Name: Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Impara a implementare la microscopia CARS per l'imaging senza marcatori di cellule viventi utilizzando laser Ti:zaffiro e OPO. Questa tecnica chimicamente selettiva si integra facilmente nei microscopi standard per studi biologici e neuroscientifici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano il Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, Francia) per il prestito dell'oscilloscopio veloce e ringraziano il sostegno finanziario di Montpellier RIO Imaging (MRI). HR riconosce che ANR concede a France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) e France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) le reti infrastrutturali per sviluppi coerenti dell'imaging Raman. Questo lavoro è stato sostenuto principalmente da una sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca (FP7-IDEAS-ERC 311610) e da una sovvenzione INSERM - AVENIR a NT.

<ol><li>Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValeur%2C+B+%22Molecular+Fluorescence%3A+Principles+and+Applications%22">Molecular Fluorescence: Principles and Applications</a>. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+imaging+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA+B%22%5BJournal%5D)">Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy.</a> JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li>
<li>Yelin, D., Silberberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+third-harmonic-generation+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology.</a> Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+Second-Harmonic+Generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).</li>
<li>Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).</li>
<li>Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+imaging+and+scoring+of+collagen+in+fibrotic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues.</a> Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+Instrumentation%2C+theory%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications.</a> J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).</li>
<li>Volkmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+and+microspectroscopies+based+on+coherent+anti-Stokes+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D%3A+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy.</a> J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).</li>
<li>Evans, C. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+chemical+imaging+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).</li>
<li>Mukamel, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMukamel%2C+S+%22Principles+of+nonlinear+optical+spectroscopy%22">Principles of nonlinear optical spectroscopy</a>. , Oxford University Press. New York. (1995).</li>
<li>Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope.</a> Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).</li>
<li>Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vibrational+imaging+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering.</a> Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipid+metabolism+in+live+Caenorhabditis+elegans+using+fingerprint+vibrations%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+and+applications+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology.</a> Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).</li>
<li>Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diffusion+in+the+human+nail+measured+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).</li>
<li>Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+molecular+cutaneous+absorption+in+human+skin+using+label+free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy.</a> J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).</li>
<li>Kano, H., Hamaguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-nonlinear+optical+imaging+of+a+living+cell+using+a+supercontinuum+light+source+generated+from+a+photonic+crystal+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber.</a> Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).</li>
<li>Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+parametric+oscillator-based+light+source+for+coherent+Raman+scattering+microscopy%3A+practical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview.</a> J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106(2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal+platform+for+nonlinear+optical+microscopy+and+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy.</a> Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).</li>
<li>Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Photonics+Rev%22%5BJournal%5D)">Multimodal nonlinear optical microscopy.</a> Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).</li>
<li>Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multimodal+nonlinear+optical+microscopy+reveals+fundamental+insights+of+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development.</a> Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).</li>
<li>Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+imaging+of+atherosclerotic+lesions+using+multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007(2007).</li>
<li>Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+disease+and+enlightening+biomedicine%3A+Raman+spectroscopy+as+a+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool.</a> Analyst. 138, 3871-3884 (2013).</li>
<li>A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator">http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator</a> (2015).</li>
<li>Ozçelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pals1+is+a+major+regulator+of+the+epithelial-like+polarization+and+the+extension+of+the+myelin+sheath+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves.</a> J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).</li>
<li>Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+saturated+and+unsaturated+lipids+by+wide-field+CARS-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy.</a> Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).</li>
<li>Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+spectra+measurement+of+olive+oil+and+other+vegetable+oils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils.</a> J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).</li>
<li>King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy%3A+normal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Handb.+Clin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy: normal structure.</a> Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).</li>
<li>Monsma, P. C., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoroMyelin+Red+is+a+bright%2C+photostable+and+non-toxic+fluorescent+stain+for+live+imaging+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin.</a> J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).</li>
<li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).</li>
<li>Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chasing+lipids+in+health+and+diseases+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vib.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).</li>
<li>Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal%2C+3D+in+vivo+imaging+of+sebaceous+glands+by+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+normal+function+and+response+to+cryotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy.</a> J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La parte più impegnativa del lavoro è la sincronizzazione temporale dei raggi laser. Richiede un fotodiodo veloce combinato con un oscilloscopio veloce, ma solo una sovrapposizione ruvida nel tempo può essere eseguita in un primo momento. Poi è necessario un ulteriore aggiustamento di pochi cm. Infine, micrometro si muove da una fase di traslazione lineare permette di eseguire la regolazione fine definitiva della lunghezza della linea di ritardo al fine di innescare il segnale AUTO. Questo segnale viene mantenuto in un ...

La microscopia ottica è diventata una tecnica importante per la visualizzazione non distruttiva dei processi dinamici nei sistemi biologici viventi con una risoluzione sub-cellulare. Microscopia a fluorescenza è attualmente il contrasto delle immagini più popolare usato in cellule vive per la sua elevata specificità e sensibilità 1. Una grande tavolozza di sonde fluorescenti è emerso (coloranti esogeni, proteine ​​geneticamente codificate, nanoparticelle di semiconduttori). Varie tecniche fluorescenti a base di illuminazione del campione sono fiorite (ad esempio la microscopia confocale o due fotoni) per eseguire l&#39;imaging 3D e ridurre un inconveniente principale di questa tecnica che viene photobleaching 2. Altre limitazioni includono il requisito di etichettatura fluoroforo perché la maggior parte delle specie molecolari non sono intrinsecamente fluorescenti e quindi questi fluorofori essere introdotto artificialmente nel campione esaminato. Questa manipolazione artificiale può essere dirompente soprattutto per le piccole molecole o induce pentolaziale foto-tossicità. Queste ragioni rendono la fluorescenza non microscopia adatto per vivo in-osservazioni. Quindi, l&#39;uso di tecniche di imaging ottico con elevata sensibilità e contrasto molecolari specifici senza l&#39;uso di molecole fluorescenti è altamente auspicabile nella scienza biomedica. Diverse tecniche di imaging ottici non lineari senza etichettatura o colorazione sono emersi, tra seconda armonica generazione (SHG) 3,4 e la generazione di terza armonica (THG) 5. SHG microscopio è stato utilizzato per dispositivi strutturali immagine a livello sopramolecolare quali microtubuli o collagene 6. THG è generato dalla eterogeneità ottici quali interfaccia tra un mezzo acquoso e lipidi 7. THG è stato dimostrato anche per l&#39;immagine mielina 8,9. Entrambe le tecniche possono essere implementate su un microscopio a fluorescenza a due fotoni e richiedono solo raggio laser. Tuttavia essi richiedono intensità del laser ad alta potenza (tipicamente 50mW a 860 nm per SHG 10, 25 - 50 mW a 1.180 nm per THG 9), che è deleterio in campioni di vita, e non forniscono la specificità chimico che è necessario per inequivocabilmente immagine strutture biologiche specifiche. Chimicamente immagini selettiva può essere ottenuta da segnali di vibrazione molecolari intrinseche basate su Raman. Quando un fascio di luce colpisce la materia, i fotoni possono essere assorbiti e dispersi da atomi o molecole. La maggior parte dei fotoni sparsi avranno la stessa energia, cioè, la frequenza, come i fotoni incidenti. Questo processo è chiamato scattering di Rayleigh. Tuttavia, un piccolo numero di fotoni saranno disperse ad una frequenza ottica diversa dalla frequenza dei fotoni incidenti, cioè un processo di scattering anelastico chiamato Raman. La differenza di energia proviene dalla eccitazione di modi vibrazionali seconda struttura molecolare e ambiente. Pertanto, Raman spontanea dispersione providi di imaging chimicamente selettivo come molecole diverse hanno specifiche frequenze vibrazionali. Tuttavia è limitato a causa del suo segnale estremamente debole. Confocal microscopia Raman è stato sviluppato e fornisce risoluzione spaziale 3D, ma richiede media alta potenza ed acquisizione lungo 11. Per superare queste difficoltà, i recenti progressi nella tecnologia laser hanno permesso la nascita della microscopia vibrazionale ottica non lineare, in particolare coerente dispersione anti-Stokes Raman (CARS) 11,12,13. Cars è un processo ottico non lineare del terzo ordine. Tre raggi laser, composto da un fascio di pompa a ω frequenza P, un fascio Stokes alla frequenza ω S e un fascio sonda (più spesso riconducibile pompa) sono focalizzati in un campione e generano un fascio di anti-Stokes a frequenza ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. Il segnale anti-Stokes può essere notevolmente migliorata quando la differenza di frequenzatra la pompa ed il Stokes travi è sintonizzata una Raman molecolare vibrazioni Ω R = (ω P - ω S). segnale CARS si basa sull&#39;interazione multipla fotone. Esso genera pertanto un coerente ordini di grandezza più forte di Scattering Raman spontanea di segnale. AUTO microscopio è stato dimostrato sperimentalmente da Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Migliorato poi la tecnica, utilizzando due fasci laser focalizzati femtosecondi vicino infrarosso con una lente obiettivo di alta apertura numerica, permettendo la condizione di accordo di fase di autoveicoli e evitando i due fotoni sfondo non risonante 16. CARS microscopia ha quindi emerso come un potente strumento per l&#39;imaging cellulare e dei tessuti dal vivo, rilevando chimicamente molecole come lipidi (tramite vibrazioni CH tratto) 17,18, acqua (attraverso OH tratto vibrazioni), proteine, DNA nelle cellule vive 19,20 ma anche deuterato composto chimicos per farmaceutiche 21 e applicazioni cosmetiche 22. La maggiore limitazione della microscopia non lineare deriva dalla complessità e il costo delle sorgenti ottiche. Un sistema AUTO richiede due laser sintonizzabili lunghezza d&#39;onda con durate di impulso breve e con treni di impulsi temporalmente e spazialmente sincronizzati. Automobili in anticipo microscopi erano basati su due picosecondo sincronizzato Ti: zaffiro laser 20. AUTOMOBILI di imaging è stato ottenuto anche da un singolo femtosecondi laser Ti: zaffiro generare una fonte di luce supercontinuo 23. Recentemente, sorgenti laser composti da un unico femtosecondi laser Ti: zaffiro pompare un sintonizzabile ottici oscillatori parametrici (OPO) sono stati utilizzati per la microscopia AUTOMOBILI. Questa configurazione permette intrinsecamente temporalmente sincronizzato travi con una differenza di frequenza tra la pompa e il fascio Stokes copre l&#39;intero spettro vibrazionale molecolare 24. Inoltre, microscopi a scansione laser basata su un fatturatoKEY Laser FS e un OPO, utilizzato principalmente per due fotoni di fluorescenza (TPF) sono ora disponibili per i non-fisici. Il potenziale di questi set-up può essere notevolmente migliorata senza richiedere investimenti supplementari per l&#39;incorporazione di altri imaging ottico non lineare, dal momento che ogni non lineare (NLO) modalità di imaging è sensibile alle strutture o molecole specifiche. L&#39;imaging multimodale NLO sfrutta quindi il potenziale di NLO microscopia per i campioni biologici complessi 25. L&#39;accoppiamento di queste tecniche ha permesso l&#39;indagine di molte questioni biologiche, in particolare sul metabolismo lipidico, pelle o cancro di sviluppo 26, lo sviluppo muscolare scheletrico 27, 28 lesioni aterosclerotiche. Inoltre, l&#39;implementazione di scansione a raggio laser con CARS dà la possibilità di imaging ad alta frequenza, cioè, uno strumento attraente per studiare processi dinamici in vivo. Lo scopo di questo lavoro è quello di mostrare ogni passo per implementare ttecnica che CARS su un microscopio a scansione laser multifotonica standard. Il microscopio è basato su Ti fsec: laser zaffiro ed un OPO (pompato dal Ti: zaffiro laser) azionato da un software per biologi. L&#39;integrazione è stata effettuata regolando la lunghezza di uno dei percorso del raggio laser per sincronizzare nel tempo i due fasci. Descriviamo l&#39;implementazione passo-passo di questa tecnica, che richiede soltanto background basic in ottica sperimentali. Illustriamo anche CARS Imaging ottenuti su guaine mieliniche del nervo sciatico di roditori, e mostriamo questo l&#39;imaging può essere eseguito simultaneamente con altri imaging ottico non lineare, come ad esempio la tecnica della fluorescenza a due fotoni di serie e di seconda armonica generazione.

<table><tbody><tr><td>Oscilloscopio</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 MHz&nbsp;</td></tr><tr><td>Fotorivelatore</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1.700 nm</td></tr><tr><td>Laser Ti:Sapphire Chameleon Ultra Family II</td><td>Oscillatore</td> ottico parametrico coerente <td></td><td></td></tr><tr><td>OPO Compact Family</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Examiner microscopio LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Periscopio motorizzato</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo W Plan-Apochromat 20X/1.0</td><td>Carl Zeiss</td> Combinatore di fasci Carl Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td>Modulatore acusto-ottico</td><td>Carl Zeiss</td> Attenuatore di potenza OPO Carl Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomoltiplicatore</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> filtri</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 nm; 500 - 550&nbsp; Nm; 465 - 610&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Lunghezza d'onda di taglio 760&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Specchi d'argento</td><td>Newport</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&lambda;/10, 480 - 20.000&nbsp; nm, Quantità 4</td></tr><tr><td>Stadio di traslazione monoassiale con micrometro standard</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>Quantità 1</td></tr><tr><td>Breadboard in alluminio</td><td>Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>Quantità 1</td></tr><tr><td>Supporto per specchio</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>Quantità 4</td></tr><tr><td>Porta specchio per &Oslash; Ottica da 1"</td><td>Thorlabs</td><td>MH25</td><td>Quantità 4</td></tr><tr><td>diaframmi a iride&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>Quantità 3</td></tr><tr><td>Scatola protettiva</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>Quantità 1</td></tr><tr><td>Pali ottici</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>Quantità 8 (lunghezze a seconda della configurazione)</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda 661 - 690 nm</td> Filtro passa-banda a banda singola <td>Semrock</td><td>676/29 nm BrightLine® Quantità</td><td>1</td></tr><tr><td>Perline fluorescenti</td><td>ThermoFisher</td><td>TetraSpeck&trade; Microsfere fluorescenti Kit</td><td></td>di dimensioni Scheda</tr><tr><td>di visualizzazione laser</td> Thorlabs <td>Scheda di visualizzazione laser IR</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di sicurezza laser</td><td>Newport</td><td>LV-F22. P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromielina&commercio; Colorazione mielinica fluorescente rossa&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>F34652</td><td></td></tr></tbody></table>

implementazione di un sistema coerente anti-stokes raman scattering (cars) su un ti: zaffiro e opo laser basata su standard laser scanning microscope

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

La scansione laser microscopi conciliano un femtosecondi laser Ti: zaffiro e un ottica oscillatore parametrico (OPO) per duplicare la linea laser si sono resi disponibili per i biologi. Questi sistemi sono progettati principalmente per microscopia di fluorescenza a due fotoni multicanale. Tuttavia, senza alcuna modifica, complementare microscopia ottica non lineare come seconda armonica generazione (SHG) o terza generazione armonica (THG) può essere eseguita anche con questo set-up, permettendo l&#39;imaging libera-label di molecole strutturate o medio acquosa interfacce di lipidi. Queste tecniche sono adatti per l&#39;osservazione in vivo, ma sono limitate in specificità chimica. Chimicamente immagini selettiva può essere ottenuta da segnali di vibrazione intrinseche basate su Raman. Confocale microscopia Raman fornisce una risoluzione spaziale in 3D, ma richiede elevata potenza media e tempo di acquisizione a lungo. Per superare queste difficoltà, i recenti progressi nella tecnologia laser hanno permesso lo sviluppo della microscopia vibrazionale ottica non lineare, in particolare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS). CARS microscopia ha quindi emerso come un potente strumento per l&#39;imaging cellulare biologica e dal vivo, da lipidi chimicamente mappatura (attraverso la vibrazione CH tratto), acqua (attraverso OH tratto vibrazioni), proteine ​​o DNA. In questo lavoro, si descrive l&#39;applicazione della tecnica di automobili su un microscopio a scansione laser multifotonica OPO-accoppiato di serie. Essa si basa sulla sincronizzazione nel tempo delle due linee laser regolando la lunghezza di uno dei percorso del raggio laser. Presentiamo un&#39;implementazione passo-passo di questa tecnica su un sistema multiphoton esistente. Un fondo di base ottica sperimentale è disponibile e il sistema presentato non richiede attrezzature supplementari costose. Illustriamo anche CARS di imaging ottenuti su guaine mieliniche del nervo sciatico di roditori, e dimostriamo che questa immagini può essere eseguito simultaneamente con altri imaging ottico non lineare, come ad esempio t di seriewo-photon tecnica a fluorescenza e la generazione di seconda armonica.

<html> La frequenza treno di impulsi di Ti di serie: laser zaffiro è tipicamente intorno a 80 MHz. Il OPO ha la stessa frequenza in quanto è pompato dal Ti: zaffiro laser. è pertanto necessario un oscilloscopio veloce di almeno 200 MHz. Un fotodiodo veloce nella gamma è richiesta anche 600 a 1.100 nm. Lo spostamento temporale massima si verifica quando il Ti: zaffiro ed i segnali OPO sono spostati di 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 nanosecondi. Essa corrisponde a un cambiamento di pe...

Coherent dispersione anti-Stokes Raman (CARS) microscopia a base di vibrazione intrinseca di obbligazioni molecola permette chimicamente selettivo imaging cellulare dal vivo senza etichetta. Questo lavoro presenta l&#39;implementazione di una tecnica di microscopia complementare su un microscopio a scansione laser multifotone standard basato su un femtosecondi laser Ti: zaffiro ed un laser OPO.

Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

L'obiettivo generale di questa procedura è implementare una tecnica complementare di microscopia chiamata CARS, che consente un'immagine senza etichette, selettiva dal punto di vista chimico e in vita su un microscopio standard a scansione laser a fotoni multipli basato su un laser al titanio-zaffiro femtosecondo e un oscillatore parametrico ottico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia o delle neuroscienze, come la comprensione delle malattie correlate ai lipidi, dei meccanismi di penetrazione cutanea o dei disturbi della pelle. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è facile da implementare su un microscopio standard a scansione laser basato su laser Ti:Sapphire e OPO.Il procedimento sarà dimostrato da Hassan Boukhaddaoui, ricercatore associato e responsabile della piattaforma di imaging del laboratorio, e da Vasyl Mytskaniuk. Accendere i laser a titanio-sapphire e OPO come descritto nel protocollo testuale. Accendere il computer del microscopio.Accendere gli interruttori dei componenti del microscopio. Avviare il software facendo doppio clic sull'icona presente sul desktop e configurarlo seguendo il protocollo descritto.

implementation-coherent-anti-stokes-raman-scattering-cars-system-on

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Una combinazione di tre singola lunghezza d'onda a breve impulsi laser viene utilizzato per generare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS) e doppiamente AUTO-risonante (DR-CARS). La differenza tra questi segnali fornisce maggiore sensibilità perché altrimenti difficili da individuare coerenti segnali Raman, che consente l'imaging di debole dispersori Raman.

Imaging differenziale delle strutture biologiche con Doppiamente-risonanza coerente Anti-Stokes scattering Raman (CARS)

Fonte: Espinoza, R., et al. Imaging di scattering Raman stimolato a due colori in tempo reale del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti. J. Vis. Exp. (2022).  Il video mostra l'imaging a due colori di scattering Raman stimolato (SRS) di sezioni di tessuto cerebrale di topo. Due raggi laser sincronizzati sono diretti sulla sezione di tessuto per eccitare le vibrazioni molecolari, determinando un cambiamento di intensità relativa nei raggi. I lipidi e le proteine nel tessuto vengono...

Imaging a diffusione Raman stimolato a due colori del tessuto cerebrale del topo

In questo manoscritto, viene descritta l'implementazione di un microscopio stimolato Raman scattering (SRS), ottenuto dall'integrazione di un set-up sperimentale SRS con un microscopio a scansione laser. Il microscopio SRS si basa su due sorgenti laser femtosecondo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) e un oscillatore parametrico ottico sincronizzato (OPO).

Implementazione di un microscopio non lineare basato sullo scattering Raman stimolato

Viene descritta una metodologia di imaging a dispersione Raman coerente per visualizzare e quantificare i composti farmaceutici all'interno della pelle. Questo documento descrive la preparazione del tessuto cutaneo (umano e murino) e l'applicazione della formulazione topica, l'acquisizione di immagini per quantificare i profili di concentrazione spaziotemporale e l'analisi farmacocinetica preliminare per valutare la somministrazione topica di farmaci.

Visualizzazione e quantificazione di composti farmaceutici all'interno della pelle utilizzando l'imaging a dispersione Raman coerente

La microscopia A scattering Raman stimolato (SRS) consente l'imaging senza etichette di biomolecole in base alla loro vibrazione intrinseca di specifici legami chimici. In questo protocollo, viene descritta la configurazione strumentale di un microscopio integrato SRS e fluorescenza a due fotoni per visualizzare le strutture cellulari nel midollo spinale di topi vivi.

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

La microscopia A dispersione Raman stimolata (SRS) è una tecnica di imaging potente, non distruttiva e priva di etichette. Un'applicazione emergente è l'istologia Raman stimolata, in cui l'imaging SRS a due colori nelle transizioni Raman proteiche e lipidiche viene utilizzato per generare immagini di pseudo-ematossilina ed eosina. Qui, dimostriamo un protocollo per l'imaging SRS a due colori in tempo reale per la diagnosi dei tessuti.

In tempo reale, a due colori stimolato Raman Scattering Imaging del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti

L'imaging a diffusione Raman (epr-SRS) stimolato dalla pre-risonanza elettronica di coloranti Raman simili a arcobaleno è una nuova piattaforma per l'imaging proteico a base di epitopi altamente multiplexati. Qui, presentiamo una guida pratica che include la preparazione degli anticorpi, la colorazione del campione di tessuto, l'assemblaggio del microscopio SRS e l'imaging tissutale epr-SRS.

Imaging tissutale altamente multiplexato con coloranti Raman

Questo articolo presenta l'integrazione di un modulo di messa a fuoco spettrale e di un laser a impulsi a doppia uscita, che consente una rapida imaging iperspettrale di nanoparticelle d'oro e cellule tumorali. Questo lavoro mira a dimostrare i dettagli delle tecniche ottiche non lineari multimodali su un microscopio a scansione laser standard.

Imaging biomolecolare dell'assorbimento cellulare di nanoparticelle mediante microscopia ottica non lineare multimodale

Questo documento confronta direttamente la risoluzione, la sensibilità e i contrasti di imaging dello scattering Raman stimolato (SRS) e dello scattering Raman anti-Stokes coerente (CARS) integrati nella stessa piattaforma del microscopio. I risultati mostrano che CARS ha una migliore risoluzione spaziale, SRS offre migliori contrasti e risoluzione spettrale ed entrambi i metodi hanno una sensibilità simile.

Confronto diretto tra lo scattering Raman stimolato iperspettrale e la microscopia a dispersione raman coerente anti-Stokes per l'imaging chimico

Visualizzare la mielinizzazione è un obiettivo importante per molti ricercatori che studiano il sistema nervoso. CARS è una tecnica compatibile con l'immunofluorescenza in grado di visualizzare nativamente i lipidi all'interno di tessuti come il cervello illuminando strutture specializzate come la mielina.

Applicazione coerente della spettroscopia Raman anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione nelle fette di cervello

Impara a implementare la microscopia CARS per l'imaging senza marcatori di cellule viventi utilizzando laser Ti:zaffiro e OPO. Questa tecnica chimicamente selettiva si integra facilmente nei microscopi standard per studi biologici e neuroscientifici.

Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope (Video) | JoVE Journal

Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope

Esplora altri video