Name: Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Scopri come misurare la fagocitosi e l'attività di burst ossidativo di granulociti e monociti nel sangue umano. Questo metodo semplice e adattabile aiuta a studiare la funzione immunitaria innata.

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Gli autori vorrebbero riconoscere Zack Shue, Casey John, e Lynn Cialdella-Kam per la loro assistenza durante l&#39;ottimizzazione di questa procedura.

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo manoscritto fornisce un protocollo passo-passo per la determinazione di due indicatori di granulociti e monociti funzione. Abbiamo identificato alcuni punti che sono fondamentali per il successo di questo test. Un tale passo è l&#39;incubazione bagno di ghiaccio che si verifica immediatamente prima dell&#39;aggiunta di batteri. raffreddamento completa di tutti i campioni minimizzerà l&#39;effetto della temperatura sull&#39;attività fagocitosi e OB. Un altro punto critico è l&#39;aggiunta di batteri per ogni campi...

Il granulociti e monociti fagocitosi / burst ossidativo (OB) saggio di attività è una tecnica semplice, straight-forward che viene spesso utilizzato per raccogliere informazioni sui innato funzione immunitaria dopo l&#39;attività fisica intensa e prolungata. 1-4 Quando si studia la risposta del sistema immunitario a uno stimolo, granulociti e monociti sono di particolare interesse perché giocano un ruolo centrale nella difesa ospite e sono le prime cellule immunitarie per accumulare nel sito di infezione. 5 neutrofili, un tipo di granulociti, sono le prime cellule di traslocare nel muscolo danneggiato tessuto dopo l&#39;attività fisica intensa. 6 fagocitosi e l&#39;attività OB sono le misure più comuni di granulociti e monociti funzione, 7 e sono preferiti come indicatori di funzione delle cellule immunitarie innate a causa del loro ruolo centrale sia nel processo di infezione e il processo di riparazione. Il test descritto in questo Utili manoscrittozes un flusso base citometro a fornire una determinazione quantitativa di granulociti e monociti fagocitosi e l&#39;attività OB nel sangue intero. L&#39;uso di sangue intero in questa tecnica è vantaggiosa perché permette il test da condurre senza una procedura di purificazione tempo. Questo test può essere facilmente modificato per accogliere una varietà di disegni di ricerca e capacità di laboratorio. Ad esempio, Liao et al. Utilizzato una tecnica simile a dimostrare che l&#39;attività dei neutrofili OB è aumentata e neutrofili fagocitosi è diminuita in seguito a lesione cerebrale traumatica. 8 In un altro esempio, McFarlin et al. Descrive un elegante modifica di questa tecnica che utilizza allophycocyanin (APC ) coniugata CD66b e ad alte prestazioni in tandem APC-coniugato etichettatura CD45 con image-based citometria a flusso per classificare i granulociti in termini di attività di fagocitosi e OB. 7,9 Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato vari adattamenti di questo TEchnique come un indicatore della funzione immunitaria innata nelle popolazioni in sovrappeso, obesi, e atletiche per quasi 20 anni. 10,11 Il testo qui di seguito vi fornire al lettore con le istruzioni passo-passo per l&#39;esecuzione di questo test ed evidenziare le aree che il lettore può adattare per soddisfare le esigenze della loro ricerca.

<table><tbody><tr><td>12 provette da 75 mm, con tappo</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>Sono necessarie 2 provette per campione ("H" e "F") più 3 provette per lotto (per i controlli dei saggi; "F", "H" e "Solo sangue").</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Tappo del flacone 0,2 &; m filtro in acetato di cellulosa (capacità 500 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio, polvere</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico (anidro, testato per colture cellulari, testato per colture cellulari vegetali)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio tribasico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>Diidroetidio (Idroetidina) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>Dimetile solfossido (DMSO) Anhydrous</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Ceppo di legno senza proteina A) BioParticelle, coniugato di fluoresceina (FITC)</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Ceppo di legno senza proteine A) BioParticles, soluzione di</td> tripano blu Life <td>Technologies</td><td>S-2859</td><td></td>non marcata</tr><tr><td>, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>vacutainer da 4,0 ml contenente 7,2 mg di K2EDTA, VWR essiccato a spruzzo</td><td></td><td>BD367861</td><td>Sarà necessaria 1 provetta per prelievo di sangue K2EDTA per campione.</td></tr><tr><td>Vacutainer da 4,0 ml contenente 68 unità USP Litio eparina, rivestimento a spruzzo</td><td>VWR</td><td>BD367884</td><td>Avrai bisogno di 1 provetta per la raccolta del sangue al litio eparina per campione.</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff CP</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605705</td><td>i.e., analizzatore ematologico</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Risciacquo</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Calibratore Cal</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Control Plus</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff Diluente</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l Puntali per pipette di lunghezza estesa</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>Vaschetta del ghiaccio isolata</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>Per bagnomaria con acqua ghiacciata.</td></tr><tr><td>Rack per provette metalliche aperte</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Stazione di lavoro TQ-Prep Beckman</td><td>Coulter</td><td>6605429</td><td>i.e., stazione di lavoro automatizzata per la preparazione della lisi cellulare</td></tr><tr><td>Sistema di reagenti ImmunoPrep</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>i.e., sistema di reagenti per la lisi globulica/WBC</td></tr><tr><td>Sistema di citometria a flusso Cytomics FC500 MCL con software CXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlow Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>COULTER CLENZ</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosfere di controllo del flusso&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td>i.e., verifica dell'allineamento e della fluidica fluorosfere</td></tr><tr><td>FlowJo Software FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>i.e., software per analisi della citometria a flusso</td></tr><tr><td>Software Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel</td><td>i.e., programma per fogli di calcolo elettronici</td></tr></tbody></table>

misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività burst nel sangue umano

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Il test di fagocitosi dei granulociti e dei monociti e dell'attività di scoppio ossidativo (OB) può essere utilizzato per studiare il sistema immunitario innato. Questo manoscritto fornisce la metodologia necessaria per aggiungere questo test a un arsenale di immunologia dell'esercizio. Il primo passo di questo test consiste nel preparare due aliquote ("H" e "F") di sangue intero (eparina). Quindi, il diidroetidio viene aggiunto all'aliquota H ed entrambe le aliquote vengono incubate in un bagno di acqua calda seguito da un bagno di acqua fredda. Successivamente, lo Staphylococcus aureus (S. aureus) viene aggiunto all'aliquota H e S. aureus marcato con isotiocianato di fluoresceina viene aggiunto all'aliquota F (batteri:fagocita = 8:1), ed entrambe le aliquote vengono incubate in un bagno di acqua calda seguito da un bagno di acqua fredda. Quindi, il blu di tripano viene aggiunto a ciascuna aliquota per estinguere la fluorescenza extracellulare e le cellule vengono lavate con soluzione salina tamponata con fosfato. Successivamente, i globuli rossi vengono lisati e i globuli bianchi vengono fissati. Infine, un citometro a flusso e un software di analisi appropriato vengono utilizzati per misurare la fagocitosi di granulociti e monociti e l'attività OB. Questo test è stato utilizzato per oltre 20 anni. Dopo uno sforzo pesante e prolungato, gli atleti sperimentano un aumento significativo ma transitorio della fagocitosi e una diminuzione prolungata dell'attività ostetrica. L'aumento della fagocitosi post-esercizio è correlato all'infiammazione. A differenza degli individui normopeso, la fagocitosi dei granulociti e dei monociti è cronicamente elevata nei partecipanti in sovrappeso e obesi ed è modestamente correlata con la proteina C-reattiva. In sintesi, questo test basato sulla citometria a flusso misura la fagocitosi e l'attività ostetrica dei fagociti e può essere utilizzato come misura aggiuntiva dell'infiammazione indotta dall'esercizio fisico e dall'obesità.

attività intensa e prolungata ha effetti profondi sulla funzione immunitaria innata, tra cui la funzione Natural Killer delle cellule, la risposta dei macrofagi citochina-mediata alle infezioni virali, e granulociti e monociti fagocitosi e l&#39;attività OB. Diversi studi indicano che i granulociti e monociti fagocitosi aumenta in modo significativo post-esercizio, che riflettono l&#39;infiammazione indotta da danno muscolare e richieste metaboliche. Al contrario, granulociti e monociti ...

Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo per misurare la fagocitosi di monociti e granulociti e l'attività di scoppio ossidativo in campioni di sangue umano.

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

L'obiettivo generale di questo saggio è misurare la fagocitosi e l'attività di burst ossidativo di granulociti e monociti nel sangue intero. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, ad esempio in che modo un determinato intervento dietetico influisce sulla risposta immunitaria all'esercizio fisico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di un saggio semplice e diretto, facilmente modificabile per adattarsi alle risorse disponibili in laboratorio e agli interessi di ricerca.Utilizziamo questa misura della funzione immunitaria innata da oltre due decenni in molti dei nostri studi sull'esercizio fisico e condivideremo alcuni di questi dati più avanti nel video. Prima di iniziare la procedura, utilizzare un analizzatore emocitometrico per eseguire un emocromo completo con analisi differenziale dei globuli bianchi sui campioni di sangue, seguendo le istruzioni del produttore. Registrare il numero di globuli bianchi in cellule per millilitro e le percentuali di neutrofili e monociti per i campioni.Successivamente, per ogni provetta sperimentale e di controllo, utilizzare una pipetta con punta lunga per trasferire 100 microlitri di ciascun campione di sangue intero dalla provetta per la raccolta del sangue con eparina litica fino al fondo di una provetta da 12 × 75 millimetri opportunamente etichettata. Una volta trasferito tutto il sangue, aggiungere 10 microlitri della soluzione lavorativa di HE nelle provette contrassegnate con inchiostro rosso e con una H, inclusa la provetta di controllo HE. Togliere i tappi dalle provette.Vortexare brevemente i campioni e trasferire le provette in un bagnomaria a 37 gradi Celsius su un supporto metallico aperto, agitando delicatamente ogni cinque minuti. Dopo 15 minuti, trasferire rapidamente il supporto e le provette in un bagnomaria di ghiaccio per 12 minuti, agitando delicatamente ogni cinque minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere il volume appropriato di soluzione lavorativa di S.aureus non marcata nelle provette contrassegnate con inchiostro rosso e una H, compresa la provetta di controllo HE.Vortexare brevemente i tubi con i coperchi. Quindi aggiungere il volume appropriato di soluzione lavorativa di S. aureus marcata con FITC nei tubi etichettati con inchiostro nero e una F, inclusa la provetta di controllo FITC, e vortexare brevemente i campioni. Successivamente, incubare tutti i tubi nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per 20 minuti, agitando ogni cinque minuti, seguiti da un raffreddamento di un minuto nell'acqua ghiacciata.Dopo aver posizionato i campioni a temperatura ambiente, utilizzare una pipetta ripetitore per aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto fredda a tutti i tubi ed eseguire un vortex dei campioni. Riportare i campioni nel bagno di ghiaccio. Dopo un minuto, utilizzare la pipetta ripetitore per aggiungere un millimetro di PBS freddo a ciascuno dei tubi.Quindi vortexare i tubi e aggiungere ulteriori due millilitri di PBS ai campioni. Centrifugare ora le cellule ed eliminare il soprannadante. Utilizzando la pipetta ripetibile, aggiungere 50 microlitri di FBS freddo di ghiaccio ai tubi.Dopo aver agitato con il vortex, trasferire tutti i tubi su un portatubi. Utilizzare una stazione di lavoro automatizzata per la preparazione della lisi cellulare per lisare i globuli rossi e fissare i globuli bianchi seguendo le istruzioni del produttore. Per analizzare i risultati del saggio mediante citometria a flusso, aprire il software di acquisizione del sistema di citometria a flusso e creare un nuovo protocollo.Scegliere FITC come parametro FL1 per il saggio di fagocitosi e HE come parametro FL2 per il saggio di attività di burst ossidativo. Creare un grafico a dispersione di scattering anterogrado rispetto a quello laterale, un istogramma FL1 e un istogramma FL2. Quindi creare regioni poligonali per le popolazioni di globuli bianchi, granulociti e monociti sul grafico a dispersione anterogrado rispetto a laterale e creare regioni lineari sugli istogrammi.Ora eseguire il campione di controllo negativo contenente solo sangue, seguito dai campioni di controllo positivi HE e FITC, esaminando gli istogrammi e regolando, se necessario, le tensioni dei tubi fotomoltiplicatori dei canali FITC e PE. Quindi avviare l'acquisizione dei dati per i campioni di controllo. Dopo un periodo di equilibrazione di 15 minuti, caricare i campioni sperimentali sul portacampioni secondo l'ordine indicato nel foglio di lavoro ed eseguire l'analisi dei campioni in studio.Per valutare l'attività fagocitica dei campioni, consolidare innanzitutto tutti i file di dati in modalità elenco dei campioni etichettati con F e dei controlli in un'unica cartella e trascinare i file nello spazio del campione nel software di analisi della citometria a flusso. Fare doppio clic su un campione di controllo e utilizzare lo strumento di selezione della regione poligonale per impostare una regione per l'intera popolazione di globuli bianchi, avendo cura di includere tutte le cellule ai margini del grafico. Etichettare questa regione come WBC.Fare doppio clic sul cancello WBC e utilizzare il selettore di cancello ellittico per impostare il cancello dei linfociti. Etichettare il cancello in modo appropriato e trascinare la percentuale di dati del cancello lateralmente in modo che le cellule siano facilmente visibili. Quindi utilizzare il selettore di cancello poligonale per impostare il cancello dei granulociti e il cancello dei monociti.Etichettare ogni gate in modo appropriato e trascinare la percentuale di dati del gate verso il lato. Fare doppio clic sul campione di controllo FITC seguito dal gate dei granulociti e utilizzare i menu a discesa per impostare l'asse X su FL1 e l'asse Y su scatter laterale, o SS. Utilizzare il selettore di gate quadrato per definire un gate negativo per la fagocitosi e un gate positivo per la fagocitosi. Evidenziare il gate positivo per la fagocitosi della popolazione di granulociti.Quindi fare clic su Area di lavoro e Aggiungi statistica. Selezionare Media geometrica e FL1 per generare l'intensità di fluorescenza dei granulociti positivi alla fagocitosi e fare clic su Aggiungi. Successivamente, scegliere la frequenza della statistica principale e fare clic su Aggiungi per generare la percentuale di granulociti che risultano positivi alla fagocitosi.Per applicare queste impostazioni a tutti i campioni dello studio, selezionare tutti i gate e le statistiche creati nel campione controllo FITC e trascinarli nell'area Tutti i campioni nel pannello di gruppo. Salvare il lavoro come file WSP nella stessa cartella che contiene la cartella con i dati in modalità elenco. A questo punto, fare clic sul primo campione sperimentale nel set di dati e verificare che il gate dei globuli bianchi si adatti correttamente alla distribuzione cellulare in ciascun campione, regolando i bordi del gate secondo necessità.Ora fare clic sul gate dei globuli bianchi nel primo campione sperimentale e verificare che i gate di granulociti, monociti e linfociti corrispondano alla distribuzione cellulare in ciascun campione, regolando i gate se necessario. Dopo aver salvato il file, fare clic sull'icona dell'editor della tabella e trascinare ogni statistica di interesse nella tabella. Fare clic su Crea tabella per visualizzare i dati in formato foglio di calcolo e salvare il lavoro come file XLSX.Quindi ripetere l'analisi per i campioni di attività della scarica ossidativa marcati con H e per i file di dati in modalità elenco di controllo, come appena dimostrato. Come mostrato in questo esperimento rappresentativo, la fagocitosi mediata dai granulociti di S.aureus aumenta immediatamente e dopo 1,5 ore da un allenamento di ciclismo di 75 chilometri, tornando alla normalità già la mattina successiva. L'attività della scarica ossidativa dei granulociti risulta ridotta per almeno 21 ore dopo questo livello di attività.Inoltre, esiste una correlazione moderata tra la fagocitosi dei granulociti e i livelli sierici di proteina C-reattiva, come osservato in quest'analisi effettuata su 106 donne in sovrappeso o obese, indicando che un'elevata fagocitosi di granulociti e monociti in soggetti a riposo potrebbe essere indicativa di un'infiammazione sistemica. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata per circa 30 campioni in sette ore se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di raffreddare completamente i campioni prima di aggiungere i batteri, al fine di ridurre al minimo eventuali variabilità inspiegabili tra i campioni.Seguendo questa procedura, altri metodi, come la quantificazione delle citochine, possono essere eseguiti per determinare l'effetto del proprio intervento sulla risposta infiammatoria. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare gli effetti di diverse modifiche dello stile di vita e della funzione immunitaria innata nell'uomo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare la fagocitosi e l'attività del burst ossidativo di granulociti e monociti mediante citometria a flusso.Non dimenticare che lavorare con sangue umano può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare i dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, quando si esegue questa procedura.

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Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Haemophilus influenzae induce infiammazione delle vie respiratorie. Questo articolo si concentrerà sull'uso della citometria a flusso e della microscopia confocale per definire le risposte immunitarie dei fagociti e dei linfociti in risposta a questo batterio.

Valutazione delle risposte immunitarie respiratorie all'Haemophilus influenzae

Abbiamo sviluppato miglioramenti e metodi aggiornati per l'attuale test monocita-monostrato (MMA), in cui i macrofagi vengono utilizzati per aiutare a prevedere meglio la rilevanza clinica degli alloanticorpi dei globuli rossi nella medicina trasfusionale e nell'immunologia. Questo test è chiamato test dei monociti-macrofagi (M-MA).

Previsione del significato degli anticorpi dei globuli rossi utilizzando il test dei monociti-macrofagi

Questo lavoro descrive un protocollo standardizzato in vitro per quantificare e confrontare i tassi di fagocitosi dei globuli rossi xenogenici (umani) e allogenici (ratto) mediante macrofagi isolati di ratto.

Una valutazione quantitativa della fagocitosi degli eritrociti allogenici e xenogenici da parte dei macrofagi di ratto in vitro

Scopri come misurare la fagocitosi e l'attività di burst ossidativo di granulociti e monociti nel sangue umano. Questo metodo semplice e adattabile aiuta a studiare la funzione immunitaria innata.

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

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