Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena
13 agosto 2016
Protocolli per la coltura di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), la trasfezione transitoria di marcatori marcati in fluorescenza della crescita dei microtubuli, l'imaging di cellule vive e l'analisi automatizzata delle dinamiche di crescita dei microtubuli interfasici.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di coltivare cellule endoteliali della vena ombelicale umana e di analizzare la dinamica del citoscheletro e la migrazione cellulare utilizzando l'imaging time lapse su cellule vive. I metodi descritti in questo video possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della cellula, della molecolare e della meccanobiologia. Ad esempio, questo protocollo può essere utilizzato per identificare come la forma e la motilità cellulare sono modulate dall'impegno di diversi ECM.
La dimostrazione visiva è fondamentale perché le fasi di preparazione del campione sono difficili da eseguire. Richiedono una manipolazione precisa delle celle in modo tempestivo durante tutto il processo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla motilità delle cellule endoteliali durante l'angiogenesi, può anche essere applicato a indagini microscopiche di praticamente qualsiasi sistema modello di cellule aderenti.
Usando una pinza, raccogli un vetrino coprioggetti da un barattolo di etanolo al 100% e passalo attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen per sterilizzarlo. Quindi metterlo in una capsula di Petri da 35 millimetri. Preparare un vetrino coprioggetti per ogni campione.
A una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione madre di fibronectina e 990 microlitri di PBS. Quindi pipettare 250 microlitri di soluzione su ciascun vetrino coprioggetti. Stendere la soluzione in modo uniforme fino a coprire la superficie.
Incubare i vetrini coprioggetti per un minimo di tre ore a 37 gradi Celsius. Prima dell'uso, sciacquare ogni vetrino coprioggetti tre volte con due millilitri di PBS. Utilizzando un emocitometro, determinare il numero di HUVEC in coltura e trasferire un volume contenente 100.000 cellule per vetrino coprioggetti per esperimenti di non migrazione o 500.000 cellule per vetrino coprioggetti per esperimenti di migrazione in una provetta da microcentrifuga.
Girare le celle a 1, 400 volte G per quattro minuti per pellettizzarle. Dopo la centrifuga, per ogni condizione da testare, risospendere fino a un milione di cellule in 100 microlitri di tampone di elettroporazione e combinarle con un microgrammo di cDNA. Trasferire le celle in una cuvetta per elettroporazione.
Trasfettare le cellule e la miscela di DNA utilizzando il programma designato per l'elettroporazione HUVIC. Successivamente, salvare le cellule trasfettate aggiungendo 500 microlitri di terreno basale endoteliale completo. Quindi, placcare il volume cellulare appropriato sui vetrini coprioggetti rivestiti di fibronectina.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore per consentire il tempo per l'espressione dei costrutti di cDNA. In preparazione per l'imaging, prendere due strisce di nastro biadesivo da 2,5 centimetri per 0,65 centimetri e fissarle orizzontalmente lungo il bordo superiore e inferiore di un vetrino pulito. Si noti che è importante lasciare una piccola quantità di spazio tra il nastro e il bordo del vetrino per sigillare la camera.
Montare il vetrino coprioggetti con la cella rivolta verso il basso in modo che i due bordi del vetrino coprioggetti poggino sul nastro. Usa una pinza per premere delicatamente verso il basso per fissare il vetrino coprioggetti. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 40 microlitri di terreno di imaging tra il vetrino coprioggetti e il vetrino.
Assicurarsi che lo spazio tra il vetrino coprioggetti e il vetrino sia completamente riempito con il mezzo di imaging. Se necessario, tamponare il supporto in eccesso con un panno di carta. Sigillare tutti i bordi della guida con VALAP caldo.
Verificare la presenza di perdite spingendo delicatamente il vetrino coprioggetti. Posizionare il vetrino coprioggetti montato e sigillato su un tavolino da microscopio preriscaldato a 37 gradi Celsius. Utilizzando un microscopio confocale a disco rotante, acquisisci sequenze di immagini time lapse, immagini di proteine fluorescenti blu e immagini DIC.
Analizzare la dinamica dei microtubuli e la co-localizzazione come descritto nel documento di accompagnamento. Per eseguire un saggio di migrazione cellulare, dopo la fase di elettroporazione, salvare le cellule trasfettate aggiungendo 80 microlitri di terreno basale endoteliale completo. Quindi, pipettare l'intero campione da 80 microlitri in una singola goccia al centro di un vetrino coprioggetti essiccato rivestito di fibronectina.
Non spargere la goccia. L'asciugatura del vetrino coprioggetti è necessaria per evitare che la goccia da 80 microlitri si separi al contatto con il vetrino. Questo approccio consente di concentrare gli HUVEC all'interno di una piccola area del vetrino coprioggetti e quindi promuove la rapida formazione di un monostrato confluente di cellule.
Incubare il vetrino coprioggetti a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore per dare il tempo alle cellule di aderire in un monostrato confluente. Quindi sciacquare i vetrini due volte in mezzo basale endoteliale completo per rimuovere eventuali cellule che non si sono attaccate. Per creare un bordo della ferita sul monostrato HUVEC, utilizzare una pinza per tenere delicatamente in posizione il vetrino coprioggetti e trascinare con decisione una lama di rasoio al centro del monostrato cellulare.
Lasciare che le cellule si riprendano in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi assemblare e montare i vetrini coprioggetti per l'imaging come prima. Acquisizione di immagini a contrasto di fase a intervalli di 10 minuti per 12 ore utilizzando un obiettivo di fase ad apertura numerica 10X 0,45 e un condensatore a lunga distanza di lavoro con apertura numerica 0,52.
Utilizzare il pannello Acquisizione ND del programma software di acquisizione immagini. Infine, quantificare la ramificazione e la migrazione HUVEC come descritto nel documento di accompagnamento. Gli HUVEC sono stati trasfettati per esprimere EB3 marcato con mApple, una proteina legante l'estremità dei microtubuli e sono state catturate immagini time lapse.
Le immagini grezze di EB3 sono mostrate a sinistra. Le comete blu EB3 tracciate dal software plusTipTracker sono mostrate a destra. Le comete rilevate all'interno di ogni fotogramma sono state collegate in base al loro cambiamento di posizione da un fotogramma all'altro per generare tracce EB3 e una sovrapposizione visiva di tracce EB3, come mostrato qui.
La crescita lenta e breve dei microtubuli è mostrata in rosso, la crescita lenta e longeva dei microtubuli è mostrata in verde, la crescita veloce e breve dei microtubuli è mostrata in giallo e la crescita rapida e longeva dei microtubuli è mostrata in blu. Per analizzare la ramificazione delle cellule endoteliali, è stata catturata una CID e un'immagine fluorescente di un singolo HUVEC con un ingrandimento di 60 volte. Un confine è stato disegnato a mano attorno al bordo della cella nell'immagine fluorescente.
Le origini dei rami sono state quindi definite tracciando una linea retta attraverso il ramo e attraverso il massimo angolo di curvatura su entrambi i lati del ramo. Sono stati contati rami più lunghi che larghi e lunghi almeno 10 micron e la lunghezza è stata misurata dall'origine del ramo alla punta distale del ramo. Per valutare la migrazione del bordo della ferita delle cellule endoteliali, gli HUVEC sono stati coltivati ad alta densità ed è stato eseguito l'imaging time lapse su cellule vive dopo la ferita, come descritto in questo video.
Come mostrato qui, le cellule endoteliali del bordo della ferita sono migrate direzionalmente nell'area della ferita. Questo movimento è stato analizzato utilizzando il nucleolo come marcatore fiduciario per tracciare la velocità di migrazione, la persistenza e la distanza. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare, trasfettare e preparare gli HUVEC per esperimenti di imaging della forma cellulare e della dinamica del citoscheletro o per studi di migrazione cellulare sul bordo della ferita.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la coniugazione di poliacrilammide o collagene per rispondere a ulteriori domande relative al coinvolgimento cellulare delle ECM modificate. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
Panoramica
In questo articolo vengono descritti i protocolli per la coltura di cellule endoteliali provenienti dalla vena ombelicale umana (HUVECs) e per l'analisi della dinamica dei microtubuli mediante imaging in tempo reale su cellule vive. I metodi illustrati possono fornire informazioni sul movimento cellulare e sul comportamento del citoscheletro in diversi contesti sperimentali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
- Mecanobiologia
Sfondo
- Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana sono fondamentali per lo studio dell'angiogenesi.
- Comprendere la dinamica del citoscheletro è essenziale per ottenere informazioni sulla migrazione cellulare.
- Le tecniche di imaging su cellule vive permettono l'osservazione in tempo reale dei processi cellulari.
- Una manipolazione precisa delle cellule è necessaria per ottenere risultati sperimentali soddisfacenti.
Scopo dello studio
- Analizzare come la forma cellulare e la motilità siano influenzate dall'interazione con la matrice extracellulare.
- Fornire una dimostrazione visiva di tecniche complesse di preparazione del campione.
- Facilitare la comprensione del comportamento delle cellule endoteliali durante l'angiogenesi.
Metodi Utilizzati
- Coltivazione di HUVECs su coverslip rivestiti con fibronectina.
- Trasfezione transiente delle cellule con marcatori fluorescenti per l'analisi mediante imaging.
- Acquisizione di immagini in time-lapse su cellule vive mediante microscopio confocale a disco rotante.
- Analisi automatizzata della dinamica della crescita dei microtubuli e della migrazione cellulare.
Risultati principali
- L'acquisizione temporale ha rivelato dinamiche dettagliate dei microtubuli nelle HUVEC.
- Le cellule trasfettate hanno mostrato schemi distinti di crescita dei microtubuli.
- Saggi di migrazione cellulare hanno dimostrato gli effetti della matrice extracellulare sul comportamento cellulare.
- L'analisi quantitativa ha fornito informazioni sulla ramificazione delle cellule endoteliali.
Conclusioni
- I protocolli stabiliti sono applicabili a vari modelli di cellule aderenti.
- Le tecniche di imaging in tempo reale sono utili per lo studio della dinamica del citoscheletro.
- Comprendere il comportamento delle HUVEC può fornire indicazioni per strategie terapeutiche nell'angiogenesi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
L'imaging in time-lapse ad alta risoluzione e l'analisi automatizzata della dinamica dei microtubuli in HUVECs consentono una quantificazione precisa del comportamento del citoscheletro alla base della ramificazione e della migrazione delle cellule endoteliali. Questa capacità è fondamentale per ridurre i rischi associati a target di angiogenesi nelle fasi iniziali e supporta una maggiore affidabilità predittiva nei programmi di biologia vascolare. L'approccio rafforza la continuità traslazionale dalla scoperta allo sviluppo di modelli preclinici nella ricerca sull'angiogenesi e sul microambiente tumorale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette la visualizzazione diretta e la quantificazione della dinamica dei microtubuli in cellule endoteliali vive.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica di bersagli citoscheletrici coinvolti nell'angiogenesi.
- Facilita la validazione funzionale di geni candidati o vie di segnalazione che influenzano la ramificazione e la migrazione cellulare.
- Fornisce parametri quantitativi per l'analisi del bersaglio e la selezione del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce saggi validati di imaging in cellule vive per lo studio della dinamica del citoscheletro e della motilità cellulare.
- Fornisce misurazioni riproducibili e quantitative delle velocità di crescita e della durata dei microtubuli.
- Consente il tracciamento e l'analisi automatizzati delle estremità più (+) dei microtubuli marcati con fluorescenza.
- Prepara piattaforme saggio robuste per lo screening di composti mirati alla funzione delle cellule endoteliali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea il comportamento delle cellule endoteliali in vitro a modelli di angiogenesi rilevanti per la malattia.
- Supporta la continuità dal meccanismo cellulare alla validazione preclinica di strategie anti-angiogenetiche.
- Fornisce parametri clinicamente rilevanti per la valutazione di interventi sperimentali nel rimodellamento vascolare.
- Riduce l'incertezza biologica nello sviluppo di agenti modulatori dell'angiogenesi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa metodologia integra le fasi della scoperta iniziale fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica nei percorsi di biologia vascolare e oncologia.
- Biologia della scoperta L'imaging quantitativa e l'analisi chiariscono il ruolo meccanicistico della dinamica dei microtubuli nella ramificazione e migrazione endoteliale.
- Screening: Saggi automatizzati e riproducibili consentono una valutazione ad alto contenuto di perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Analitica: Fornisce output statistici robusti sui tassi di crescita dei microtubuli, sulla durata della loro vita e sui parametri della migrazione cellulare.
- Ricerca traslazionale Collega le dinamiche del citoscheletro in vitro a processi angiogenetici rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Il flusso di lavoro è adattabile ad altri modelli di cellule aderenti e a bersagli del citoscheletro.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi citoscheletrici e nella comprensione meccanicistica dell'angiogenesi.
- Valore operativo: Standardizza l'immagineggiamento di cellule vive e l'analisi automatizzata per una generazione di dati riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo endpoint quantitativi ancorati a meccanismi specifici.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei programmi di angiogenesi e migrazione cellulare in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagineggiamento di cellule vive, nella trasfezione e nell'analisi quantitativa delle immagini.
- Richiede l'accesso a microscopia confocale a disco rotante ad alta risoluzione e a strumenti di analisi computazionale.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione intersquadra dei protocolli di acquisizione e analisi delle immagini.
- Adattabile a diversi tipi di cellule aderenti e marcatori del citoscheletro, previa ottimizzazione del protocollo.
- Le condizioni di preparazione del campione e di acquisizione devono essere strettamente controllate per garantire la riproducibilità.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Coverslip Preparation Prior to Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) Culture
2:06
cDNA Transfection and HUVEC Culture on Coverslip
3:36
Preparation of Specimen for Imaging
5:14
Cell Migration Assay
7:24
Representative Imaging Results
9:41
Conclusion
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