Korea. Questo lavoro è stato anche parzialmente sostenuto dalla borsa di ricerca dell'Università di Inha.

1. Soluzione Preparazione <ol><li> Preparazione della soluzione tampone: <ol><li> Per formulare soluzione tampone, sciogliere 1 M KCl (cloruro di potassio), 10 mM Tris-HCl (Tris-cloridrato), e 1 mM EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) in acqua distillata e regolare il pH a 8,0. </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro di 0.20 micron. Per sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> Preparazione della soluzione lipidica per la pre-quadro: <ol><li> Per formulare la soluzione lipidica per preverniciatura, sciogliere 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) lipidi (w: v) in una miscela di 2: 8 n decano ed esadecano (v: v). Mescolare durante la notte utilizzando un rotatore. </li></ol></li><li> Preparazione della soluzione lipidica per la formazione della membrana: <ol><li> Per formulare la soluzione lipidica per la formazione della membrana, sciogliere 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) lipidi (w: v) in una miscela di 2: 8 squalene ed esadecano (v: v). Mescolare durante la notte utilizzando un rotatore. </li></ol></li></ol> 2. Formazione di un PDMS a film sottile <ol><li> Mescolare PDMS e il catalizzatore in un rapporto di 9: 1 (w / w) in una tazza di miscelazione per formare il prepolimero PDMS. Aggiungere 5 g di PDMS prepolimero ad una piastra di Petri per formare i PDMS pellicola sottile (spessore 200 - 250 micron). Distribuire PDMS pre-polimero usando una spalmatrice centrifuga a 800 rpm per 10 secondi per formare una pellicola sottile. </li><li> Porre la capsula di Petri in un essiccatore sotto vuoto ad una pressione di 100 mTorr per 2 ore per rimuovere le bolle d&#39;aria. Per polimerizzare il film sottile prepolimero, cuocere in forno per 5 ore a 70 ° C. </li><li> Al fine di rendere un PDMS quadrati a film sottile, tagliare il film sottile PDMS polimerizzati in 2 x 2 cm 2 piazze. Utilizzare un 500 micron micro punzone per fare un&#39;apertura nel centro di PDMS film sottile. Aperture pre-vernice con 3% soluzione DPhPC lipidi mescolati in 2: 8 decano n- e esadecano. </li></ol> 3. Fabrication Camera e Assembly <ol><li> Per realizzare la camera di BLM, disegno due blocchi simmetrici della camera utilizzando il software di disegno 3D con dimensioni esterne di 4 cm x 1,5 cm x 1 cm e dimensioni interne pozzetti di 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17. </li><li> Craft la camera utilizzando un blocco di PTFE con una macchina CNC e seguire le istruzioni del produttore. </li></ol> 4. Montaggio Camera <ol><li> Per assemblare la camera, posizionare il film sottile preverniciato-PDMS tra i due blocchi PTFE tale che l&#39;apertura sulla PDMS film sottile è allineato con il foro nella camera. </li><li> Sigillare i bordi esterni della camera con un vetro di copertura con grasso (facilitando l&#39;osservazione ottica). Immobilizzare la camera di assemblata utilizzando dadi e bulloni. NOTA: Assicurarsi che la camera è ben sigillato, in modo che non vi siano perdite di liquido. </li></ol> 5. La formazione di membrana precursore con formazione accellerata di auto-assemblaggio (MPES) <ol><li> Usando una pipetta, depositare 0.5ml di 0,1% DPhPC lipidi mescolato 2: 8 n decano: esadecano sulla apertura della PDMS film sottile assemblato con la camera. </li><li> Prima dell&#39;uso, conservare la camera in un congelatore o frigorifero di sotto 10 ° C. </li></ol> 6. formazione della membrana e di verifica <ol><li> Per formare una BLM con MPES, prelevare la camera dal frigorifero e sospendere 2 ml di soluzione tampone in ciascun lato della camera. Impostare la camera da parte per &lt;10 minuti fino a quando il precursore di membrana congelato si scioglie. </li><li> Posizionare la camera su un micromanipolatore per controllare con precisione l&#39;elevazione rispetto alla sorgente luminosa e il microscopio. Illuminare un lato della camera di come fonte di luce con un alogeno a fibre ottiche illuminatore per illuminare l&#39;apertura dei PDMS a film sottile per l&#39;osservazione ottica del processo di formazione BLM. </li><li> D&#39;altro lato, collocare un microscopio digitale verticalmente rispetto alla sorgente di luce per osservare la formazione BLM (ingrandimento da 200X). </li><li> Per confermare la formazione BLM, osservare il centro dell&#39;apertura dove il colore diventa più luminoso del annulus. </li></ol> 7. registrazione elettrica <ol><li> Per la misurazione elettrica, preparare elettrodi Ag / Cl con un filo d&#39;argento 208 micron di spessore e candeggina in ipoclorito di sodio per&gt; 1 min. Posizionare gli elettrodi Ag / Cl in ogni lato della camera abbastanza profonda da essere immersa nella soluzione tampone. </li><li> Collegare gli elettrodi all&#39;amplificatore microelettrodo. Utilizzando il software elettrofisiologia, applicare una forma d&#39;onda triangolare mV ± 10 attraverso la membrana di acquisire un&#39;onda quadra. Impostare l&#39;applicazione di tensione facendo clic sulle frecce indicate su V_clamp (mV). </li><li> Registrare le proprietà elettriche della membrana facendo clic sul pulsante di registrazione (icona rossa dot). Procedere con la registrazione fino a quando si osserva un&#39;onda quadra uniforme. Uscire la registrazione facendo clic sull&#39;icona quadrato nero. </li></ol> 8. Ion Canale incorporazione NONE: Gramicidin A (GA) l&#39;incorporazione avviene spontaneamente sulla formazione di BLM, come si aggiunge GA direttamente alla soluzione dei lipidi. <ol><li> Per osservare le attività di canale ga, applicare 100 mV attraverso la membrana ad una frequenza di campionamento di 5 kHz per misurare il potenziale della membrana tenuta. Impostare l&#39;applicazione di tensione facendo clic sulle frecce indicate su V_clamp (mV). </li><li> Registrare le proprietà elettriche del costituzione gA facendo clic sul pulsante di registrazione (icona rossa dot). Proseguire la registrazione fino a quando si osserva salti di corrente. Uscire la registrazione facendo clic sull&#39;icona quadrato nero. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione dei dati elettrici, filtrare i dati con un filtro passa-basso Bessel a 100 Hz utilizzando un software di elettrofisiologia. </li><li> Osservare i salti di corrente nella tenuta dei dati potenziali filtrata (ogni salto corrente, ~ 0,15 ns, rappresenta dimerizzazione di un canale ionico GA) per verificare gA incorporazione. </li></ol>

<ol><li>Hanke, W., Schulue, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Planar+lipid+bilayers%3A+methods+and+applications%22">Planar lipid bilayers: methods and applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+planar+lipid+bilayer+membranes+for+rapid+screening+of+membrane+active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds.</a> Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).</li>
<li>Bayley, H., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensors+inspired+by+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensors inspired by biology.</a> Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).</li>
<li>Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+microarrays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).</li>
<li>Majd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biological+pores+in+nanomedicine%2C+sensing%2C+and+nanoelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).</li>
<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biomimetic+Membranes+and+Their+Sensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications.</a> Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Ion+Channel+Activities+of+Gramicidin+A+in+the+Presence+of+Ionic+Liquids+Using+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamping+by+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Patch clamping by numbers.</a> Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).</li>
<li>Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cell+membrane+structure+in+vitro+and+its+transformation+into+an+excitable+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.</a> Nature. 194, 979-980 (1962).</li>
<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).</li>
<li>Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+microelectrode-cavity+array+for+high-resolution+and+parallel+electrical+recording+of+membrane+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents.</a> Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).</li>
<li>Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+gel-bilayer+channel+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater.+Opt.+Electron%22%5BJournal%5D)">A robust gel-bilayer channel biosensor.</a> Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).</li>
<li>Ide, T., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+lipid+bilayer+formed+on+an+agarose-coated+glass+for+simultaneous+electrical+and+optical+measurement+of+single+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).</li>
<li>Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-encapsulated+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-encapsulated lipid membranes.</a> J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).</li>
<li>Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Lived+Planar+Lipid+Bilayer+Membranes+Anchored+to+an+In+Situ+Polymerized+Hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel.</a> Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storable+and+shippable+lipid+bilayer+membrane+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform.</a> Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Lipid+Membrane+Formation+Using+a+Polydimethylsiloxane+Film+for+Ion+Channel+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements.</a> Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).</li>
<li>Yaws, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaws%2C+C+%22Chemical+Properties+Handbooks%3A+Physical%2C+Thermodynamic%2C+Environmental%2C+Transport%2C+Safety%2C+and+Health+Related+Properties+for+Organic+and+Inorganic+Chemicals%22">Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals</a>. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).</li>
<li>Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWindholz%2C+M+%22The+Merck+index.+An+encyclopedia+of+chemicals+and+drugs%22">The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs</a>. , Merck & Co. (1976).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+C+%22Ion+Channel+Reconstitution%22">Ion Channel Reconstitution</a>. , Springer Science & Business Media. (1986).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-state+substructure+of+single+chloride+channels+from+Torpedo+electroplax%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).</li>
<li>Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capacity+of+black+lipid+films+and+of+lipid+bilayers+made+from+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).</li>
<li>Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+requirements+for+membrane-glass+adhesion+and+giga+seal+formation+in+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording.</a> Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La nostra tecnica di formazione BLM fornisce un potente strumento per lo studio della membrana cellulare e dei canali ionici, in contrasto con le tecniche convenzionali che hanno un potenziale limitato per l'uso industriale. Abbiamo sviluppato un precursore di membrana utilizzando un film sottile PDMS e abbiamo ideato un precursore di membrana congelato con autoassemblaggio accelerato.
A differenza dei metodi convenzionali di formazione della membrana con film idrofobici, in cui la formazione ...

Artificial doppio strato lipidico della membrana, o nero membrana lipidica (BLM), è un importante strumento per chiarire i meccanismi di membrane cellulari e canali ionici, nonché per comprendere le interazioni tra canali ionici e ioni / molecole. 1-7 Sebbene il metodo patch-clamp è spesso considerato il gold standard per gli studi di membrana cellulare, è laborioso e richiede agli operatori altamente qualificati per le misure di canali ionici. 8 Mentre ricostituite artificialmente membrane doppio strato lipidico sono emersi come strumenti alternativi per gli studi dei canali ionici, 9,10 essi sono anche associati con laboriosa processi e competenze specifiche. Inoltre, le membrane sono sensibili alle perturbazioni meccaniche. Applicazioni pratiche Quindi, tecnologie doppio strato lipidico introdotte fino ad oggi hanno limitato. 11 Al fine di migliorare la robustezza e la longevità delle membrane doppio strato lipidico, Costello et al. 12, e Ide e Yanagida <sup&gt; 13 ha ideato un doppio strato lipidico free-standing supportato da idrogel. Nonostante una maggiore longevità tuttavia (&lt;24 ore), doppio strato robustezza non è stata migliorata. Jeon et al. 14 ha ideato una membrana incapsulata idrogel (HEM) con contatto intimo doppio strato idrogel-lipidico, con conseguente maggiore longevità (fino a diversi giorni). Per aumentare ulteriormente la durata della HEM, Malmstadt e Jeon et al. Creato una membrana idrogel-incapsulato con legante idrogel-lipidico tramite in-situ covalente coniugazione (cgHEM). 15 In entrambi i sistemi, vite membrana aumentato notevolmente (&gt; 10 giorni) . Tuttavia, i sistemi di formazione membrana non erano sufficientemente robusto, e non possono essere memorizzati o consegnati ove necessario liberare competenze per l&#39;utilizzo dei doppi strati lipidici. Lo sviluppo di una piattaforma di doppio strato lipidico ha ruotato principalmente attorno aumentare la robustezza e la longevità di BLM. Anche se la longevità di BLM è stata substantially migliorata di recente, le loro applicazioni sono state limitate a causa della mancanza di trasportabilità e conservabilità. Per superare questi problemi, Jeon et al. Ha creato un sistema a membrana immagazzinabile e ha introdotto un precursore di membrana (MP). 16 Per costruire un deputato, hanno preparato una miscela di decano n- e esadecano contenente 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) per controllare il punto di congelamento della soluzione lipidica tale che sarebbe congelare a ~ 14 ° C (sotto della temperatura ambiente, sopra la temperatura tipica frigorifero). In questo esperimento, la MP è stato suddiviso in una piccola apertura su una pellicola di politetrafluoroetilene (PTFE) e successivamente congelati in frigorifero a 4 ° C. Quando la MP è stato portato a temperatura ambiente, la MP scongelato e un doppio strato lipidico automaticamente formato, eliminando le competenze tipicamente associati con formazione della membrana. Tuttavia, il tasso di successo di BLM a base di MP era partire da ~ 27%, e formatio membranan tempo era praticamente inesistente (30 min a 24 ore), limitando le sue applicazioni pratiche. In questo studio, un polidimetilsilossano (PDMS) a film sottile è usato al posto di un convenzionale film sottili idrofobiche (PTFE, poliossimetilene, polistirolo) a (a) tempo il controllo di produzione e (b) aumentare il tasso di successo della formazione BLM come precedentemente riportato da Ryu et al. 17 Qui, formazione della membrana è stata facilitata mediante estrazione di solventi a causa della natura porosa del PDMS, e il tempo necessario per la formazione della membrana è stata controllata con successo in questo studio. In questo sistema, come la soluzione lipidica è stata assorbita nella pellicola sottile PDMS, è stato raggiunto un tempo di formazione della membrana coerente. Inoltre, durata della membrana è stata prolungata dovuta ad un lento assorbimento dei solventi nei PDMS film sottile, un risultato dell&#39;aggiunta di squalene alla soluzione lipidica. Abbiamo condotto misure ottiche ed elettriche per verificare che le membrane formate utilizzando questa tecnica sono adatti per isu studi canali.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Per soluzione tampone</td></tr><tr><td>Tris-cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td>Per soluzione tampone</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td>Per soluzione tampone</td></tr><tr><td>n-decano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44074-U</td><td>Per soluzione</td></tr> <tr><td>lipidicaEsadecano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-76-3</td><td>Per soluzione lipidica</td></tr><tr><td>Squalene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3626</td><td>Per soluzione lipidica</td></tr><tr><td>Gramicidina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11029-61-1</td><td>Proteina di membrana</td></tr><tr><td>1,2-difitanol-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td>Per la formazione di membrae</td></tr><tr><td>Kit elastromero Sylgard 184a e 184b</td><td>Dow Corning Asia</td><td></td><td>Per produrre PDMS film sottile</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m filtro</td><td>Satorius stedim</td><td>16534----------K</td><td>Per filtrare la soluzione tampone</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FinePCR</td><td>AG</td><td>Per sciogliere i lipidi in modo omogeneo</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Biofree</td><td>BF-60AC</td><td>Per sterilizzare la soluzione tampone</td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Shinu Mst</td><td>SP-60P</td><td>Per diffondere il prepolimero PDMS</td></tr><tr><td>Disidratatore sottovuoto</td><td>Welch</td><td>2042-22</td><td>Per rimuovere le bolle d'aria in PDMS prepolimero</td></tr><tr><td>500 &mu; m&nbsp; punzone</td><td>Harris Uni-Core</td><td>0.5</td><td>Per creare un'apertura sulla macchina CNC a film sottile</td></tr><tr><td></td><td>PDMS SME trading SME</td><td>2518</td><td>Per fabbricare la camera di formazione della membrana</td></tr><tr><td>Illuminatore alogeno a fibre ottiche</td><td>Motic</td><td>MLC-150C</td><td>Per illuminare l'apertura del film sottile PDMS per l'osservazione ottica</td></tr><tr><td>Microscopio digitale</td><td>blu digitale</td><td>QX-5</td><td>Per osservare otticamente la membrana a doppio strato lipidico formazione</td></tr><tr><td>Elettrodo</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>Per osservare elettricamente la formazione della membrana</td></tr><tr><td>Amplificatore di microelettrodi (amplificatore Axopatch)</td><td>Axon Instruments</td><td>Amplificatore Axopatch 200B</td><td>Per misurare la capacità della membrana (descritto come amplificatore di microelettrodi nel manoscritto)</td></tr></tbody></table>

formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana utilizzando un polidimetilsilossano thin film

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Un doppio strato lipidico artificiale, o nero dei lipidi di membrana (BLM), è un potente strumento per lo studio dei canali ionici e le interazioni delle proteine, così come per le applicazioni di biosensori. Tuttavia, le tecniche convenzionali di formazione BLM hanno diversi svantaggi e che spesso richiedono competenze specifiche e processi laboriosi. In particolare, BLM convenzionali soffrono di bassi tassi di successo di formazione e tempo di formazione della membrana incoerente. Qui, dimostriamo un sistema di formazione BLM immagazzinabile e trasportabile con il tempo diradamento controllato e una maggiore velocità di formazione BLM sostituendo film convenzionalmente utilizzati (politetrafluoroetilene, poliossimetilene, polistirolo) di polidimetilsilossano (PDMS). In questo esperimento, viene utilizzato un polimero poroso strutturato come PDMS film sottile. Inoltre, al contrario di solventi convenzionalmente impiegati con bassa viscosità, l&#39;uso di squalene consentito un tempo diradamento controllato tramite assorbimento lento solvente PDMS, prolungando la vita della membrana. in annunciocondizione, usando una miscela di squalene e esadecano, il punto di congelamento della soluzione lipidica è aumentata (~ 16 ° C), in aggiunta, precursori di membrana sono stati prodotti che possono essere indefinitamente immagazzinato e trasportato facilmente. Questi precursori di membrana hanno ridotto BLM tempo formazione di &lt;1 ora e ha raggiunto un tasso di formazione BLM del ~ 80%. Inoltre, gli esperimenti dei canali ionici con gramicidina A hanno dimostrato la fattibilità del sistema a membrana.

Ottimizzazione di MPES Soluzione Composizione Diverse composizioni di lipidi e solventi sono stati testati con successo per ricostituire le membrane doppio strato lipidico da MPES. Il sistema MP con una miscela di decano n- ed esadecano contenente 3% DPhPC 14 mostrato un basso tasso di successo di formazione della membrana (~ 27%). Inoltre, il film PDMS estratta continuamente soluzione lipidica, era necessario ottimizzare composizione del solve...

Abbiamo dimostrato un, trasportabile sistema di formazione doppio strato lipidico memorizzabili. Una membrana a doppio strato lipidico possono essere formate entro 1 ora con tasso di successo superiore all&#39;80% quando un precursore membrana congelato è portato a temperatura ambiente. Questo sistema consentirà di ridurre i processi laboriosi e competenze associate a canali ionici.

Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è descrivere un metodo utilizzabile per lo studio della formazione automatica di un doppio strato lipidico mediante un film sottile di polidimetilsilossano. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei nanobiosensori riguardo le interazioni tra membrane e proteine. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che la formazione del doppio strato lipidico è automatizzata e riproducibile.Per iniziare, preparare la soluzione tampone mescolando cloruro di potassio, tris idrocloruro ed EDTA in acqua distillata. Successivamente, regolare il pH della soluzione a 8,0. Quindi, filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 micron ed autoclavare la soluzione a 121 gradi Celsius per 15 minuti.Successivamente, preparare la soluzione lipidica per la pre-pittura sciogliendo il 3% del lipide in una miscela costituita da due parti di undecano e otto parti di esadecano in volume. Mescolare la soluzione per tutta la notte utilizzando un agitatore rotante. Inoltre, preparare la soluzione lipidica per la formazione della membrana sciogliendo lo 0,1% del lipide nella stessa miscela di due parti di undecano

automated-lipid-bilayer-membrane-formation-using-polydimethylsiloxane

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Bistrati lipidici supportati e particelle di membrana naturali sono sistemi convenienti che può approssimare le proprietà delle membrane cellulari e di essere incorporati in una varietà di strategie analitiche. Qui mostriamo un metodo per preparare microarray composto da supportati doppio strato lipidico rivestite SiO 2 perline, vescicole di fosfolipidi di membrana o particelle naturali.

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Getto microfluidica contro un doppio strato lipidico interfaccia gocciolina fornisce un modo affidabile per generare vescicole con controllo sulla asimmetria membrana, incorporazione di proteine ​​transmembrana, e incapsulamento del materiale. Questa tecnica può essere applicata a studiare una varietà di sistemi biologici in cui sono determinanti biomolecole compartimenti.

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Presentiamo un protocollo sperimentale per formare un doppio strato lipidico supportato su substrati solidi senza utilizzare vescicole lipidiche. Si dimostra un metodo di uno stadio per formare un doppio strato lipidico di diossido di silicio e oro così come membrane supportate con dominio colesterolo arricchita per varie applicazioni biologiche.

Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

La generazione di doppie emulsioni microfluidiche coinvolge tipicamente dispositivi con bagnabilità modellata o componenti in vetro fabbricati su misura. Qui descriviamo la fabbricazione e il collaudo di un generatore di doppia emulsione interamente in polidimetilsilossano (PDMS) che non richiede trattamenti superficiali o complicati processi di fabbricazione ed è in grado di produrre doppie emulsioni fino a 14 μm.

Doppia Emulsione Generazione Utilizzando un Polidimetilsilossano (PDMS) coassiale flusso fuoco Dispositivo

Solido-supportato, privo di proteine, doppia membrane di doppio strato del fosfolipide (DLBM) possono essere trasformate in reti di nanotube del lipido complessa e dinamica e possono servire come modelli 2D ascendente del reticolo endoplasmico.

Formazione spontanea e riorganizzazione delle reti di Nanotube del lipido artificiale come un modello Bottom-Up per il reticolo endoplasmico

Reportiamo un protocollo per la produzione di una membrana lipidica ibrida all'interfaccia acqua/aria doping il bistrato lipidico con molecole di rame (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-ftatocianina (CuPc). La membrana lipidica ibrida risultante ha una struttura sandwich lipidica/ CuPc / lipidica. Questo protocollo può anche essere applicato alla formazione di altri nanomateriali funzionali.

Auto-assemblaggio di membrane lipidiche ibride drogate con molecole organiche idrofobiche presso l'interfaccia acqua/aria

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Qui viene presentato un protocollo per eseguire e analizzare il legame, la mobilità e l'assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate artificiali utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale a singola molecola (smTIRF).

Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Qui, viene sviluppato un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per fornire una membrana sintetica con una curvatura definita che consente la caratterizzazione di proteine con capacità di rilevamento della curvatura in vitro.

Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

Il presente protocollo descrive l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), una tecnica microfluidica per generare liposomi biocompatibili. OLA produce liposomi monodispersi di dimensioni micron con un incapsulamento efficiente, consentendo una sperimentazione immediata su chip. Si prevede che questo protocollo sia particolarmente adatto per la biologia sintetica e la ricerca sulle cellule sintetiche.

Assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo su chip per la bioingegneria

Questo protocollo presenta una procedura di sformatura migliorata per la tecnica di doppia colata di polidimetilsilossano (PDMS) introducendo olio di silicone come barriera non adesiva tra gli strati PDMS. A differenza del plasma o dei metodi chimici di modifica della superficie, questo approccio non richiede attrezzature specializzate o costose, il che lo rende un'alternativa più accessibile ed economica.

Doppia colata migliorata di polidimetilsilossano (PDMS) tramite trattamento con olio di silicone per la replicazione di microstrutture densamente impacchettate

Impara la formazione automatizzata di doppi strati lipidici utilizzando film sottili di polidimetilsilossano. Questo metodo riproducibile facilita lo studio delle interazioni membrana-proteina nei nanobiosensori.

Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

Esplora altri video