Name: Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Impara a implementare la microscopia CARS per l'imaging senza marcatori di cellule viventi utilizzando laser Ti:zaffiro e OPO. Questa tecnica chimicamente selettiva si integra facilmente nei microscopi standard per studi biologici e neuroscientifici.

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Gli autori ringraziano il Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, Francia) per il prestito dell'oscilloscopio veloce e ringraziano il sostegno finanziario di Montpellier RIO Imaging (MRI). HR riconosce che ANR concede a France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) e France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) le reti infrastrutturali per sviluppi coerenti dell'imaging Raman. Questo lavoro è stato sostenuto principalmente da una sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca (FP7-IDEAS-ERC 311610) e da una sovvenzione INSERM - AVENIR a NT.

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<li>Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+and+applications+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology.</a> Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).</li>
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<li>Monsma, P. C., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoroMyelin+Red+is+a+bright%2C+photostable+and+non-toxic+fluorescent+stain+for+live+imaging+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin.</a> J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).</li>
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<li>Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chasing+lipids+in+health+and+diseases+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vib.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La parte più impegnativa del lavoro è la sincronizzazione temporale dei raggi laser. Richiede un fotodiodo veloce combinato con un oscilloscopio veloce, ma solo una sovrapposizione ruvida nel tempo può essere eseguita in un primo momento. Poi è necessario un ulteriore aggiustamento di pochi cm. Infine, micrometro si muove da una fase di traslazione lineare permette di eseguire la regolazione fine definitiva della lunghezza della linea di ritardo al fine di innescare il segnale AUTO. Questo segnale viene mantenuto in un ...

La microscopia ottica è diventata una tecnica importante per la visualizzazione non distruttiva dei processi dinamici nei sistemi biologici viventi con una risoluzione sub-cellulare. Microscopia a fluorescenza è attualmente il contrasto delle immagini più popolare usato in cellule vive per la sua elevata specificità e sensibilità 1. Una grande tavolozza di sonde fluorescenti è emerso (coloranti esogeni, proteine ​​geneticamente codificate, nanoparticelle di semiconduttori). Varie tecniche fluorescenti a base di illuminazione del campione sono fiorite (ad esempio la microscopia confocale o due fotoni) per eseguire l&#39;imaging 3D e ridurre un inconveniente principale di questa tecnica che viene photobleaching 2. Altre limitazioni includono il requisito di etichettatura fluoroforo perché la maggior parte delle specie molecolari non sono intrinsecamente fluorescenti e quindi questi fluorofori essere introdotto artificialmente nel campione esaminato. Questa manipolazione artificiale può essere dirompente soprattutto per le piccole molecole o induce pentolaziale foto-tossicità. Queste ragioni rendono la fluorescenza non microscopia adatto per vivo in-osservazioni. Quindi, l&#39;uso di tecniche di imaging ottico con elevata sensibilità e contrasto molecolari specifici senza l&#39;uso di molecole fluorescenti è altamente auspicabile nella scienza biomedica. Diverse tecniche di imaging ottici non lineari senza etichettatura o colorazione sono emersi, tra seconda armonica generazione (SHG) 3,4 e la generazione di terza armonica (THG) 5. SHG microscopio è stato utilizzato per dispositivi strutturali immagine a livello sopramolecolare quali microtubuli o collagene 6. THG è generato dalla eterogeneità ottici quali interfaccia tra un mezzo acquoso e lipidi 7. THG è stato dimostrato anche per l&#39;immagine mielina 8,9. Entrambe le tecniche possono essere implementate su un microscopio a fluorescenza a due fotoni e richiedono solo raggio laser. Tuttavia essi richiedono intensità del laser ad alta potenza (tipicamente 50mW a 860 nm per SHG 10, 25 - 50 mW a 1.180 nm per THG 9), che è deleterio in campioni di vita, e non forniscono la specificità chimico che è necessario per inequivocabilmente immagine strutture biologiche specifiche. Chimicamente immagini selettiva può essere ottenuta da segnali di vibrazione molecolari intrinseche basate su Raman. Quando un fascio di luce colpisce la materia, i fotoni possono essere assorbiti e dispersi da atomi o molecole. La maggior parte dei fotoni sparsi avranno la stessa energia, cioè, la frequenza, come i fotoni incidenti. Questo processo è chiamato scattering di Rayleigh. Tuttavia, un piccolo numero di fotoni saranno disperse ad una frequenza ottica diversa dalla frequenza dei fotoni incidenti, cioè un processo di scattering anelastico chiamato Raman. La differenza di energia proviene dalla eccitazione di modi vibrazionali seconda struttura molecolare e ambiente. Pertanto, Raman spontanea dispersione providi di imaging chimicamente selettivo come molecole diverse hanno specifiche frequenze vibrazionali. Tuttavia è limitato a causa del suo segnale estremamente debole. Confocal microscopia Raman è stato sviluppato e fornisce risoluzione spaziale 3D, ma richiede media alta potenza ed acquisizione lungo 11. Per superare queste difficoltà, i recenti progressi nella tecnologia laser hanno permesso la nascita della microscopia vibrazionale ottica non lineare, in particolare coerente dispersione anti-Stokes Raman (CARS) 11,12,13. Cars è un processo ottico non lineare del terzo ordine. Tre raggi laser, composto da un fascio di pompa a ω frequenza P, un fascio Stokes alla frequenza ω S e un fascio sonda (più spesso riconducibile pompa) sono focalizzati in un campione e generano un fascio di anti-Stokes a frequenza ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. Il segnale anti-Stokes può essere notevolmente migliorata quando la differenza di frequenzatra la pompa ed il Stokes travi è sintonizzata una Raman molecolare vibrazioni Ω R = (ω P - ω S). segnale CARS si basa sull&#39;interazione multipla fotone. Esso genera pertanto un coerente ordini di grandezza più forte di Scattering Raman spontanea di segnale. AUTO microscopio è stato dimostrato sperimentalmente da Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Migliorato poi la tecnica, utilizzando due fasci laser focalizzati femtosecondi vicino infrarosso con una lente obiettivo di alta apertura numerica, permettendo la condizione di accordo di fase di autoveicoli e evitando i due fotoni sfondo non risonante 16. CARS microscopia ha quindi emerso come un potente strumento per l&#39;imaging cellulare e dei tessuti dal vivo, rilevando chimicamente molecole come lipidi (tramite vibrazioni CH tratto) 17,18, acqua (attraverso OH tratto vibrazioni), proteine, DNA nelle cellule vive 19,20 ma anche deuterato composto chimicos per farmaceutiche 21 e applicazioni cosmetiche 22. La maggiore limitazione della microscopia non lineare deriva dalla complessità e il costo delle sorgenti ottiche. Un sistema AUTO richiede due laser sintonizzabili lunghezza d&#39;onda con durate di impulso breve e con treni di impulsi temporalmente e spazialmente sincronizzati. Automobili in anticipo microscopi erano basati su due picosecondo sincronizzato Ti: zaffiro laser 20. AUTOMOBILI di imaging è stato ottenuto anche da un singolo femtosecondi laser Ti: zaffiro generare una fonte di luce supercontinuo 23. Recentemente, sorgenti laser composti da un unico femtosecondi laser Ti: zaffiro pompare un sintonizzabile ottici oscillatori parametrici (OPO) sono stati utilizzati per la microscopia AUTOMOBILI. Questa configurazione permette intrinsecamente temporalmente sincronizzato travi con una differenza di frequenza tra la pompa e il fascio Stokes copre l&#39;intero spettro vibrazionale molecolare 24. Inoltre, microscopi a scansione laser basata su un fatturatoKEY Laser FS e un OPO, utilizzato principalmente per due fotoni di fluorescenza (TPF) sono ora disponibili per i non-fisici. Il potenziale di questi set-up può essere notevolmente migliorata senza richiedere investimenti supplementari per l&#39;incorporazione di altri imaging ottico non lineare, dal momento che ogni non lineare (NLO) modalità di imaging è sensibile alle strutture o molecole specifiche. L&#39;imaging multimodale NLO sfrutta quindi il potenziale di NLO microscopia per i campioni biologici complessi 25. L&#39;accoppiamento di queste tecniche ha permesso l&#39;indagine di molte questioni biologiche, in particolare sul metabolismo lipidico, pelle o cancro di sviluppo 26, lo sviluppo muscolare scheletrico 27, 28 lesioni aterosclerotiche. Inoltre, l&#39;implementazione di scansione a raggio laser con CARS dà la possibilità di imaging ad alta frequenza, cioè, uno strumento attraente per studiare processi dinamici in vivo. Lo scopo di questo lavoro è quello di mostrare ogni passo per implementare ttecnica che CARS su un microscopio a scansione laser multifotonica standard. Il microscopio è basato su Ti fsec: laser zaffiro ed un OPO (pompato dal Ti: zaffiro laser) azionato da un software per biologi. L&#39;integrazione è stata effettuata regolando la lunghezza di uno dei percorso del raggio laser per sincronizzare nel tempo i due fasci. Descriviamo l&#39;implementazione passo-passo di questa tecnica, che richiede soltanto background basic in ottica sperimentali. Illustriamo anche CARS Imaging ottenuti su guaine mieliniche del nervo sciatico di roditori, e mostriamo questo l&#39;imaging può essere eseguito simultaneamente con altri imaging ottico non lineare, come ad esempio la tecnica della fluorescenza a due fotoni di serie e di seconda armonica generazione.

<table><tbody><tr><td>Oscilloscopio</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 MHz&nbsp;</td></tr><tr><td>Fotorivelatore</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1.700 nm</td></tr><tr><td>Laser Ti:Sapphire Chameleon Ultra Family II</td><td>Oscillatore</td> ottico parametrico coerente <td></td><td></td></tr><tr><td>OPO Compact Family</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Examiner microscopio LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Periscopio motorizzato</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo W Plan-Apochromat 20X/1.0</td><td>Carl Zeiss</td> Combinatore di fasci Carl Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td>Modulatore acusto-ottico</td><td>Carl Zeiss</td> Attenuatore di potenza OPO Carl Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomoltiplicatore</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> filtri</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 nm; 500 - 550&nbsp; Nm; 465 - 610&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Lunghezza d'onda di taglio 760&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Specchi d'argento</td><td>Newport</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&lambda;/10, 480 - 20.000&nbsp; nm, Quantità 4</td></tr><tr><td>Stadio di traslazione monoassiale con micrometro standard</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>Quantità 1</td></tr><tr><td>Breadboard in alluminio</td><td>Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>Quantità 1</td></tr><tr><td>Supporto per specchio</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>Quantità 4</td></tr><tr><td>Porta specchio per &Oslash; Ottica da 1"</td><td>Thorlabs</td><td>MH25</td><td>Quantità 4</td></tr><tr><td>diaframmi a iride&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>Quantità 3</td></tr><tr><td>Scatola protettiva</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>Quantità 1</td></tr><tr><td>Pali ottici</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>Quantità 8 (lunghezze a seconda della configurazione)</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda 661 - 690 nm</td> Filtro passa-banda a banda singola <td>Semrock</td><td>676/29 nm BrightLine® Quantità</td><td>1</td></tr><tr><td>Perline fluorescenti</td><td>ThermoFisher</td><td>TetraSpeck&trade; Microsfere fluorescenti Kit</td><td></td>di dimensioni Scheda</tr><tr><td>di visualizzazione laser</td> Thorlabs <td>Scheda di visualizzazione laser IR</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di sicurezza laser</td><td>Newport</td><td>LV-F22. P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromielina&commercio; Colorazione mielinica fluorescente rossa&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>F34652</td><td></td></tr></tbody></table>

implementazione di un sistema coerente anti-stokes raman scattering (cars) su un ti: zaffiro e opo laser basata su standard laser scanning microscope

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

La scansione laser microscopi conciliano un femtosecondi laser Ti: zaffiro e un ottica oscillatore parametrico (OPO) per duplicare la linea laser si sono resi disponibili per i biologi. Questi sistemi sono progettati principalmente per microscopia di fluorescenza a due fotoni multicanale. Tuttavia, senza alcuna modifica, complementare microscopia ottica non lineare come seconda armonica generazione (SHG) o terza generazione armonica (THG) può essere eseguita anche con questo set-up, permettendo l&#39;imaging libera-label di molecole strutturate o medio acquosa interfacce di lipidi. Queste tecniche sono adatti per l&#39;osservazione in vivo, ma sono limitate in specificità chimica. Chimicamente immagini selettiva può essere ottenuta da segnali di vibrazione intrinseche basate su Raman. Confocale microscopia Raman fornisce una risoluzione spaziale in 3D, ma richiede elevata potenza media e tempo di acquisizione a lungo. Per superare queste difficoltà, i recenti progressi nella tecnologia laser hanno permesso lo sviluppo della microscopia vibrazionale ottica non lineare, in particolare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS). CARS microscopia ha quindi emerso come un potente strumento per l&#39;imaging cellulare biologica e dal vivo, da lipidi chimicamente mappatura (attraverso la vibrazione CH tratto), acqua (attraverso OH tratto vibrazioni), proteine ​​o DNA. In questo lavoro, si descrive l&#39;applicazione della tecnica di automobili su un microscopio a scansione laser multifotonica OPO-accoppiato di serie. Essa si basa sulla sincronizzazione nel tempo delle due linee laser regolando la lunghezza di uno dei percorso del raggio laser. Presentiamo un&#39;implementazione passo-passo di questa tecnica su un sistema multiphoton esistente. Un fondo di base ottica sperimentale è disponibile e il sistema presentato non richiede attrezzature supplementari costose. Illustriamo anche CARS di imaging ottenuti su guaine mieliniche del nervo sciatico di roditori, e dimostriamo che questa immagini può essere eseguito simultaneamente con altri imaging ottico non lineare, come ad esempio t di seriewo-photon tecnica a fluorescenza e la generazione di seconda armonica.

<html> La frequenza treno di impulsi di Ti di serie: laser zaffiro è tipicamente intorno a 80 MHz. Il OPO ha la stessa frequenza in quanto è pompato dal Ti: zaffiro laser. è pertanto necessario un oscilloscopio veloce di almeno 200 MHz. Un fotodiodo veloce nella gamma è richiesta anche 600 a 1.100 nm. Lo spostamento temporale massima si verifica quando il Ti: zaffiro ed i segnali OPO sono spostati di 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 nanosecondi. Essa corrisponde a un cambiamento di pe...

Coherent dispersione anti-Stokes Raman (CARS) microscopia a base di vibrazione intrinseca di obbligazioni molecola permette chimicamente selettivo imaging cellulare dal vivo senza etichetta. Questo lavoro presenta l&#39;implementazione di una tecnica di microscopia complementare su un microscopio a scansione laser multifotone standard basato su un femtosecondi laser Ti: zaffiro ed un laser OPO.

Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

L'obiettivo generale di questa procedura è implementare una tecnica complementare di microscopia chiamata CARS, che consente un'immagine senza etichette, selettiva dal punto di vista chimico e in vita su un microscopio standard a scansione laser a fotoni multipli basato su un laser al titanio-zaffiro femtosecondo e un oscillatore parametrico ottico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia o delle neuroscienze, come la comprensione delle malattie correlate ai lipidi, dei meccanismi di penetrazione cutanea o dei disturbi della pelle. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è facile da implementare su un microscopio standard a scansione laser basato su laser Ti:Sapphire e OPO.Il procedimento sarà dimostrato da Hassan Boukhaddaoui, ricercatore associato e responsabile della piattaforma di imaging del laboratorio, e da Vasyl Mytskaniuk. Accendere i laser a titanio-sapphire e OPO come descritto nel protocollo testuale. Accendere il computer del microscopio.Accendere gli interruttori dei componenti del microscopio. Avviare il software facendo doppio clic sull'icona presente sul desktop e configurarlo seguendo il protocollo descritto. Successivamente, posizionare un mirror dicromatico con una lunghezza d'onda di cutoff a 760 nanometri nello slider del porto laterale.Individuarlo nello spazio all'infinito sopra il portaobiettivi. Impostare il filtro passa-banda stretto e il cubo riflettore davanti a PMT1 per registrare esclusivamente il segnale CARS a 670 nanometri, al fine di riprodurre i risultati presentati. Successivamente, posizionare filtri passa-banda stretti specifici davanti a PMT3 per l'osservazione della fluorescenza della mielina e davanti a PMT4 per l'osservazione di SHG.Nel software, impostare il segnale sul rilevatore mediante un filtro passa-banda ad hoc. Aprire lo strumento del percorso luminoso nel menu del gestore di configurazione nella scheda di acquisizione, quindi attivare il PMT desiderato e selezionare un colore per il canale. Ad esempio, utilizzare il verde per CARS e il magenta per SHG.I due fasci che provengono dallo stesso laser al titanio zaffiro non sono sincronizzati quando raggiungono il microscopio, poiché il fascio OPO subisce un ritardo durante la sua generazione. Seguire questa procedura per risincronizzarli regolando la lunghezza di uno dei percorsi del fascio laser mediante l'inserimento di una linea di ritardo. È richiesto l'uso di un fotodiodo veloce e di un oscilloscopio veloce.Per prima cosa, utilizzando cavi BNC, collegare il canale di ingresso CH1 dell'oscilloscopio all'uscita elettrica BNC di sincronizzazione del laser. Successivamente, collegare il canale di ingresso CH2 al fotodiodo. Quindi, selezionare il canale CH1 come trigger premendo il pulsante del menu di trigger, poi il pulsante del menu principale denominato source e infine il pulsante del menu laterale corrispondente al canale selezionato come CH1.Ora posizionare e fissare con supporti ottici al fotodiodo nel piano focale di un obiettivo microscopico a immersione in aria 10x. Nello strumento Canali, impostare la lunghezza d'onda del laser al titanio-saffio a 830 nanometri a bassa potenza, inferiore all'1% della potenza massima. Nello strumento Modalità di acquisizione, ridurre l'area di scansione a un singolo punto in modo da illuminare il fotodiodo con il fascio più piccolo possibile.Quindi attivare la scansione laser facendo clic sul pulsante continuo. Premere Autoset sull'oscilloscopio e spostare manualmente il fotodiodo per ottenere un treno di impulsi sullo schermo dell'oscilloscopio. Premere il pulsante esecuzione/fermo per bloccare la visualizzazione.Successivamente, spegnere la scansione del laser a titanio-sapphire. Nel software, fare clic sullo strumento Canali, deselezionare il laser a 830 nanometri e impostare il segnale OPO a 1107 nanometri e bassa potenza. Quindi accendere la scansione del laser OPO, registrare le serie di impulsi del laser OPO sull'oscilloscopio e spegnere la scansione del laser OPO.Ora, confronta lo spostamento temporale tra i segnali del titanio-zaffiro e quelli dell'OPO. Calcola la lunghezza della linea di ritardo, che verrà utilizzata per posizionare gli specchi. Prima di procedere, indossa gli occhiali di sicurezza e rimuovi eventuali bracciali a catena o orologi dai polsi.Ora, aprire il percorso del laser a titanio-saffio dove verrà implementata la linea di ritardo rimuovendo i tubi protettivi. Quindi selezionare una lunghezza d'onda nell'intervallo del visibile in modo da poter osservare facilmente il fascio laser, ad esempio 700 nanometri a bassa potenza, e accendere la scansione del laser. Ora inserire due diaframmi a iride nel percorso laser aperto utilizzando i supporti ottici.Posizionare un diaframma ad iride all'uscita della linea di ritardo e l'altro all'ingresso del periscopio. Successivamente, ridurre l'apertura del diaframma ad iride e regolare le posizioni del diaframma in modo da adattarle al percorso del fascio laser, quindi fissarli sul tavolo ottico. Infine, regolare la posizione verticale di un terzo diaframma ad iride mobile.Le diaframmature di dimensione saranno utilizzate come controllo per la procedura di riallineamento, al fine di verificare la posizione del fascio laser durante il posizionamento successivo dei quattro specchi della linea di ritardo. Posizionare ora lo specchio M1 su un supporto cinematico compatto per specchi all'ingresso della linea di ritardo e regolarne la posizione e l'orientamento per mantenere l'altezza del fascio, utilizzando la diaframmatura ad iride mobile. Successivamente, posizionare gli specchi M2 e M3 a 90 gradi sulla fase di traslazione in base alla lunghezza calcolata della linea di ritardo e regolarne l'orientamento mediante la diaframmatura ad iride mobile.Posizionare M4 all'uscita della linea di ritardo, appena prima dell'iride, e regolare con attenzione la sua posizione e angolazione in modo da adattare il percorso del fascio laser attraverso i due diaframmi a iride fissi. Posizionare ora la scheda di visualizzazione del laser all'uscita dell'obiettivo del microscopio e verificare il profilo del fascio laser. Se necessario, regolare leggermente l'orientamento di M4 per osservare un disco luminoso uniforme.Infine, riposizionare il fotodiodo veloce al di sotto del fascio laser nel piano focale del campione. Successivamente, osservare lo spostamento temporale tra il fascio laser al titanio-saffio e il fascio OPO sull'oscilloscopio. Se necessario, modificare la lunghezza della linea di ritardo spostando l'intero stadio di traslazione per sincronizzare gli impulsi.L'overlap spaziale dei due fasci necessari per un segnale CARS si ottiene visualizzando delle perle di polistirene fluorescenti fissate su un vetrino. Mettere a fuoco le perle utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua da 20x. A questo punto, nello strumento Canali della scheda di acquisizione, aggiungere una traccia uno, oppure utilizzare la traccia esistente.Selezionare la lunghezza d'onda di 830 nanometri e potenza bassa per il fascio laser al titanio-saffio. Impostare il colore su verde nella casella della traccia uno della finestra Canali e nella casella PMT3 o PMT4 della finestra del percorso luminoso. Successivamente, aggiungere la traccia due per il fascio laser OPO e impostare la lunghezza d'onda a 1107 nanometri e potenza bassa.Imposta il colore su rosso nella casella della traccia due della finestra Canali e nella casella PMT3 o PMT4 della finestra del percorso della luce. Seleziona ora l'area massima di scansione e regola il guadagno di entrambe le tracce a 600. Applica quindi in sequenza la scansione dei due fasci sul campione facendo clic su continuo.Osservare l'immagine nell'area dello schermo nella vista 2D. Aumentare la potenza di entrambi i laser. Se necessario, spostare leggermente il cursore di messa a fuoco per trovare il piano di fuoco delle perle.Infine, regolare il ritaglio e ingrandire l'immagine su una singola perla o su un gruppo di perle adiacenti. Successivamente, utilizzare il controller del periscopio per sovrapporre i fasci nel piano XY. Nel software, aprire la scheda Maintain.Fare clic sulle opzioni del sistema e visualizzare la finestra dello strumento periscopio motorizzato. Ulteriori dettagli sono discussi nel protocollo testuale. Dopo il sovrapposizione delle immagini provenienti dai due fasci laser, si ottiene la sincronizzazione.Per ottenere l'aggiustamento temporale preciso per attivare il CARS, preparare un vetrino con una goccia di olio d'oliva e un coperchio. Quindi, utilizzando un obiettivo a immersione in acqua da 20x, mettere a fuoco il bordo del coperchio. A questo punto, sulla traccia uno, impostare la lunghezza d'onda a 830 nanometri per il fascio laser al titanio-saffio e a 1107 nanometri per l'OPO.Attiva entrambi i laser nella traccia uno per ottenere una scansione simultanea. Inizia con entrambi i laser a bassa potenza. Successivamente, nella finestra del percorso luminoso, deseleziona PMT4 e seleziona PMT1.Quindi selezionare l'area di scansione massima e attivare le scansioni laser facendo clic sul pulsante continuo. Regolare il guadagno a 600 e, se necessario, aumentare la potenza di entrambi i laser. Successivamente, regolare l'intensità di visualizzazione nel blocco di controllo dell'opzione di visualizzazione.Spostare quindi lentamente la fase di traslazione della linea di ritardo finché il segnale non risulta notevolmente amplificato. Successivamente, ridurre la potenza di entrambi i laser. Verificare ora se il segnale corrisponde a un segnale CARS spegnendo alternativamente uno dei due laser.Se l'intensità del segnale diventa più debole o scompare, è stato ottenuto un segnale CARS. Poiché il sistema finale è destinato a non fisici, racchiudere il percorso ottico della linea di ritardo con una scatola di contenimento e tubi per evitare l'accesso diretto a un fascio laser pericoloso, non visibile e ad alta potenza di picco. Tuttavia, è necessario prevedere l'accesso alla manopola dello stadio di traslazione.Un colorante rosso fluoromielina, che presenta selettività per la mielina, è stato utilizzato per osservare la guaina mielinica. L'illuminazione simultanea a 830 e a 1095 nanometri fornisce un segnale CARS. I cerchi corrispondono alla guaina mielinica che circonda gli assoni in una sezione trasversale.La stessa struttura viene osservata sovrapponendo le immagini CARS e quelle a fluorescenza. Il livello di dettaglio di CARS e della marcatura fluorescente è molto simile. Ciò potrebbe eliminare la necessità di utilizzare coloranti.Il sistema può inoltre generare contemporaneamente un segnale di armonica secondaria dalle fibre di collagene situate sulla superficie esterna dei nervi sciatici. Per registrare un segnale a 550 nanometri si utilizza un rivelatore diverso, poiché per la registrazione del segnale CARS viene impiegato un filtro passa-banda stretto a 670 nanometri. Le fibre sono rappresentate con un colore magenta falso.Il segnale CARS da solo mostra chiaramente le guaine mieliniche. Visualizzando contemporaneamente entrambi i segnali, le guaine mieliniche in verde risultano circondate da fibre di collagene in magenta. Un segnale CARS richiede meno energia rispetto ai segnali SHG o THG.I segnali CARS sono stati ottenuti con quattro milliwatt a 830 nanometri e 13 milliwatt a 1095 nanometri, mentre erano necessari 50 milliwatt a 1095 nanometri per ottenere un segnale SHG. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come modificare passo dopo passo uno dei percorsi del fascio laser per sincronizzare temporalmente entrambi i fasci laser. L'implementazione della linea di ritardo può essere realizzata in alcune settimane da biologi con una formazione di base in ottica sperimentale o in collaborazione con fisici.Non dimenticare che lavorare con fasci laser invisibili ad alta potenza può essere estremamente pericoloso. È necessario adottare precauzioni, come indossare occhiali protettivi durante l'esecuzione della procedura e provvedere all'incapsulamento finale del percorso del fascio laser.

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Una combinazione di tre singola lunghezza d'onda a breve impulsi laser viene utilizzato per generare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS) e doppiamente AUTO-risonante (DR-CARS). La differenza tra questi segnali fornisce maggiore sensibilità perché altrimenti difficili da individuare coerenti segnali Raman, che consente l'imaging di debole dispersori Raman.

Imaging differenziale delle strutture biologiche con Doppiamente-risonanza coerente Anti-Stokes scattering Raman (CARS)

Fonte: Espinoza, R., et al. Imaging di scattering Raman stimolato a due colori in tempo reale del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti. J. Vis. Exp. (2022).  Il video mostra l'imaging a due colori di scattering Raman stimolato (SRS) di sezioni di tessuto cerebrale di topo. Due raggi laser sincronizzati sono diretti sulla sezione di tessuto per eccitare le vibrazioni molecolari, determinando un cambiamento di intensità relativa nei raggi. I lipidi e le proteine nel tessuto vengono...

Imaging a diffusione Raman stimolato a due colori del tessuto cerebrale del topo

In questo manoscritto, viene descritta l'implementazione di un microscopio stimolato Raman scattering (SRS), ottenuto dall'integrazione di un set-up sperimentale SRS con un microscopio a scansione laser. Il microscopio SRS si basa su due sorgenti laser femtosecondo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) e un oscillatore parametrico ottico sincronizzato (OPO).

Implementazione di un microscopio non lineare basato sullo scattering Raman stimolato

Viene descritta una metodologia di imaging a dispersione Raman coerente per visualizzare e quantificare i composti farmaceutici all'interno della pelle. Questo documento descrive la preparazione del tessuto cutaneo (umano e murino) e l'applicazione della formulazione topica, l'acquisizione di immagini per quantificare i profili di concentrazione spaziotemporale e l'analisi farmacocinetica preliminare per valutare la somministrazione topica di farmaci.

Visualizzazione e quantificazione di composti farmaceutici all'interno della pelle utilizzando l'imaging a dispersione Raman coerente

La microscopia A scattering Raman stimolato (SRS) consente l'imaging senza etichette di biomolecole in base alla loro vibrazione intrinseca di specifici legami chimici. In questo protocollo, viene descritta la configurazione strumentale di un microscopio integrato SRS e fluorescenza a due fotoni per visualizzare le strutture cellulari nel midollo spinale di topi vivi.

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

La microscopia A dispersione Raman stimolata (SRS) è una tecnica di imaging potente, non distruttiva e priva di etichette. Un'applicazione emergente è l'istologia Raman stimolata, in cui l'imaging SRS a due colori nelle transizioni Raman proteiche e lipidiche viene utilizzato per generare immagini di pseudo-ematossilina ed eosina. Qui, dimostriamo un protocollo per l'imaging SRS a due colori in tempo reale per la diagnosi dei tessuti.

In tempo reale, a due colori stimolato Raman Scattering Imaging del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti

L'imaging a diffusione Raman (epr-SRS) stimolato dalla pre-risonanza elettronica di coloranti Raman simili a arcobaleno è una nuova piattaforma per l'imaging proteico a base di epitopi altamente multiplexati. Qui, presentiamo una guida pratica che include la preparazione degli anticorpi, la colorazione del campione di tessuto, l'assemblaggio del microscopio SRS e l'imaging tissutale epr-SRS.

Imaging tissutale altamente multiplexato con coloranti Raman

Questo articolo presenta l'integrazione di un modulo di messa a fuoco spettrale e di un laser a impulsi a doppia uscita, che consente una rapida imaging iperspettrale di nanoparticelle d'oro e cellule tumorali. Questo lavoro mira a dimostrare i dettagli delle tecniche ottiche non lineari multimodali su un microscopio a scansione laser standard.

Imaging biomolecolare dell'assorbimento cellulare di nanoparticelle mediante microscopia ottica non lineare multimodale

Questo documento confronta direttamente la risoluzione, la sensibilità e i contrasti di imaging dello scattering Raman stimolato (SRS) e dello scattering Raman anti-Stokes coerente (CARS) integrati nella stessa piattaforma del microscopio. I risultati mostrano che CARS ha una migliore risoluzione spaziale, SRS offre migliori contrasti e risoluzione spettrale ed entrambi i metodi hanno una sensibilità simile.

Confronto diretto tra lo scattering Raman stimolato iperspettrale e la microscopia a dispersione raman coerente anti-Stokes per l'imaging chimico

Visualizzare la mielinizzazione è un obiettivo importante per molti ricercatori che studiano il sistema nervoso. CARS è una tecnica compatibile con l'immunofluorescenza in grado di visualizzare nativamente i lipidi all'interno di tessuti come il cervello illuminando strutture specializzate come la mielina.

Applicazione coerente della spettroscopia Raman anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione nelle fette di cervello

Impara a implementare la microscopia CARS per l'imaging senza marcatori di cellule viventi utilizzando laser Ti:zaffiro e OPO. Questa tecnica chimicamente selettiva si integra facilmente nei microscopi standard per studi biologici e neuroscientifici.

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Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope

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