Name: Un protocollo dettagliato per caratterizzare la linea cellulare murina C1498 e il suo modello associato leucemia mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Impara a caratterizzare le cellule C1498 murine e la leucemia mielomonocitica acuta indotta nel modello mouse. Questo protocollo utilizza citometria a flusso e colorazione May-Grünwald Giemsa per analizzare l'infiltrazione midollare e testare nuovi trattamenti.

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Gli autori ringraziano la "Ligue Nationale contre le Cancer" (Comité du Septentrion), il SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) e l'Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) per aver sostenuto questo lavoro. Desiderano ringraziare Delphine Taillieu e il personale della struttura per animali per aver ospitato i topi e aver mantenuto il loro benessere. Ringraziamo anche Raphaëlle Caillerez e Nathalie Jouy per il loro rispettivo aiuto in microscopia e citometria a flusso.

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<li>Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+free+C1498+%28granulocytic+leukemia%29+tumor+cells+in+the+peritoneal+fluid+and+the+blood+of+C57+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice.</a> Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In studi precedenti, la linea cellulare C1498 è stato descritto come un induttore di granulocitica acuta 5, mielomonocitica 6 o 7 NKT leucemia a cellule. Tuttavia, i dati dimostrativi in ​​letteratura erano assenti o incompleti. Il protocollo qui presentata utilizza tecniche diverse, come la citometria a flusso, immunofluorescenza, MGG colorazione e saggi citochimiche, per caratterizzare le cellule in coltura e C1498 per determinare la natura della leucemia che è indotta nei topi dopo che sono stati iniettati. Quando abbiamo phenotyped in cellule C1498 vitro in coltura dopo immunostaining e citometria a flusso sono state eseguite le analisi, abbiamo osservato alcune limitazioni, perché queste cellule hanno espresso alcuni marcatori di superficie delle cellule ematopoietiche che sono stati precedentemente descritti in letteratura 6,7. In accordo con i nostri risultati, Labelle et al., Non ha rispettato l&#39;espressione di superficie delle cellule del maturo TCR sulle cellule C1498 con cytomet flussory colorazione. Tuttavia, li hanno considerati come una linea di cellule NKT dopo aver rilevato CD3ε e TCRVβ8.2 mRNA 7. Abbiamo anche osservato l&#39;espressione intracellulare di catene TCRVβ e molecole CD3ε nella maggior parte delle cellule (&gt; 70%), ma le loro linee ematopoietiche non è stato possibile determinare perché c&#39;era anche concomitante espressione intracellulare del Mac-3 molecola. Mieloperossidasi, MGG colorazione e valutazioni per analizzare esterasi funzionali utilizzando cytochemistry dimostrato che la linea cellulare C1498 ha avuto un&#39;origine mieloide e era composto da monoblasti e mieloblasti. Questi risultati erano in accordo con la percentuale di cellule Mac-3 + che sono stati ottenuti in citometria a flusso colorazione. Sebbene non quantitativa, questi passaggi rappresentano esperimenti chiave da eseguire. In effetti, essi rimangono, fino ad ora, i migliori metodi esistenti per la caratterizzazione del lignaggio e la differenziazione fase di cellule ematopoietiche che esprimono no o Fmarcatori fenotipici specifici Ew. Citometria a flusso colorazione è stato utile per dimostrare lo sviluppo di leucemia acuta nei topi congenic dopo C1498 cellule sono state iniettate per via endovenosa. I CD45.2 + C1498 cellule che si infiltrarono nel sangue periferico e vari organi sono stati isolati, e le loro frequenze sono state determinate. La quantificazione è stata effettuata anche per analizzare midollare intrinseca e le cellule della milza dopo immunofenotipizzazione. Sono stati rilevati Limitazioni quando il fenotipo cellulare C1498 è stata esaminata in organi come espressi alcuni marcatori ematopoietici (solo alcuni di loro erano B220 +). Per definire la natura della leucemia acuta osservato, May-Grünwald Giemsa e un&#39;analisi delle attività di monocitica e esterasi granulocitari state eseguite utilizzando midollo osseo. I risultati hanno mostrato che le cellule C1498 conservato la loro morfologia e la funzione mieloblastica e monoblastica, rivelando l&#39;insorgenza della leucemia mielomonocitica. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In considerazione delle fasi critiche descritte in questo protocollo, particolare attenzione dovrebbe essere data a pH durante l&#39;esecuzione di reazioni citochimiche e MGG colorazione perché gli errori di pH possono portare a interpretazioni non corrette dei risultati. Per esempio, α-naftil butirrato esterasi attività è specifica per le cellule monocitiche solo a pH di 6,0 perché granulociti e linfociti possono macchiare positivo per questo test a valori di pH superiori. Fissarsi le cellule non è raccomandato prima di eseguire MGG colorazione, e ci ha mostrato che solo la fissazione CAF ha fornito risultati soddisfacenti durante l&#39;esecuzione di esterasi reazioni citochimiche utilizzando C1498 cellule. Per preservare l&#39;espressione della molecola CD115 e la sua individuazione mediante citometria a flusso, tutti i campioni (cellule esempio, sangue, midollo osseo e milza) deve essere mantenuto in ghiaccio durante la procedura. Se nessuna colorazione si osserva in citometria a flusso o / e immunofluorescenza, il riferimento degli anticorpi, loro immagazzinamento reencomi e le loro diluizioni devono essere controllati. I riferimenti indicati nella tabella materiali / attrezzature sono state selezionate per le applicazioni citometria di flusso o di immunofluorescenza. Le primarie / anticorpi secondari o loro fluorofori coniugati potrebbero aver perso la loro attività a causa di stoccaggio inadeguato (ad esempio, l&#39;esposizione alla luce o al calore), la diluizione improprio, vasta di congelamento / scongelamento o l&#39;uso di tamponi contaminati. Eseguire controlli positivi per garantire che funzionino correttamente. Usa il mouse midollo osseo o cellule della milza-derivati ​​che sono noti per esprimere le proteine ​​di interesse. Per evitare di fondo e marcatura non specifica, fare in modo che le cellule vengono lavate correttamente e mantenuti a elevata umidità (per immunofluorescenza) e che gli anticorpi sono diluiti secondo le istruzioni. Utilizzare la stessa concentrazione e diluizione per l&#39;anticorpo di controllo isotipo e l&#39;anticorpo primario per determinare con precisione il livello di fondo nel campione. Per gli esperimenti esterasi citochimica, lareagenti possono essere testati utilizzando vetrini di controllo positivi e negativi, che contengono il mouse purificato granulocitica della milza (Ly6G +) e monocitica (+ CD115), le cellule. La procedura descritta in questo studio ha dimostrato che molte delle caratteristiche leucemici osservati nei topi dopo l&#39;iniezione di cellule C1498 condiviso caratteristiche comuni con umana leucemia mielomonocitica acuta 11,12. Le cellule leucemiche invase comportato una riduzione di mature e immature (progenitori e precursori) cellule ematopoietiche midollari. cellule C1498 sono presenti a frequenza elevata (&gt; 20%) nel sangue periferico, come lo sono le cellule monociti. Epatomegalia e splenomegalia sono stati osservati per derivare dalla infiltrazione di cellule leucemiche, e aumenti significativi linfociti B e delle cellule mieloidi sono state osservate anche per accompagnare splenomegalia. Trombocitopenia è stata osservata anche quando i numeri delle piastrine del sangue sono stati stimati utilizzando un analizzatore ematologico. E &#39;stato spettacolon, con esperimenti in vitro, che C1498 cellule inibiscono la normale emopoiesi murina secernendo fattori solubili 13. In diversi modelli murini di tumore, le cellule mieloidi immature (tra cui monociti e cellule granulocitari) hanno anche dimostrato di migrare dal midollo osseo alla milza, dove inibiscono l&#39;attivazione delle cellule T specifiche anti-tumorale e la proliferazione 14. Pertanto, la riduzione in cellule ematopoietiche che è stato osservato nel midollo osseo potrebbe essere il risultato di una carenza sia in ematopoiesi e / o dal loro emigrazione. Quest&#39;ultimo meccanismo potrebbe spiegare la presenza di monocitosi nel sangue periferico o l&#39;osservazione di frazioni mieloidi ingrandita nella milza. E &#39;anche ipotizzabile che queste cellule avrebbero potuto essere derivato dal miglioramento della emopoiesi della milza. Infatti, in condizioni stazionarie, alcuni sottoinsiemi di cellule B della milza sono stati identificati come precursori di linfociti maturi B 15. Inoltre, in condizioni infiammatorie, medLe cellule staminali midollare e progenitori hanno dimostrato di trasferirsi alla milza per indurre la produzione di monociti maturi 16. Questo protocollo non ci permette di trarre conclusioni per quanto riguarda i meccanismi che sono coinvolti nello sviluppo della leucemia, e saggi funzionali nonché molecolari supplementari dovrebbero essere impiegate per farlo. Tuttavia, questi dati includono informazioni dettagliate sulle caratteristiche cliniche della leucemia mielomonocitica acuta e aiuteranno i ricercatori a valutare e comprendere gli effetti dei nuovi agenti terapeutici.

leucemia mieloide acuta (LMA) è caratterizzata dalla proliferazione incontrollata di cellule mieloidi ematopoietiche che sono bloccati in diversi stadi di maturazione. Questo disregolazione può influenzare il granulociti, monociti, eritrocitaria o percorsi di differenziazione megaryocytic 1. cellule AML si accumulano nel midollo osseo, con conseguente compromissione emopoiesi, che si traduce in trombocitopenia, linfopenia e anemia. Le cellule leucemiche anche invadere il sangue e gli organi non linfoidi. Il modello C1498 del mouse è stato utilizzato per decenni come modello per la leucemia acuta poiché le cellule tumorali sono stati isolati da un leucemico 10 mesi C57BL / 6 (H-2 b) topo femmina nel 1941. La letteratura descrive l&#39;invasione nel sangue , gli organi ematopoietici (ad esempio, i milza e nei linfonodi) e gli organi non ematopoietici (ad esempio, il fegato, i polmoni, ovaie e reni) da parte delle cellule C1498 altamente proliferative dopo che sono stati iniettati attraverso un aendovenosa, sottocutanea o via intraperitoneale in topi suscettibili 2-4. Tuttavia, questo modello di topo è stato segnalato per indurre sia granulocitica 2,5 o 6 mielomonocitica leucemia. Più recentemente, uno studio pubblicato nel 2002 ha descritto questo tipo di cancro, come la leucemia cellule murine NKT 7. Così, letteratura differisce circa la natura di questa linea cellulare C1498 e leucemia associato induce nei topi. Queste discrepanze sono dovute principalmente alla mancanza di dettagliate e aggiornate informazioni pubblicate sulle cellule e la malattia leucemica in generale, perché molti studi sono stati effettuati nel 1950 - &#39;70. Qui forniamo un protocollo dettagliato per descrivere come caratterizzare cellule C1498 e analizzare la natura della malattia leucemica che è indotta dalla loro iniezione endovenosa in topi. La prima sezione di questo protocollo è dedicato ad una descrizione di cellule C1498 che sono stati coltivati in vitro. contro fluorescentecorpi diretti contro la superficie e marcatori ematopoietici intracellulari sono stati usati per determinare il loro fenotipo mediante citometria a flusso. La presenza di mieloperossidasi è stata valutata utilizzando la microscopia di immunofluorescenza, la loro stirpe ematopoietico e differenziazione fase sono stati valutati utilizzando citochimica per valutare l&#39;attività di esterasi, ed è stata effettuata maggio-Grünwald Giemsa. Le cellule C1498 sono state iniettate in topi, e la malattia leucemia acuta che è stata indotta è descritto nella seconda sezione di questo manoscritto. Le stesse tecniche sono stati usati per determinare le frequenze ed i fenotipi di cellule leucemiche e inerenti nel midollo osseo, sangue periferico, la milza e gli organi non ematopoietici (il fegato e polmoni). Questo protocollo è altamente riproducibile, ed i dati presentati qui aiuterà i ricercatori a valutare gli effetti di nuove strategie terapeutiche. Questo modello leucemia del mouse è già stato utilizzato per testare immunoterapia avvicina unnd diversi farmaci chemioterapici cancro 8,9. La loro efficacia è stata valutata determinando l&#39;evoluzione del carico tumorale e il tasso di sopravvivenza. Questo protocollo può essere utilizzato per fornire ulteriori informazioni sulla distribuzione e la sussistenza delle popolazioni di cellule ematopoietiche leucemiche e altri durante il trattamento.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare C1498</td><td>ATCC</td><td>TIB 49</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Ly5.1</td><td>Charles River</td><td>B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per colture cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Gibco (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630</td><td></td></tr> Soluzione di <tr><td>aminoacidi non essenziali, Gibco&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina, Gibco&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (Gibco, integratore GlutaMAX)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio, Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per colorazione per citometria a flusso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-topo B220 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0452</td><td>clone RA3-6B2, diluizione finale 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo B220 biotina (2)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0452</td><td>clone RA3-6B2, 1/400</td></tr><tr><td>anti-topo CD3 eFluor450 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0032</td><td>clone 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD3 PE (2)</td><td>BD biosciences</td><td>555275</td><td>clone 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD3 PE-Cy5 (3)</td><td>ebiosciences</td><td>15-0031</td><td>clone 145-2C11, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD4 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0041</td><td>clone GK1.5, 1/500</td></tr><tr><td>anti-topo CD4 PE (2)</td><td>ebiosciences</td><td>12-0041</td><td>clone GK1.5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-topo CD8 biotina (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0081</td><td>clone 53-6.7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD8 eFluor450 (2)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0081</td><td>clone 53-6.7, 1/500</td></tr><tr><td>anti-topo CD11a biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-0111</td><td>clone M17/4, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD11b PE&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>12-0112</td><td>clone M1/70, 1/200</td></tr><tr><td>anti-topo CD16/32 biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-0161</td><td>clone 93, 1/400</td></tr><tr><td>purificato anti-topo CD16/32 (blocco FcR)&nbsp;</td><td>BD biosciences</td><td>553141</td><td>clone 2.4G2</td></tr><tr><td>anti-topo CD18 biotina (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0181</td><td>clone M18/2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD18 FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-0181</td><td>clone M18/2, 1/50</td></tr><tr><td>anti-topo CD19 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0193</td><td>clone 1D3, 1/200</td></tr><tr><td>anti-topo CD21/35 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0211</td><td>clone 8D9, 1/50</td></tr><tr><td>anti-topo CD31 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0311</td><td>clone 390, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD34 eFluor660</td><td>ebiosciences</td><td>50-0341</td><td>clone RAM34, 1/20</td></tr><tr><td>anti-topo CD44 PE</td><td>BD biosciences</td><td>553134</td><td>clone IM7, 1/50</td></tr><tr><td>anti-topo CD45.2 FITC&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>11-0454</td><td>clone 104, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD49b/Pan NK PE</td><td> BD biosciences</td><td>553858</td><td>clone DX5, 1/50</td></tr><tr><td>anti-topo CD80 biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-0801</td><td>clone 16-10A1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-topo CD86 biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-0862</td><td>clone GL1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-topo CD107b (Mac-3) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5989</td><td>clone M3/84, 1/40</td></tr><tr><td>anti-topo CD115 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1152</td><td>clone AFS98, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD117 eFluor450</td><td>ebiosciences</td><td>48-1171</td><td>clone 2B8, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD127 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1271</td><td>clone A7R34, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo CD150 APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-1501</td><td>clone 9D1, 1/20</td></tr><tr><td>anti-topo CD274 (PD-L1) biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-5982</td><td>clone MIH5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-topo Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5981</td><td>clone D7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-topo Ly-6C APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-5932</td><td>clone HK1.4, 1/200</td></tr><tr><td>anti-topo Ly-6G&nbsp; (Gr-1) biotina (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-5931</td><td>clone RB6-8C5, 1/400</td></tr><tr><td>anti-topo Ly-6G FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-9668</td><td>clone 1A8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-topo MHC classe I (H-2Db) biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-5999</td><td>clone 28-14-8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-topo MHC classe II (I-A/I-E) PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-5321</td><td>clone M5/114.15.2, 1/1000</td></tr><tr><td>anti-topo NK1.1 PE</td><td>BD biosciences</td><td>557391</td><td>clone PK136, 1/50</td></tr><tr><td>anti-topo TCRVb FITC</td><td>BD biosciences</td><td>553170</td><td>clone H57-597, 1/50</td></tr><tr><td>streptavidina PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-4317</td><td>&nbsp; &nbsp; 1/200</td></tr><tr>Reagenti <td></td><td></td><td></td><td>per colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Anti-mieloperossidasi di topo (anticorpo a catena pesante)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-16129</td><td>1/10 (20 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>&nbsp; IgG anti-capra (anticorpo accoppiato Texas Red)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-076-147</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Hoechst</td><td>BD Biosciences</td><td>561908</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio 1 (Fluoromount)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Esterasi reagenti per coloranti citochimici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naftolo AS-D cloroacetato soluzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>soluzione colorante (Fast Red Violet LB Base solution)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>pH6.3 tampone concentrato (TRIZMAL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>913</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di nitrito di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di citrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ematossilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS3</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide, 37%</td> Soluzione di butirrato <td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-naftil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1801</td> Soluzione tampone fosfato Sigma-Aldrich 1805 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compressa di nitrito di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1809</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di pararosanilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1804</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di metilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1808</td><td>1/10</td></tr><tr><td>mezzo di montaggio 2 (Clearmount)</td><td>Invitrogen</td><td>00-8010</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald Giemsa reagenti per colorazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; Soluzione nwald</td><td>Diagnostica RAL</td><td>320070</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Giemsa R&nbsp;</td><td>Diagnostica RAL</td><td>320310</td><td>&nbsp; &nbsp; Soluzione tampone 1/20</td></tr><tr><td>pH 6,8</td><td>RAL Diagnostics</td><td>330368</td><td></td></tr><tr><td><forte>Altri materiali, reagenti e attrezzature</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 1000 (100 mg/ml)</td><td>VIRBAC</td><td>3597132111010</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina SEDAXYLAN (20 mg/ml)</td><td>CEVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovin albumina siero (BSA) polvere</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP671</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione PBS (1x concentrato)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>saponina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione EDTA ultra pura 0,5 M, pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di separazione (Topo Pancoll)</td><td>PANBIOTECH</td><td>P04-64100</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi (tampone di lisi dei globuli rossi) (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>1/10</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS267</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu (0,4 %)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250-061</td><td>1/2</td></tr><tr><td>tubo da 50 ml (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro cellulare (Falcon)&nbsp;</td><td>Corning Scienze della vita</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Camera & scheda filtrante (EZ Cytofunnel Shandon)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura per microscopio, 24 x 24 mm</td><td>Vetro</td><td>Knittel VD1 2424 Y100</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini (Starfrost - bordi rettificati 90)</td><td>Vetro Knittel</td><td>VS1137# 077FKB</td><td></td></tr><tr><td>Tubo EDTA</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454034</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetta 150 mm (tubo capillare)</td><td>Fisherbrand</td><td>1154-6963</td><td></td></tr><tr><td>Ferri da 26 g</td><td>Terumo</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; siringa e ago da insulina 29 G</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>ago da 30 G&nbsp;</td><td>Becton & Dickinson</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Provette per citometria a flusso (blu)</td><td>Beckman Coulter</td><td>2523749</td><td></td></tr><tr><td>Penna idrorepellente (Dakopen)</td><td>Dako</td><td>S200230</td><td></td></tr><tr><td>Forbici sterili affilate&nbsp;</td><td>Nessi-care</td><td>SCI-01</td><td></td></tr><tr><td>Pinze sterili</td><td>Dominique Dutscher</td><td>956506</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio delle cellule Thoma</td><td>VWR</td><td>631-0397</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri (Fisherbrand Plastic)</td><td>ThermoFisher Scientific S33580A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga (1,5 ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Cylindrical Resbrake 15 - 30 g</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3 Citocentrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-10L</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>Spugne di garza sterili</td><td>URGO</td><td>501580</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo dettagliato per caratterizzare la linea cellulare murina c1498 e il suo modello associato leucemia mouse

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

L&#39;iniezione endovenosa di C1498 cellule in topi singenici o congenic è stata eseguita dal 1941. Queste iniezioni provocare lo sviluppo di leucemia acuta. Tuttavia, la natura di questa malattia non è stato ben documentato in letteratura. Qui, forniamo un protocollo tecnico per caratterizzare cellule C1498 in vitro e per determinare la natura della leucemia indotta in vivo. La prima parte di questa procedura è focalizzata sulla determinazione del lineage ematopoietiche e la fase di differenziazione delle cellule C1498 coltivate. Per ottenere questo, multi-parametrica colorazione citometria di flusso è utilizzato per rilevare marcatori cellulari ematopoietiche. immunofluorescenza, citochimica e colorazione May-Grünwald Giemsa vengono eseguiti per valutare l&#39;espressione di mieloperossidasi, l&#39;attività di esterasi e morfologia cellulare, rispettivamente. La seconda parte di questo protocollo è dedicata a descrivere la malattia leucemia che è indotta invivo. Quest&#39;ultimo può essere ottenuto determinando le frequenze di cellule leucemiche e insiti nel sangue, organi ematopoietici (ad esempio, midollo osseo e milza) e tessuti non linfoidi (ad esempio il fegato e polmoni) utilizzando colorazione specifica e citometria a flusso analisi. La natura della leucemia viene poi confermata con May-Grünwald Giemsa colorazione e colorazione per esterasi specifiche nel midollo osseo. Qui, vi presentiamo i risultati che sono stati ottenuti utilizzando questo protocollo nei topi C1498- e PBS-iniettati di pari età.

A caratterizzare il modello C1498 del mouse, si è proceduto con due fasi principali. Innanzitutto, le cellule C1498 sono stati caratterizzati per determinare la loro ematopoietiche lineage e maturazione fase in vitro (Figura 1). Queste cellule sono state iniettate in topi congenic, e la natura della malattia leucemica indotta è stata valutata per determinare caratteristiche differenti: infiltrazione di cellule leucemiche, il loro fenotipo, la quantificazione delle cellule ematopoietiche (mature e progenitori / precursori) nel midollo osseo, le frequenze di C1498 cellule e cellule ematopoietiche mature nel sangue e una valutazione di gonfiore organo (nella milza, fegato e polmoni) e composizione cellulare. Per caratterizzare i fenotipi di cellule C1498 in vitro, le cellule sono state marcate con anticorpi diretti contro molecole che sono espresse da precursori emopoietici e cellule mature (Tabella 1), ei risultati sono stati analizzati utilizzando cytomet flussory. Le cellule C1498 sono stati positivi per l&#39;espressione superficie cellulare di Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (&gt; 25%), e sono visualizzati espressione intracellulare di CD3ε, T-cellule recettore catene (TCR) Vβ e Mac -3 (figure 2A e B). Le celle sono risultati negativi per i marcatori di superficie cellulare Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1, e pan-NK molecole e per l&#39;espressione intracellulare di CD4 e CD8 (dati non riportati) . Sono stati poi esaminati per i marcatori di cellule staminali ematopoietiche e progenitori (Tabella 1). Essi sono stati anche negativi per l&#39;espressione della superficie delle cellule del CD117, CD34, Sca-1, CD150 e CD16 / 32 (dati non riportati). Queste cellule leucemiche sono stati poi sottoposti a test per determinare l&#39;espressione di adesione, presentazione dell&#39;antigene e molecole co-stimolatore. Le cellule espressi i marcatori di superficie LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), e H-2D B e sono risultati negativi per MHC di classe II, CD80, CD86 e CD274 (dati non riportati). C1498 cellule Therefore espresso sia mieloide (Mac-1, Mac-3) e marcatori linfoidi (B220, CD3, TCR). Per caratterizzare meglio il loro lignaggio ematopoietico, espressione mieloperossidasi è stata valutata utilizzando la microscopia di immunofluorescenza. Tutte le cellule erano positive per la mieloperossidasi, che ha verificato la loro origine mieloide (Figura 3A). La maggior parte delle cellule anche macchiato positivo per esterasi α-naftil butirrato (Figura 3B, pannello di sinistra), e alcuni di loro macchiato per le naftolo AS-D cloroacetato esterasi (frecce nere) (Figura 3B, pannello di destra). I risultati indicano che le cellule contengono miscele di cellule monociti e granulocitari. Dopo il maggio-Grünwald Giemsa colorazione è stata eseguita, le cellule C1498 sono state osservate per visualizzare una morfologia blast-come con un elevato rapporto nucleo-citoplasmatica, da 3 a 5 nucleoli nel nucleo, un alone perinucleare, numerosi vacuoli e un citoplasma basofile (Figura 3C ). thnoi, la linea cellulare C1498 è composta da monoblasti e mieloblasti. Le cellule C1498 (CD45.2 +) sono stati poi iniettata per via endovenosa in CD45.1 + topi. I topi ha ceduto 17 a 19 giorni dopo le cellule sono state iniettate. Questi topi sono stati sacrificati in modo che il loro tipo di leucemia potrebbe essere analizzato prima di morire a causa della malattia. I topi di controllo, che sono stati iniettati con PBS, sono stati analizzati negli stessi punti di tempo per il confronto. I topi C1498 cellule iniettate visualizzata massiva infiltrazione di cellule C1498 nel loro midollo osseo, come dimostrato dalla comparsa blast-simili delle cellule dopo May-Grünwald Giemsa è stato eseguito (Figura 4A). Essi hanno inoltre conservato la loro monociti e fenotipi granulocitari (Figura 4B e C), dimostrando un accumulo di cellule monoblastiche e mieloblastiche che è caratteristica della leucemia mielomonocitica acuta. Da fareetermine se midollari numeri cellule ematopoietiche sono state inferiori a seguito dell&#39;invasione cellule leucemiche, CD45.2 + C1498 cellule, B linfocitica, monociti e le popolazioni granulocitari (compresi i progenitori, i precursori e cellule mature), sono stati quantificati con immunofluorescenza colorazione e il flusso multi-parametrica citometria. cellule leucemiche rappresentati da 16 a 36% delle cellule ematopoietiche (dati non mostrati). Gli altri tipi di cellule sono stati tutti presenti in numero significativamente più bassi nei topi C1498-iniettati che nei topi PBS-iniettati (per 5 volte, in media, per i sottoinsiemi di cellule B, media per le cellule granulocitari e 3 volte in media 4 volte su per sottoinsiemi monociti) (Figura 5A a C). Un&#39;indagine delle frequenze di cellule mononucleari in campioni di sangue leucemiche e mouse di controllo ha mostrato di contenere una percentuale comparabile di linfociti (Figura 6A), ma una maggiore frequenza di monociticae cellule leucemiche. Queste caratteristiche sono rappresentative della leucemia mielomonocitica acuta 11 (figura 6B). Tra le altre caratteristiche di leucemia mielomonocitica acuta 12, i topi C1498-iniettati presentati con fegati gonfi (epatomegalia), polmoni e milza (splenomegalia) (Figura 7a). Varie frequenze di cellule CD45.2 + C1498 sono stati rilevati in questi organi usando immunofluorescenza colorazione e citometria a flusso (Figura 7B). Come splenomegalia può derivare da un numero elevato di monociti infiltrati, abbiamo anche stimato le proporzioni delle popolazioni della milza. Il numero di cellule nel B linfocitica, monocitica e frazioni cellulari granulocitari erano significativamente più grande, con una media di 2 volte, 2,5 volte e 3 volte, rispettivamente, nella milza leucemiche che in milza controllo (Figura 7c). thin-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo Set Up per Caratterizzare in vitro coltivate C1498 linee cellulari e in descrizioni vivo di leucemia acuta. Il lignaggio ematopoietiche e la fase di differenziazione delle cellule C1498 tessuti in coltura sono stati prima determinata. cellule C1498 sono state iniettate in topi congenic per indurre lo sviluppo di leucemia acuta. L&#39;isolamento di midollo osseo, sangue periferico, milza, fegato e tessuti del polmone è stato effettuato per determinare le frequenze, fenotipi e cambiamenti morfologici dopo che le cellule infiltrazione C1498. IV: MGG endovenosa:. May-Grünwald Giemsa <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <html> annuncio / 54270 / 54270fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Analisi fenotipica delle cellule C1498 dopo coltura in vitro. Flusso rappresentante citometria dot plots e istogrammi di superficie delle cellule (A) e intracellulare (B) C1498-espresso molecole che sono stati associati con ematopoietiche differenziazione delle cellule mature sono mostrati. cellule C1498 sono state raccolte da culture, lavate ed etichettati utilizzando anticorpi fluorescenti che erano specifiche per la superficie delle cellule CD11b, CD18 e marcatori B220 o loro controlli isotipo. Per la colorazione intracellulare, le cellule sono state fissate, permeabilizzate ed etichettati utilizzando anticorpi diretti contro Mac-3, CD3ε, e un epitopo comune del TCR (T-Cell Receptor) catena Vβ o loro controlli isotipo. Le analisi sono state eseguite utilizzando gating con cellule vive. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <html> S copi &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" /> Figura 3. Caratterizzazione funzionale e morfologica delle cellule in coltura C1498. Cellule C1498 sono state raccolte da culture e centrifugate su vetrini per la microscopia. (A) di colorazione per l&#39;espressione mieloperossidasi è stata effettuata utilizzando immunofluorescenza. (B) reazioni citochimici sono stati usati per analizzare l&#39;esterasi α-naftil butirrato (NBE) e naftolo AS-D cloroacetato esterasi (CAE) attività in cellule C1498. Le cellule sono state considerati positivi per ciascuna etichetta quando marrone e rosso-viola, grandi granuli citoplasmatici, rispettivamente, sono stati osservati. (C) May-Grünwald Giemsa (MGG) colorazione C1498 cellule. Per ogni esperimento colorazione, l&#39;ingrandimento dell&#39;obiettivo microscopio è indicato. Ogni immagine rappresentativa tre esperimenti separati.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" /> Figura 4. I topi di midollo osseo Morfologie in PBS- e C1498-iniettato. Cellule del midollo osseo sono stati isolati da PBS- e topi cellule iniettate C1498 e centrifugati su vetrini per la microscopia. (A) May-Grünwald Giemsa (MGG) colorazione. (B ) esterasi α-naftil butirrato (NBE) e naftolo (C) AS-D funzioni cloroacetato esterasi (CAE) sono stati valutati utilizzando citochimica. Nel pannello A, la band (immaturi) o segmentati neutrofili (maturi) sono meno visibili nel midollo osseo dei topi C1498-iniettati rispetto ai topi PBS-iniettati. Pannello B e C indicano che c&#39;era un accumulo di cellule monocitiche e granulocitari nel midollo osseo leucemico rispetto ai numeri osservati nel controllo midollo osseo. Tuttianalisi al microscopio sono state eseguite utilizzando un obiettivo di ingrandimento 100X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" /> Figura 5. I topi analisi quantitativa delle popolazioni midollari in PBS- e C1498-iniettato. Cellule del midollo osseo sono stati isolati da PBS- e topi cellule iniettate C1498 e stimati dopo il conteggio delle cellule è stata eseguita. Le frequenze delle varie popolazioni cellulari sono stati determinati dopo immunostaining e il flusso delle cellule gated vivo analisi di citometria a. (A) I sottoinsiemi di cellule B inclusa + cellule CD19 + B220 a fasi, dalla cellule pro-B a maturare linfociti B (B), le cellule granulocitari nel CD3 - e CD11b + Ly6G + lignaggi, che comprendeva un precursori. ND granulociti immaturi e maturi (C) I sottoinsiemi monociti sono stati definiti come CD3 - CD115 + e inclusi cellule nel progenitrici di maturare fasi monociti. n = 7 topi / gruppo, ei dati sono presentati come istogrammi mostrano le medie ± SEM. ***, P &lt;0,0001 e **, p &lt;0,01, test di t-di Student spaiato confrontando PBS- e topi C1498-iniettati. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" /> Figura 6. Analisi del sangue di mononucleari sottopopolazioni cellulari in PBS- e topi C1498-iniettato. Flusso rappresentante citometria punti appezzamenti di (A) T e B percentuali linfociti, che sono stati, rispettivamente, definiti come le cellule CD3 + + e B220 in PBS- e C1498 cellule iniettate. topi (B) frequenze di cella monocitica in C1498 leucemica e controllo (PBS) i topi sono stati determinati analizzando CD115 + Ly6C - e CD115 + Ly6C alte cellule. L&#39;analisi è stata eseguita da gating cellule vive. Per confrontare i topi leucemici e controllo, CD45.2 + sono stati esclusi C1498 cellule. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" /> Figura 7. Stima della splenici popolazioni leucemiche e topi di controllo. (A) fotografie rappresentativi di fegato, polmone e della milza gonfiore nei topi leucemica rispetto ai topi di controllo. Milze sono stati raccolti e pesati, e splenociti sono stati contati dopo interruzione del tessuto. (B) Istogramma che rappresenta le frequenze di cellule leucemiche in difforgani erenti dopo immunocolorazione è stata effettuata per le cellule CD45.2 + ei risultati sono stati analizzati mediante citometria a flusso. (C) stima della milza B, il numero di cellule granulocitari e monociti dopo immunostaining e citometria a flusso di analisi gating sono stati eseguiti per identificare vivo CD19 + B220 + , CD3 - CD11b + Ly6G +, CD3 - CD11b + Ly6C - e CD3 - alte cellule CD11b + Ly6C. Le barre di scala indicati per i polmoni, milza e fegato indicano 1 cm. .. n = 5 - 8 topi / gruppo, ed i dati sono rappresentati in istogrammi come mezzo ± SEM *, p &lt;0,05; **, p = 0,0033 topi, t-test di Student spaiato confrontando PBS- e C1498-iniettato <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody&gt; <tr><td> Tipo di cella </td><td> Membrana o intracellulari Molecole </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Precursori e cellule mature </td><td></td></tr><tr><td> Le cellule NK </td><td> NK1.1 +, pan-NK + </td></tr><tr><td> cellule NKT </td><td> NK1.1 +, pan-NK +, TCR vBeta + (8.2), CD3 + </td></tr><tr><td> linfociti T </td><td> TCR vBeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + </td></tr><tr><td> cellule B precursori e linfociti B </td><td> B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + </td></tr><tr><td> precursori granulocitari e granulociti </td><td> Ly6G +, Mac-1 +, CD11b + </td></tr><tr><td> precursori monociti e monociti / macrofagi </td><td> CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> progenitori </td><td></td></tr><tr><td> progenitori multipotenti </td><td> CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin- CD150-) </td></tr><tr><td> progenitori multipotenti linfoidi-innescato </td><td> CD117hi Sca-1hi CD127 + (Lin-) </td></tr><tr><td> progenitori linfoidi comuni </td><td> CD117lo Sca-1LO CD127 + (Lin-) </td></tr><tr><td> progenitori mieloidi comuni </td><td> CD16 / CD117 + 32lo CD34int (Lin- Sca-1-) </td></tr><tr><td> progenitori granulociti-macrofagi </td><td> CD16 / CD117 + 32hi CD34hi (Lin- Sca-1-) </td></tr><tr><td> progenitori megacariociti-eritroide </td><td> CD16 / CD117 + 32lo CD34lo (Lin- Sca-1-) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Le cellule staminali ematopoietiche </td><td> CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin- CD34-) </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Marcatori di linee cellulari ematopoietiche e la differenziazione. CD: cluster di differenziazione; Lin: marcatori di cellule mature; Lo:bassa espressione; Max: elevata espressione; int: espressione intermedio; NK: cellule killer naturali; TCR: recettore delle cellule T.

Questo manoscritto fornisce una procedura tecnica che può essere utilizzato per caratterizzare colture cellulari C1498 in vitro e la leucemia acuta indotta nei topi dopo l&#39;iniezione. Fenotipiche e funzionali analisi vengono eseguite utilizzando citometria a flusso, microscopia a immunofluorescenza, citochimica e maggio-Grünwald Giemsa.

Un protocollo dettagliato per caratterizzare la linea cellulare murina C1498 e il suo modello associato leucemia mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare le cellule murine C1498 e la leucemia acuta che inducono dopo iniezione endovenosa nei topi. Il principale vantaggio di questa procedura è che la leucemia mielomonocitica murina indotta dopo iniezione di cellule C1498 presenta numerose caratteristiche della malattia umana. Questo modello animale può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell’ematologia, come ad esempio quali sono i meccanismi che portano allo sviluppo della leucemia e della carenza immunitaria.Le implicazioni di questo modello animale si estendono al trattamento della leucemia, poiché facilita il test di nuovi agenti chemioterapici e immunoterapici. Iniziare trasferendo un topo femmina congeneico C57 black 6 di età compresa tra cinque e sei settimane in un'area sterile con flusso laminare. Successivamente, posizionare l'animale in un contenitore restrittivo.Successivamente, caricare una siringa da un millilitro dotata di un ago da 29 gauge con 100 microlitri di cellule. Afferrare la coda all'estremità distale e disinfettare la cute della coda con una garza imbevuta di etanolo al 70%. Procedere quindi iniettando lentamente un milione di cellule in una vena laterale della coda.Dopo aver somministrato tutte le cellule, rimuovere l'ago ed esercitare una leggera pressione sul sito di iniezione con garza sterile. Quindi restituire l'animale alla gabbia, monitorandolo attentamente per le successive settimane. 17-19 giorni dopo, inserire un tubo capillare nel canto mediale dell'occhio dell'animale leucemico anestetizzato.Da 100 a 200 microlitri di sangue verranno prelevati dal seno orbitario nel tubo capillare. Rimuovere il tubo e controllare l'emorragia applicando delicatamente una garza sterile sull'occhio. Successivamente, trasferire il sangue in un tubo con EDTA e conservare il tubo sul ghiaccio fino all'isolamento delle cellule mononucleate.Per isolare le cellule mononucleate del sangue, aggiungere prima PBS integrato con un millimolare di EDTA fino a un volume finale di 500 microlitri. Successivamente, trasferire il campione in una provetta per microcentrifuga. Poi, utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago da 30 gauge per stratificare con attenzione 500 microlitri di soluzione separante sotto il sangue, avendo cura di non mescolare gli strati.Separare le cellule mediante centrifugazione e utilizzare una pipetta per trasferire lo strato bianco opaco di cellule mononucleate in un nuovo tubo da microcentrifuga. Quindi, lavare le cellule immunitarie con un millilitro di PBS. Centrifugare e risospendere il pellet in 600 microlitri di buffer FACS per la colorazione e l'analisi mediante citometria a flusso.Per isolare il midollo osseo, posizionare il topo supino su una tavola di plastica e fissare gli arti dell'animale. Disinfettare l'animale con etanolo al 70%. Quindi, tagliare ogni gamba all'estremità superiore del femore, al di sopra dell'articolazione, e tirare delicatamente sui peroni per staccarli dai femori.Utilizzare pinzette e forbici per rimuovere la pelle e i muscoli dalle ossa, quindi trasferire le ossa in una piastra di Petri su ghiaccio. Usare le forbici per rimuovere le estremit&agrave;. Inserire quindi un ago da 26 gauge collegato a una siringa da 10 millilitri contenente cinque millilitri di PBS freddo all'estremit&agrave; di un'osso alla volta ed estrarre il midollo osseo nella piastra.Fare passare la sospensione cellulare attraverso la punta dell'ago diverse volte per rompere le cellule del midollo osseo. Successivamente, filtrare le cellule attraverso un nuovo filtro da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri per ottenere una sospensione di cellule singole. Centrifugare le cellule e risospendere il pellet in due millilitri di buffer per la lisi.Riempire immediatamente il tubo con fino a 50 millilitri di PBS freddo e centrifugare le cellule. Successivamente, risospendere il pellet di midollo osseo a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per millilitro in buffer FACS freddo. Per preparare le cellule del midollo osseo per la colorazione, posizionare innanzitutto i vetrini in camere monouso dotate di filtri pre-attaccati e inserire le camere in un citocentrifugo.Aggiungere 100 microlitri di buffer FACS in ogni camera della scheda filtrante e centrifugare brevemente i vetrini. Alla fine della centrifugazione, aggiungere 100 microlitri di cellule in ogni camera e centrifugare le cellule. Successivamente, rimuovere con attenzione i vetrini dalle camere per farli asciugare all'aria.Per colorare le cellule del midollo osseo, immergere i vetrini in un barattolo Coplin contenente soluzione di May-Grunwald per cinque minuti. Successivamente, trasferire i vetrini in un barattolo contenente soluzione tampone con un pH di 6,8 per un minuto. Quindi, trasferire i vetrini in soluzione di Giemsa R per 10 minuti.Successivamente, eseguire un lavaggio di 10 secondi con acqua a pH neutro. Dopo il lavaggio, lasciare asciugare le lamelle all'aria e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio su ogni campione. Quindi, appoggiare un bordo di un coprioggetto sulla lamella e abbassare con cura il coprioggetto sulle cellule, premendo leggermente per rimuovere eventuali bolle d'aria.Rispetto agli animali di controllo, negli animali inoculati con cellule C1498 si osserva un massiccio infiltrato di cellule C1498 nel midollo osseo, evidenziato dall'aspetto blastomorfo delle cellule. Le cellule C1498 infiltranti il midollo osseo mostrano fenotipi monocitici e granulocitici, indicativi rispettivamente di cellule monoblastiche e mieloblastiche, caratteristici della leucemia mielomonocitica acuta. L'analisi citofluorimetrica delle frequenze di cellule mononucleate nei campioni ematici dei topi inoculati con C1498 indica che circa un quarto dell'intera popolazione di globuli bianchi è costituito da cellule leucemiche.Le frequenze di linfociti T e B sono simili tra animali di controllo e animali inoculati con C1498. Le frequenze di monociti, tuttavia, sono osservate a livelli più elevati nei topi inoculati con C1498, una caratteristica della leucemia mielomonocitica acuta. Quando si eseguono le procedure di citochimica e di May-Grunwald Giemsa, è importante ricordare di mantenere i valori di pH, le temperature e i tempi di incubazione appropriati.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come caratterizzare la leucemia mielomonocitica acuta. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'Ematologia per esplorare la natura delle leucemie acute spontanee e indotte in altri modelli animali.

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Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono prognostico in diversi tumori metastatici. Questo manoscritto descrive il sistema Gold Standard CellSearch (CSS) CTC piattaforma di censimento e mette in evidenza errori di classificazione comuni. Inoltre, due protocolli adattati sono descritti per l'utente definito caratterizzazione marcatore delle CTC e CTC censimento in modelli murini preclinici di metastasi che utilizzano questa tecnologia.

Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

Il trasferimento di linfociti bm12 in un ricevente C57BL/6 è un modello consolidato di lupus eritematoso sistemico. Qui descriviamo come iniziare la malattia utilizzando questo modello e come caratterizzare le cellule T follicolari helper, le cellule B del centro germinale e le plasmacellule mediante citometria a flusso.

Il BM12 inducibile modello di Lupus Eritematoso Sistemico (LES) in C57BL / 6 Mice

Questo manoscritto fornisce una descrizione della metodologia utilizzata per stabilire modelli murini di trasduzione-trapianto. Viene fornito un resoconto dettagliato degli errori tecnici da evitare durante l'esecuzione dei trapianti di midollo osseo. Dovrebbe essere acquisita una chiara comprensione dell'importanza dell'alto titolo virale, della trasfezione/trasduzione e dell'irradiazione.

Trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa

Qui, descriviamo i protocolli per la validazione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 come un obiettivo della droga nella leucemia utilizzando modelli in vitro e in vivo genetica e umanizzato del topo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene

Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

Questo protocollo descrive l'isolamento dei timociti doppi negativi dal timo di topo seguito da trasduzione retrovirale e co-coltura sul sistema di co-coltura della linea cellulare stromale del midollo osseo a 4 esprimenti delta (OP9-DL4) per ulteriori analisi funzionali.

Co-coltura e trasduzione di timociti murini su cellule stromali esprimenti delta-like 4 per studiare oncogeni nella leucemia a cellule T

Qui, l'iniezione intra-peritoneale delle cellule leucemiche viene utilizzata per stabilire e propagare la leucemia mieloide acuta (LMA) nei topi. Questo nuovo metodo è efficace nel trapianto seriale di cellule LMA e può servire come alternativa per coloro che possono sperimentare difficoltà e incongruenze con l'iniezione endovenosa nei topi.

Trapianto intra-peritoneale per la generazione di leucemia mieloide acuta nei topi

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Il protocollo ha l'obiettivo di descrivere un modello murino per la generazione di recidive di leucemia linfoblastica acuta, basato sulla dinamica della risposta alla chemioterapia di induzione.

Modello murino di recidiva della leucemia alla chemioterapia di induzione per la leucemia linfoblastica acuta

Impara a caratterizzare le cellule C1498 murine e la leucemia mielomonocitica acuta indotta nel modello mouse. Questo protocollo utilizza citometria a flusso e colorazione May-Grünwald Giemsa per analizzare l'infiltrazione midollare e testare nuovi trattamenti.

Un protocollo dettagliato per caratterizzare la linea cellulare murina C1498 e il suo modello associato leucemia mouse

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