Name: Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Apprenez à mesurer la phagocytose et l'activité oxydative des granulocytes et monocytes dans le sang humain. Cette méthode simple et adaptable évalue la fonction immunitaire innée pour la recherche en immunologie et physiologie de l'exercice.

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Les auteurs tiennent à remercier Zack Shue, Casey John et Lynn Cialdella-Kam pour leur aide lors de l&#39;optimisation de cette procédure.

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape, pour la détermination des deux indicateurs de granulocytes et de la fonction des monocytes. Nous avons identifié quelques étapes qui sont essentielles à la réussite de cet essai. Une telle étape est l&#39;incubation au bain de glace qui se produit immédiatement avant l&#39;addition de bactéries. refroidissement approfondie de tous les échantillons permettra de minimiser l&#39;effet de la température sur la phagocytose et OB activité. Une autre étape essentielle est l&#3...

Le granulocytes et des monocytes phagocytose / oxydatif (OB) dosage de l&#39; activité est une technique simple, straight-forward qui est fréquemment utilisé pour recueillir des informations sur la fonction immunitaire innée après un exercice prolongé et intensif. 1-4 Lors de l&#39; étude de la réponse du système immunitaire à un stimulus, les granulocytes et les monocytes sont d&#39; un intérêt particulier parce qu&#39;ils jouent un rôle central dans la défense de l&#39; hôte et sont les premières cellules immunitaires à accumuler sur le site de l&#39; infection. 5 neutrophiles, un type de granulocytes, sont les premières cellules à translocation dans le muscle endommagé tissus après un exercice intensif. 6 phagocytose et l&#39; activité de l&#39; OB sont les mesures les plus courantes de granulocytes et des monocytes fonction, 7 et sont préférés comme des indicateurs de la fonction immunitaire innée des cellules en raison de leur rôle central tant dans le processus d&#39;infection et le processus de réparation. L&#39;essai décrit dans ce utili manuscritzes un flux de base cytomètre pour fournir une détermination quantitative des granulocytes et des monocytes phagocytose et l&#39;activité OB dans le sang total. L&#39;utilisation du sang entier dans cette technique est avantageuse car elle permet le dosage à effectuer, sans un procédé de purification du temps. Ce test peut être facilement modifié pour accueillir une variété de modèles de recherche et des capacités de laboratoire. Par exemple, Liao et al. A utilisé une technique similaire pour montrer que l&#39; activité neutrophile OB est augmentée et neutrophiles phagocytose est diminué suite à une lésion cérébrale traumatique. 8 Dans un autre exemple, McFarlin et al. Décrit une modification élégante de cette technique qui utilise allophycocyanine (APC ) conjugué à CD66b et tandem haute performance APC conjugué étiquetage CD45 avec cytométrie en flux à base d&#39;images pour classer les granulocytes en termes de leurs activités de phagocytose et OB. 7,9 Notre groupe de recherche a utilisé diverses adaptations de ce technique comme un indicateur de la fonction immunitaire innée chez les populations en surpoids, obèses, et athlétiques depuis près de 20 ans. 10,11 Le texte ci - dessous fournit au lecteur des instructions étape par étape pour effectuer ce test et mettre en évidence les zones que le lecteur peut adapter pour répondre aux besoins de leur recherche.

<table><tbody><tr><td>12 tubes de 75 mm, avec capuchon</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>Vous aurez besoin de 2 tubes par échantillon (« H » et « F ») plus 3 tubes par lot (pour les contrôles de dosage ; « F », « H » et « Sang uniquement »).</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon de bouteille 0,2 & micro ; Filtre en acétate de cellulose (capacité de 500 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, poudre</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique (anhydre, culture cellulaire testée, culture cellulaire végétale testée)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium tribasique dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroéthidium (Hydroéthidine) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyle sulfoxyde (DMSO) Anhydrus</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp ;( Souche de bois sans protéine A) Bioparticules, conjuguée à la fluorescéine (FITC)</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp ;( Souche de bois sans protéine A) Bioparticules, non étiquetée</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>4,0 ml de vacutainer contenant 7,2 mg de K2EDTA, VWR séché par pulvérisation</td><td></td><td>BD367861</td><td>Vous aurez besoin de 1 tube de prélèvement sanguin K2EDTA par échantillon.</td></tr><tr><td>Vacutainer de 4,0 ml contenant 68 unités USP d’héparine de lithium, revêtement par pulvérisation</td><td>de BD367884</td><td></td><td>Vous aurez besoin de 1 tube de prélèvement sanguin d’héparine de lithium par échantillon.</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot ; T 5diff CP</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605705</td><td>c’est-à-dire , analyseur d’hématologie</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot ; T 5diff Rinçage</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot ; T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot ; T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot ; T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot ; T 5diff Cal Calibrator</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot ; T 5diff Control Plus</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff Diluant</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro ; l Pointes de pipette allongées</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>Bac à glace isolé</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>Pour bain d’eau glacée.</td></tr><tr><td>Rack de tubes métalliques ouvert</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine</td><td>Serum Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>TQ-Prep Workstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605429</td><td>i.e., poste de travail automatisé de préparation de lyse cellulaire Système de réactifs</td></tr><tr><td>ImmunoPrep</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>i.e., système de réactifs de fixation de lyse/WBC</td> RBC</tr><tr><td>Système de cytométrie en flux Cytomics FC500 MCL avec logiciel CXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>Fluide de gaine</td><td>IsoFlow Beckman Coulter</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>COULTER CLENZ</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check Fluorospheres&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td>i.e., fluorosphères d’alignement et de vérification fluidique</td></tr><tr><td>Logiciel FlowJo</td><td></td><td>FlowJo FlowJo</td><td>c’est-à-dire , logiciel d’analyse de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Logiciel Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel</td><td>c’est-à-dire , tableur électronique</td></tr></tbody></table>

mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative activité burst dans le sang humain

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Le test de phagocytose des granulocytes et des monocytes et de l’activité oxydative (OB) peut être utilisé pour étudier le système immunitaire inné. Ce manuscrit fournit la méthodologie nécessaire pour ajouter ce test à un arsenal d’immunologie d’exercice. La première étape de ce test consiste à préparer deux aliquotes (« H » et « F ») de sang total (héparine). Ensuite, du dihydroéthidium est ajouté à l’aliquote H, et les deux aliquotes sont incubées dans un bain d’eau chaude suivi d’un bain d’eau froide. Ensuite, Staphylococcus aureus (S. aureus) est ajouté à l’aliquote H et S. aureus marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine est ajouté à l’aliquote F (bactérie :phagocyte = 8:1), et les deux aliquotes sont incubées dans un bain d’eau chaude suivi d’un bain d’eau froide. Ensuite, du bleu de trypan est ajouté à chaque aliquote pour éteindre la fluorescence extracellulaire, et les cellules sont lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, les globules rouges sont lysés et les globules blancs sont fixés. Enfin, un cytomètre en flux et un logiciel d’analyse approprié sont utilisés pour mesurer la phagocytose des granulocytes et des monocytes et l’activité des OB. Ce test est utilisé depuis plus de 20 ans. Après un effort intense et prolongé, les athlètes ressentent une augmentation significative mais transitoire de la phagocytose et une diminution prolongée de l’activité OB. L’augmentation de la phagocytose après l’exercice est corrélée à l’inflammation. Contrairement aux individus de poids normal, la phagocytose des granulocytes et des monocytes est chroniquement élevée chez les participants en surpoids et obèses, et est modestement corrélée avec la protéine C-réactive. En résumé, ce test basé sur la cytométrie en flux mesure la phagocytose et l’activité OB des phagocytes et peut être utilisé comme mesure supplémentaire de l’inflammation induite par l’exercice et l’obésité.

Un exercice prolongé et intensif a des effets profonds sur la fonction immunitaire innée, y compris la fonction naturelle de tueur de cellules, la réponse de cytokine macrophage à une infection virale, et granulocytes et des monocytes phagocytose et l&#39;activité de l&#39;OB. Plusieurs études indiquent que la phagocytose des augmentations de granulocytes et de monocytes de manière significative après l&#39;exercice, ce qui reflète l&#39;inflammation induite par des lésions musculaires e...

Le but de ce manuscrit est de présenter une méthode de mesure de la phagocytose des monocytes et des granulocytes et de l’activité oxydative dans des échantillons de sang humain.

Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

L'objectif général de ce test est de mesurer la phagocytose ainsi que l'activité du burst oxydatif des granulocytes et des monocytes dans le sang total. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que l'influence d'une intervention alimentaire particulière sur la réponse immunitaire à l'exercice. Le principal avantage de cette technique réside dans sa simplicité et sa facilité d'exécution, tout en pouvant être aisément modifiée afin de tenir compte des ressources disponibles en laboratoire et des intérêts de recherche.Nous utilisons cette mesure de la fonction immunitaire innée depuis deux décennies dans de nombreux essais sur l'exercice, et nous partagerons certaines de ces données plus tard dans la vidéo. Avant de commencer la procédure, utilisez un analyseur d'hématologie pour effectuer une numération globulaire complète avec analyse différentielle des leucocytes sur les échantillons de sang, conformément aux instructions du fabricant. Notez la numération des leucocytes en cellules par millilitre ainsi que les pourcentages de neutrophiles et de monocytes pour les échantillons.Ensuite, pour chaque tube expérimental et témoin,

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Immunology and Infection

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