Un protocollo dettagliato per caratterizzare la linea cellulare murina C1498 e il suo modello associato leucemia mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare le cellule murine C1498 e la leucemia acuta che inducono dopo l'iniezione endovenosa nei topi. Il vantaggio principale di questa procedura è che la leucemia mielomonocitica murina indotta dopo un'iniezione di cellule C1498 presenta molte caratteristiche della malattia umana. Questo modello animale può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ematologia, come ad esempio quali sono i meccanismi che portano allo sviluppo della leucemia e all'immunodeficienza.

Le implicazioni di questo modello animale si estendono al trattamento della leucemia in quanto facilita la sperimentazione di nuovi agenti chemioterapici e immunoterapeutici. Inizia trasferendo una femmina di topo congenico C57 nero 6 di cinque o sei settimane in una cappa a flusso laminare sterile. Quindi, metti l'animale in un sistema di contenzione.

Quindi, caricare una siringa da un milliletro dotata di un ago calibro 29 con 100 microlitri di cellule. Afferrare la coda dell'estremità distale e disinfettare la pelle della coda con una garza imbevuta di etanolo al 70%. Procedere con l'iniezione lenta una volta 10 alla sesta cellula in una vena di coda laterale.

Quando tutte le cellule sono state erogate, rimuovere l'ago e applicare una leggera pressione alla vista dell'iniezione con una garza sterile. Quindi rimetti l'animale nella sua gabbia con un attento monitoraggio per le prossime settimane. Da 17 a 19 giorni dopo, inserire un tubo capillare nel canto mediale dell'occhio dell'animale leucemico anestetizzato.

Da 100 a 200 microlitri di sangue verranno prelevati dal seno oribolare nel tubo capillare. Rimuovere il tubo e controllare l'emorragia con l'applicazione delicata di una spugna di garza sterile sull'occhio. Quindi, trasferire il sangue in una provetta EDTA e conservare la provetta in ghiaccio fino all'isolamento della cellula mononucleata.

Per isolare le cellule mononucleate del sangue, aggiungere prima PBS integrato con un EDTA millimolare fino a un volume finale di 500 microlitri. Quindi, trasferire il campione in una provetta da microcentrifuga. Successivamente, utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 30 per stratificare accuratamente 500 microlitri di soluzione separatore sotto il sangue, facendo attenzione a non mescolare gli strati.

Separare le cellule mediante centrifugazione e utilizzare una pipetta per trasferire lo strato di cellule mononucleate bianche opache in una nuova provetta per microcentrifuga. Quindi, lavare le cellule immunitarie in un millilitro di PBS. Centrifugarli e risospendere il pellet in 600 microlitri di tampone FACS per la colorazione e l'analisi mediante citometria a flusso.

Per isolare il midollo osseo, posiziona il topo sulla schiena su una tavola di plastica e fissa gli arti dell'animale. Disinfettare l'animale con etanolo al 70%. Quindi, taglia ciascuna gamba nella parte superiore del femore sopra l'articolazione e tira delicatamente le tibie per scollegarle dai femori.

Usa pinze e forbici per rimuovere la pelle e i muscoli dalle ossa e trasferisci le ossa in una capsula di Petri con ghiaccio. Usa le forbici per rimuovere le estremità. Quindi inserire un ago calibro 26 collegato a una siringa da 10 millilitri contenente cinque millilitri di PBS freddo all'estremità di un osso alla volta e sciacquare le midollo osseo nel piatto.

Passare più volte la sospensione cellulare attraverso la punta dell'ago per distruggere le cellule del midollo osseo. Quindi, filtrare le celle attraverso un nuovo filtro da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri per ottenere una sospensione a cella singola. Centrifugare le celle e risospendere il pellet in due millilitri di tampone di lisi.

Riempire immediatamente la provetta con un massimo di 50 millilitri di PBS freddo e centrifugare le cellule. Quindi, risospendere il pellet di midollo osseo una volta da 10 a un sesto di cellule per millilitro in tampone FACS freddo. Per preparare prima le cellule del midollo osseo per la colorazione, posizionare i vetrini in camere monouso con schede filtranti premontate e posizionare le camere in una citocentrifuga.

Aggiungere 100 microlitri di tampone FACS in ciascuna camera della scheda filtrante e centrifugare brevemente i vetrini. Al termine della centrifuga aggiungere 100 microlitri di cellule in ogni camera e centrifugare le cellule. Quindi, rimuovere con cautela i vetrini dalle camere per l'asciugatura all'aria.

Per colorare le cellule del midollo osseo, immergere i vetrini in un barattolo di coplin contenente la soluzione di May-Grunwald per cinque minuti. Successivamente, trasferire i vetrini in un barattolo di soluzione tampone con un pH di 6,8 per un minuto. Quindi, trasferire i vetrini nella soluzione Giemsa R per 10 minuti.

Seguito da un lavaggio di 10 secondi con acqua a pH neutro. Dopo il lavaggio, lasciare asciugare i vetrini all'aria e applicare una goccia di terreno di montaggio su ciascun campione. Quindi, posizionare un bordo di un vetro di copertura sul vetrino e abbassare con cautela il vetro di copertura sulle celle premendo delicatamente per rimuovere eventuali bolle d'aria.

Rispetto agli animali di controllo, gli animali iniettati con cellule C1498 mostrano una massiccia infiltrazione di cellule C1498 nel midollo osseo, come osservato dall'aspetto simile a un blasto delle cellule. Le cellule C1498 infiltranti il midollo osseo mostrano fenotipi monocitici e granulocitici indicativi rispettivamente di cellule monoblastiche e mieloblastiche, caratteristici della leucemia mielomonocitica acuta. L'analisi citofluorimetrica delle frequenze delle cellule mononucleate nei campioni di sangue dei topi iniettati con C1498 indica che circa un quarto dell'intera popolazione di globuli bianchi è costituita da cellule leucemiche.

Le frequenze dei linfociti T e B sono simili tra gli animali di controllo e quelli iniettati con C1498. Le frequenze dei monociti, tuttavia, sono osservate a livelli più elevati nei topi iniettati con C1498, una caratteristica della leucemia mielomonocitica acuta. Quando si eseguono le procedure di citochimica e May-Grunwald Giemsa, è importante ricordare di mantenere i valori di pH, le temperature e i tempi di incubazione appropriati.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare la leucemia mielomonocitica acuta. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ematologia per esplorare la natura della leucemia acuta spontanea e indotta in altri modelli animali.