Name: Approcci genetici e biochimici per In Vivo e In Vitro La valutazione di proteine Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Scopri approcci genetici e biochimici per valutare l'oligomerizzazione del recettore della rianodina in vivo e in vitro. Questi metodi aiutano a studiare le interazioni proteiche e le aritmie cardiache.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

La formazione di proteine ​​omo-oligomeri è un processo biologico fondamentale che regola l&#39;attività dei fattori di trascrizione, enzimi, canali ionici e recettori 25,26. È importante sottolineare che la proteina oligomerizzazione ha anche implicazioni patologiche tra cui la neurodegenerazione e malattia cardiaca aritmogena 4,27. Le metodologie descritte in questo articolo sono utilizzate per identificare le interazioni dominio-dominio che mediano la proteina self-associazione e di oligomerizzazione. Qui di seguito, si segnala alle fasi critiche all&#39;interno di ogni protocollo, e discutiamo considerazioni importanti, i limiti e la risoluzione dei problemi. Il sistema Y2H può essere impiegato prima per lo screening di potenziali partner di proteine ​​interagiscono a causa della sua proiezione relativamente elevato throughput, la facilità d&#39;uso e risultati altamente riproducibili. procedure Y2H sono effettuate in un laboratorio di microbiologia con incubatori standard (piatto o shaker) e le strutture camera di contenimento. L&#39;uso di frcellule competenti eshly preparate (punto 1.1.8) è fondamentale per alta lievito trasformazione efficienza, mentre per ottenere i migliori risultati in test β-Gal, appena cresciuta colonie di lievito (fino a 5 giorni di vita) dovrebbe essere utilizzato (fase 1.2.3). I sistemi basati su fattori di trascrizione diversi GAL4 e / o geni reporter supplementari / alternativi sono disponibili, e quindi esca e plasmidi prede devono essere abbinati con il ceppo Y2H appropriata. Alcuni ceppi devono essere coltivate in presenza di 3-ammino-1,2,4-triazolo, un inibitore competitivo della proteina HIS3, per saziare qualsiasi espressione costitutiva del gene HIS3 giornalista 7,8. L&#39;espressione di esche e di destinazione proteine ​​di fusione vanno verificate mediante immunoblotting 17. Nel caso in cui esca / proteine ​​di fusione prede sono tossici per il lievito, i livelli di proteine ​​inferiore tollerabili potrebbe essere raggiunto clonando in diversi vettori in cui esca / espressione preda è guidata da un promotore diverso. Inoltre, è essenziale assicurare tcappello proteine ​​di fusione esca / preda non vengono visualizzati autonoma l&#39;attività del gene reporter. attivazione del gene reporter autonoma può essere salvato modificando il costrutto per rimuovere la regione responsabile, o scambiando la GAL4 DNA-BD e fusioni AD per le due proteine ​​testate. Inoltre, i domini transmembrana sono meglio omessi da costrutti esca / preda perché possono indurre misfolding o mislocalization di proteine ​​di fusione in compartimenti di membrana intracellulari. Infatti, lo svantaggio principale del sistema Y2H è che le proteine ​​esca e di destinazione sono localizzati nel nucleo lievito lontano dalla loro posizione fisiologica subcellulare e potenzialmente privo specifiche modificazioni post-traduzionali, con conseguente falsi-positivi o falsi negativi interazioni 6-9 . Mammiferi sistemi di espressione eterologhi sono più adatti per lo studio delle proteine ​​di membrana integrali mammifero in termini di conformazione, modificazioni post-traslazionali e localizzazione subcellulare.Uno dei più utilizzati metodi di transfezione delle cellule è la precipitazione di fosfato di calcio, principalmente a causa delle attrezzature minimo e reagenti richiesti 11,15. Metodi alternativi, ovvero elettroporazione, liposomi, lipidi cationici e polimeri, possono garantire una maggiore efficienza di trasfezione seconda della linea cellulare e costruire usate. In generale, i principali fattori che influenzano l&#39;efficienza di trasfezione sono plasmide qualità del DNA e cellule salute / redditività. I migliori risultati si ottengono quando si utilizzano plasmide DNA della massima purezza (260 nm / 280 nm rapporto assorbanza di ~ 1,8) e cellule in divisione attivamente. Le cellule devono pertanto essere trasfettate a non più di 60 - 70% di confluenza (fase 2.1.2), perché la capacità di prendere DNA estraneo è legata alla superficie della cella esposta al mezzo 11. Inoltre, l&#39;inclusione di antibiotici nel terreno di coltura durante la transfezione (fase 2.1.3) non è consigliato a causa di aumento della morte cellulare 15. Fo precipitazione di fosfato di calcio in particolare, un&#39;attenta preparazione e regolazione del pH (da 7,05 appunto) della soluzione 2x HBS (fase 2.1.1), e la corretta formazione di plasmide DNA / calcio / complessi di fosfato di miscelazione vigorosa (fase 2.1.5) sono passaggi critici per l&#39;alta efficienza di trasfezione. In genere, l&#39;espressione della proteina da picchi di trasfezione transiente entro 24-72 ore. Una volta che le cellule vengono raccolte, procedure successive devono essere effettuate a 4 ° C per ridurre al minimo l&#39;attività della proteasi, e si raccomanda l&#39;aggiunta di inibitori della proteasi. Cellulare omogeneizzazione dovrebbe essere seguita da una fase di centrifugazione per rimuovere i nuclei a causa cromosomica del DNA può aumentare soluzione viscosità e migliorare legame non specifico. Così, omogeneizzazione con mezzi meccanici in un buffer iso-osmotica è preferito, di solito in (0,3 M) saccarosio o (150 mM) NaCl. In generale, i buffer di saccarosio-based sono noti per migliorare la stabilità proteica e ridurre il potenziale di aggregazione di proteine ​​non nativa, ma a causa di pidratazione referenziale sulla superficie di proteine, elettrostatici interazioni proteina-proteina sono favoriti. Al contrario, i buffer a base di sali influenzano la carica netta di gruppi laterali di aminoacidi caricati sulla superficie di proteine, avendo così una polarizzazione verso altre interazioni idrofobiche a base 28. Co-IP è il test biochimico più comunemente impiegato per valutare le interazioni proteina-proteina in particolare dal tessuto nativo. Il suo svantaggio principale è la necessità di anticorpi altamente specifici convalidati per l&#39;utilizzo in IP e immunoblotting 10,16,18. Pertanto, le proteine ​​ricombinanti sono spesso contrassegnati con un epitopo peptide, ad es., L&#39;influenza emoagglutinina (YPYDVPDYA) o cMyc umana (EQKLISEEDL), per cui gli anticorpi specifici ad alta affinità sono disponibili in commercio. Se desiderato, l&#39;anticorpo immunoprecipitating può essere coniugato chimicamente sulla Protein-A resina per evitarne l&#39;eluizione e rilevamento durante la fase di immunoblotting che possono oscurare la co-precipitato protein 16; per ottenere questo, abbiamo utilizzato con successo la chimica cross-linker 3,3&#39;-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24. È indispensabile che appropriati detergenti è inclusa nel buffer IP e il materiale insolubile di cellule omogeneizzate viene rimosso mediante centrifugazione per minimizzare legame non specifico (fase 3.1.3). La scelta e la concentrazione del detersivo sono importanti considerazioni: detergenti più forti e / o concentrazioni più elevate ridurrà sostanzialmente non specifica vincolante, ma può anche abolire X: l&#39;interazione proteina Y, mentre le concentrazioni più basse o detergenti più lievi può consentire una interazione debole per essere osservata, ma può portare ad una eccessiva legame non specifico. Detergenti resistenza intermedi sono preferiti, ad esempio, Triton X-100 allo 0,5 -. Concentrazione 1%. Per ridurre ulteriormente il legame non specifico, una proteina neutra (ad esempio, albumina di siero bovino a 100 ug / ml) può essere incluso nel buffer IP e / o il lisato cellulare può essere pre-cleared previa incubazione con resina Protein-alone. Il numero di lavaggi deve essere ottimizzato per il X: coppia di Y testato, in genere tre 10-numero minimo di lavaggi con tampone IP (fase 3.1.9). In ogni caso, un campione co-IP con non-immuni IgG dell&#39;anticorpo immunoprecipitating dovrebbero sempre essere trattate in parallelo per servire come controllo negativo (passo 3.1.6). Il vantaggio principale della reticolazione chimica è che informa sulla composizione stechiometrica della proteina omo-oligomeri. La glutaraldeide è un cross-linker comunemente usato perché non richiede attrezzature specializzate e genera termicamente e chimicamente stabili legami incrociati tra interagenti proteine ​​19,20. Composti con gruppi amminici liberi devono essere omessi dai buffer di analisi (passo 3.2.1) perché sarà placare la reazione chimica. la concentrazione di glutaraldeide e il tempo di reazione (fase 3.2.4) devono essere ottimizzati per il complesso proteico oligomerica di interesse. Il principale svantaggio di questa tecnica, especialleato quando eseguita su preparazioni cellulari intere, è la non-specificità della reazione chimica che potrebbe produrre aggregati di proteine ​​artificiali che non hanno significato biologico. Alternative in vivo (ad es., Di fluorescenza di risonanza di trasferimento di energia, di fluorescenza bi-molecolare o luminescenza complementazione) e tecniche in vitro (ad es., Le dimensioni cromatografia di esclusione, ultracentrifugazione analitica, Calorimetria isotermica di titolazione) sono disponibili per la caratterizzazione di proteine ​​auto-associazione e di valutazione di oligomerizzazione stechiometria 29,30. Ogni metodo ha i suoi vantaggi e svantaggi, e può essere più adatto per lo studio di una proteina specifica a seconda proteina di purificazione / stabilità e la disponibilità di attrezzature / reagente. I tre metodi complementari descritti qui in dettaglio, cioè Y2H, co-IP e cross-linking, sono stati usati in combinazione per fornire la prova convincente per RyR2 omo-oligomeformazione r in isolamento e all&#39;interno di una cellula vivente.

Scheletrico e cardiaco contrazione muscolare è innescato da sarcoplasmatico reticolo rilascio di Ca 2+ mediata da RyR. Ci sono tre isoforme RyR mammiferi con il canale funzionale composto da quattro subunità identiche. Ogni subunità RyR compone di una grande porzione N-terminale di regolamentazione citoplasmatica e una piccola parte C-terminale contenente i domini transmembrana che formano una alta conduttanza Ca 2+ pori. Intra e inter-anormale subunità interazioni alla base RyR disfunzione del canale e si traducono in neuromuscolari e disturbi cardiaci 1. L&#39;identificazione e la caratterizzazione di domini specifici coinvolti in RyR struttura: relazione funzione è quindi di fondamentale importanza per la comprensione della fisiopatologia RyR. tecniche di interazione proteina-proteina biochimici tradizionali richiedono notevoli quantità di proteina purificata, spesso prodotte in batteri. Questo non è possibile nel caso della RyR, una grande membrana protein composto da ~ 5000 aminoacidi, mentre i suoi frammenti ricombinanti non sono facilmente suscettibili di espressione batterica e purificazione. Così, sistemi di espressione alternativi che coinvolgono cellule ospiti eucariotiche sono necessari per proteine ​​integrali di membrana di mammiferi. Abbiamo già impiegato Y2H, co-IP e saggi di cross-linking per dimostrare collettivamente che N-terminale tetramerizzazione è una caratteristica strutturale che è conservato in tutto il tre mammiferi RyR isoforme 2,3. È importante sottolineare che, abbiamo scoperto che una singola mutazione puntiforme associata a malattia cardiaca aritmogena sconvolge N-terminale self-associazione e si traduce in un disfunzionale canali RyR 4. Abbiamo anche applicato queste tecniche per studi oligomerizzazione del RyR citoplasmatica C-terminale della coda 5 così come la N-terminale del canale di rilascio omologa intracellulare di Ca 2+, l&#39;inositolo 1,4,5 trifosfato recettore 2. Nel saggio Y2H, dello son tra due proteine ​​(X e Y) è misurata dalla ricostituzione di un fattore di trascrizione funzionale (GAL4) e l&#39;attivazione di geni reporter conseguente 6-9. Due diversi vettori di clonazione sono usati per generare fusioni delle due proteine ​​testate con i due fisicamente separabili, domini indipendenti di GAL4: DNA-Binding Domain (DNA-BD) / proteine ​​X di fusione (esca) e attivazione del dominio (AD) / proteine ​​Y Fusion (target). La Y2H può essere utilizzato per verificare se una proteina interagisce con se stessa generando GAL4 DNA-BD e fusioni AD della stessa proteina. Geneticamente modificati ceppi Y2H sono GAL4 e GAL80 carente (la proteina GAL80 è un repressore di GAL4), così come TRP1 e LEU2 carente (per fornire selezione nutrizionale per esche e preda plasmidi, rispettivamente). Nel nucleo di lievito, i ricombinanti peptidi DNA-BD e AD sono portati in prossimità fisica per la produzione di un fattore di trascrizione ibrido GAL4 solo attraverso X le fusioni &#39;: Y interaction. Questo approccio consente un rapido screening genetico per individuare le interazioni proteina-proteina attraverso l&#39;attivazione trascrizionale parallela di prototrofici (codifica HIS3 per un enzima necessario per la biosintesi istidina) e cromogeno (codifica LacZ per β-galattosidasi (β-Gal)) geni reporter. Il vantaggio principale del Y2H è che è un test in vivo che rileva le interazioni proteina-proteina anche deboli o transitori. Inoltre, il rilevamento comporta il semplice utilizzo di selezione della crescita (in mezzi privi di istidina) o di un colorimetrica dosaggio (β-Gal) senza la necessità di purificazione delle proteine ​​esca e bersaglio o la generazione di anticorpi specifici. Inoltre, il Y2H può essere usata per selezionare un insieme di casuali cloni sconosciute (cDNA library cloni fusi a GAL4 AD) per nuovi partner di legame di una proteina esca, dando accesso diretto al cDNA della proteina libreria. Per estendere le osservazioni Y2H, indient tecniche biochimiche possono essere impiegate. Saggi di cross-linking in combinazione con immunoblotting Co-IP e sono metodi utilizzati per individuare le associazioni di proteine ​​in miscele di campioni complessi, ad es., Interi lisati cellulari 10. Il loro vantaggio principale è che riferiscono sulle interazioni proteina-proteina dal tessuto nativo, a differenza di altri metodi che richiedono l&#39;uso di proteine ​​ricombinanti. Proteine ​​ricombinanti possono anche essere utilizzati, tipicamente espresso in una linea cellulare di mammifero, dove possono avere le loro corretta conformazione e post-traduzionali modifiche, così come localizzazione subcellulare. Tuttavia, poiché co-IP e reticolazione sono in vitro utilizzando cellule omogeneizzate, è necessario confermare se i due partner proteici sono co-localizzati nella cellula intatta 11. Usiamo abitualmente trasfezione di cellule HEK293 di mammifero a esprimere transitoriamente mammiferi integrale di membrana e proteine ​​citosoliche con il metodo del calcio fosfato di precipitazione 2-4,12-14, Descritta in dettaglio. Questo è un modo economico per fornire in modo efficiente il DNA plasmidico all&#39;interno delle cellule, ma dipende dalla particolare linea cellulare utilizzata e confluenza cellulare, così come la purezza del plasmide DNA 11,15. Il saggio di co-IP comporta l&#39;isolamento della proteina nativa o ricombinante di interesse da lisati cellulari in condizioni non denaturanti consentano co-purificazione di partner di interazione putativi 10,16. Si richiede l&#39;uso di due anticorpi indipendenti, l&#39;anticorpo immunoprecipitating per l&#39;isolamento di proteine ​​X, e l&#39;anticorpo immunoblotting per il rilevamento di Y. socio proteine ​​Può essere utilizzato per verificare se una proteina interagisce con se stessa generando due fusioni differenti con due differenti epitopi tag (ad es., HA e cMyc). L&#39;anticorpo immunoprecipitating è legato attraverso la regione Fc Protein-A (o proteina-G, a seconda delle specie animali in cui l&#39;anticorpo è stata sollevata), cheè coniugato con agarosio (o Sepharose) resina. Proteina X viene precipitato per l&#39;anticorpo: Proteina-A resina dopo incubazione con il lisato cellulare, cioè la frazione di detersivo solubile di cellule omogeneizzate. Protein immuno-complessi vengono eluiti con SDS contenente tampone e successivamente analizzati mediante SDS-PAGE e immunoblotting usando un anticorpo per rilevare la presenza di proteine ​​Y 17. Co-IP deve essere effettuata con proteine ​​detergenti solubili per evitare un eccessivo legame non specifico. La scelta del detersivo e la sua concentrazione, nonché il numero di lavaggi, devono essere ottimizzate per ciascun X: Y pair 10,16,18. La reticolazione viene impiegato per determinare la stechiometria del complesso proteico oligomerica. Si basa su una reazione chimica per creare legami covalenti tra protomers interagenti adiacenti, e, quindi, consente di preservare lo stato oligomerica della proteina durante la separazione SDS-PAGE. Ci sono numerosi reage reticolazionenti di varie lunghezze e la chimica di targeting diversi gruppi reattivi sulle proteine, ammine tipicamente primarie, carbossilici o gruppi tiolo. Qui, descriviamo l&#39;uso di glutaraldeide (OHC (CH 2) 3 CHO), un cross-linker omo-bi-funzionale con due gruppi aldeidici alle due estremità che reagiscono con i gruppi amminici liberi presenti in residui di lisina 19,20. La reticolazione è seguita in modo concentrazione-o dipendente dal tempo con conseguente formazione di addotti. Reazione glutaraldeide viene arrestata con idrazina (H 2 NNH 2) e campioni di proteine ​​vengono poi analizzati mediante SDS-PAGE e immunoblotting 17 per valutare il loro stato di oligomerizzazione. Dobbiamo notare che la reticolazione non induce oligomerizzazione ma semplicemente crea ponti stabili tra complessi proteici preesistenti. Considerazioni importanti quando effettuano esperimenti reticolanti comprendono la scelta di cross-linker, la sua concentrazione e tempo di reazione 19,20.

<table><tbody><tr><td>PART 1 lievito a due ibridi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a piastre</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Usato a 30 gradi C</td></tr><tr><td>Incubatore con agitatore orbitale</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Usato a 30 gradi C con agitazione a 230 - 250 giri/min</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>Per misurare OD600 della coltura di lievito; per misurare l'assorbanza a 420 nm nel saggio b-Gal liquido</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contiene il vettore esca pGBKT7, il vettore preda pACT2 e il ceppo di lievito Y190</td></tr><tr><td>Lievito Azoto Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>Per preparare un terreno di coltivazione SD minimo&nbsp;</td></tr><tr><td>Integratore dropout privo di leucina e triptofano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>Per preparare un terreno di coltivazione SD minimo&nbsp;</td></tr><tr><td>Integratore dropout privo di leucina, triptofano, istidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>Per preparare un terreno di coltivazione SD minimo&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA portatore di testicoli di aringhe</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>Per la trasformazione del lievito</td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman Grado 5&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>per l'uso nel saggio della carta da filtro b-Gal per il sollevamento delle colonie</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galattopiranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>per l'uso nel saggio della carta da filtro per il sollevamento delle colonie b-Gal</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrofenil-beta;-D-galattopiranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>per l'uso nel saggio</td></tr> <tr><td>b-Gal liquidoPARTE 2. Espressione proteica in una linea cellulare di mammifero</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 linea cellulare</td><td>ATCC ATCC</td><td>&reg; &nbsp; CRL-1573&commercio;</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore umidificato (5% CO2, 37 gradi C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>Per coltivare cellule di mammifero</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>Per preparare il terreno di crescita per le cellule di mammifero</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>Per preparare il terreno di crescita per le cellule di mammifero</td></tr><tr><td>Perle di vetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Per omogeneizzare le cellule</td></tr><tr><td>Ago 23 G (0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>Per omogeneizzare le cellule</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi (Completo)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>Per prevenire la proteolisi</td></tr><tr><td><forte>PARTE 3. Metodi biochimici in vitro&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (sistema SDS-PAGE)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&nbsp;</td><td>Per elettroforesi su gel di poliacrilammide</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (sistema di trasferimento semi-secco)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Per il trasferimento elettroforetico</td></tr><tr><td>Processore compatto di pellicole radiografiche</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>Per l'uso nell'immunoblotting</td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>Per l'uso in</td>perle di</tr><tr><td>proteina-A sefarosio reticolante chimico&nbsp;</td><td>GE Healthcare Scienze della vita</td><td>17-5280-01&nbsp;</td><td>Per l'uso in saggi co-IP</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 coniglio policlonale IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>Per l'uso nel test co-IP</td></tr><tr><td>Coniglio non immune IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>Per l'uso nel test co-IP</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 IgG monoclonale di topo)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-40</td><td>Per l'uso nell'immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 IgG monoclonale di topo)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Per l'uso nell'immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-topo IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>Per l'uso nell'immunoblotting</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td> 28906836 <td>Per l'uso nell'immunoblotting</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrato</td><td>Pierce ( ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>Per l'uso nell'immunoblotting</td></tr></tbody></table>

approcci genetici e biochimici per<em&gt; in vivo</em&gt; e<em&gt; in vitro</em&gt; la valutazione di proteine ​​oligomerizzazione: il rianodina receptor case study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

L'oligomerizzazione è spesso un requisito strutturale per le proteine per svolgere la loro specifica funzione cellulare. Ad esempio, la tetramerizzazione del recettore della rianodina (RyR) è necessaria per la formazione di un poro funzionale del canale di rilascio del Ca2+. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per la valutazione dell'autoassociazione proteica, inclusi i saggi di lievito a due ibridi (Y2H), co-immunoprecipitazione (co-IP) e saggi di cross-linking chimico. Nel sistema Y2H, l'autointerazione proteica viene rilevata mediante saggio di β-galattosidasi in esche GAL4 co-esprimenti lievito e fusioni target della proteina in esame. L'autointerazione proteica viene ulteriormente valutata mediante co-IP utilizzando fusioni marcate con HA e cMyc della proteina di prova co-espressa in cellule HEK293 di mammifero. La stechiometria precisa della proteina omo-oligomero viene esaminata mediante cross-linking e analisi SDS-PAGE dopo l'espressione in cellule HEK293. Utilizzando queste tecniche diverse ma complementari, abbiamo costantemente osservato l'auto-associazione del dominio N-terminale RyR e dimostrato la sua intrinseca capacità di formare tetrameri. Questi metodi possono essere applicati all'interazione proteina-proteina e agli studi di omo-oligomerizzazione di altre proteine integrali di membrana dei mammiferi.

Nel sistema Y2H, l&#39;esca: preda interazione è inizialmente testato per selezione lievito crescita in terreno privo (triptofano e leucina) istidina e successivamente valutata β-Gal saggi di attività enzimatica (Figura 1). Lievito coltivate in mezzo di istidina carente ha il tasso di crescita lenta che dipende dalla forza delle esche: interazioni proteina preda. Il test β-Gal avviene nel lievito (coltivate in terreno manca solo triptofano e leucina) sia cresce su supporto solido (agar piastre) o in coltura liquida, con questi ultimi risultati quantitativi rendimento. Abbiamo utilizzato con successo il Y2H per identificare interazioni dominio-dominio all&#39;interno del RyR2, nonché partner proteici nuovi 2-4,12,21,22. Ad esempio, abbiamo proiettato una serie di sovrapposizione costrutti abbracciano l&#39;intera lunghezza della sequenza peptidica RyR2 per l&#39;interazione con un frammento N-terminale (AD4L: residui RyR2 1 - 906 fuso con GAL4 AD). 3 saggi di carta da filtro Colony-lift β-Gal prodotti vivaci colonie di lievito di colore blu solo per il BT4L: coppia di AD4L (Figura 2A), dimostrando che AD4L interagisce con se stessa, vale a dire il BT4L costruire (residui RyR2 1-906 fonde con GAL4 DNA-BD). colonie azzurri sono stati rilevati per la BT8: coppia di AD4L suggerendo un&#39;associazione secondaria più debole con l&#39;estremo dominio C-terminale (BT8), mentre il lievito co-trasformato con qualsiasi altro costrutto è rimasto bianco e quindi negativo per esca: l&#39;interazione proteina preda. Risultati quantitativi, ottenuti mediante saggi β-Gal liquidi (Figura 2B), indicati BT4L robusto: AD4L interazione equivalente in forza alla nota associazione tra la proteina p53 (pVA3) e SV40 grande T antigene (pTD1), mentre la BT8: interazione AD4L è stato notevolmente più debole (&lt;10% rispetto al controllo). Noi abitualmente eseguiamo esperimenti di co-IP (Figura 3) fopo l&#39;espressione transiente in una linea cellulare di mammifero (HEK293), come un test biochimico indipendente per rafforzare i risultati Y2H 2-4,12-14,21-24. Per verificare RyR2 N-terminale self-interazione, due plasmidi separati codificanti per i residui RyR2 1-906 contrassegnati sia con il cMyc o HA peptide epitopo (BT4L e AD4L, rispettivamente), sono stati co-trasfettati in cellule HEK293 con il metodo del calcio fosfato di precipitazione 3. La frazione post-nucleare di cellule omogeneizzata viene solubilizzato con le CHAPS detergenti, e il materiale insolubile è stato rimosso mediante centrifugazione per produrre il lisato cellulare. Il lisato cellulare, trattati con il ridurre ditiotreitolo agente, è stato poi incubato con Ab HA e perline Proteina-A sefarosio per immunoprecipitare AD4L HA-tag. Campioni Co-IP, diluiti con SDS-contenente tampone, sono stati caricati su due gel SDS-PAGE separate (1/10 e 9/10 ° split) e analizzati mediante immunoblotting con Ab HA e Ab cMyc, respectively. Successful IP diretta di AD4L (~ 100 kDa) da Ab HA è stata verificata mediante immunoblotting, ma non nel controllo negativo utilizzando non immune IgG di coniglio (Figura 4A). Importante, cMyc-tag BT4L (~ 100 kDa) è stato recuperato solo nel Ab HA IP, e non nel controllo negativo in assenza di AD4L immunoprecipitato (Figura 4B). saggi Y2H e co-IP fornito prove coerente per RyR2 N-terminale self-interazione, ma non hanno informato sullo stato di oligomerizzazione del dominio N-terminale, ossia se si forma solo dimeri o complessi più alti. Va notato che i complessi si dissociano e solo le subunità comprendente sarà rilevato mediante SDS-PAGE causa di SDS e denaturazione proteica indotta dal calore che sopprime le interazioni proteina-proteina. Per ovviare a questo, usiamo reticolazione (Figura 5) che chimicamente e stabilmente congiunge preesistente Protein oligomeri, la cui massa molecolare possono poi essere esaminati da SDS-PAGE dimensioni separazione 2-5. Ad esempio, omogenato di cellule HEK293 che esprimono cMyc-BT4L, trattati con la riduzione ditiotreitolo agente, è stato fatto reagire con glutaraldeide e analizzata mediante SDS-PAGE e immunoblotting usando Ab cMyc (Figura 6). In aggiunta al monomero (~ 100 kDa), un&#39;alta banda proteica massa molecolare di ~ 400 kDa è stato rilevato in modo dipendente dal tempo, indicando RyR2 N-terminale formazione tetramero 3. In particolare, tetramero era la specie oligomeriche predominanti, con dimero minima e bande trimeri osservati. Per determinare la massa molecolare apparente, l&#39;oligomero BT4L è stato separato a 4 - 15% gel gradiente SDS-PAGE 3. Abbiamo prodotto la curva standard ritardo di massa / gel molecolare utilizzando standard di proteine ​​con una gamma di 30-460 kDa, e abbiamo calcolato l&#39;oligomero di essere 358 kDa 15 (n = 4). Questa massa molecolare apparente è coerente con un tetramero BT4L disposti in unmodo circolare chiuso anziché in forma lineare, come previsto dalla disposizione dei quattro subunità all&#39;interno del canale nativo RyR2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Figura 1. Y2H diagramma di flusso. Lievito, co-trasformato con esche e di destinazione plasmidi, è stato selezionato per la crescita nel medio privo di istidina e / o analizzati per β-Gal attività enzimatica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Figura 2. Y2H suggerisce RyR2 N-terminale del dominio Self-interazione. (A) Schema raffigurante la (esca) serie di umani RyR2 frammenti di proteine ​​sovrapposizione testati nel sistema Y2H per<html> l&#39;interazione con il costrutto AD4L RyR2 N-terminale (preda). Risultati qualitativi ottenuti da filtro colonia-lift saggi carta β-Gal sono indicati in &quot;+&quot; multipli o &quot;-&quot; per l&#39;interazione negativa test (B) di liquido quantitativa β-Gal normalizzati contro il controllo positivo (pVA3 codifica per GAL4 DNA-BD. fusione con la proteina p53; pTD1 codifica per GAL4 AD fusione con SV40 grande antigene T). Modificato da 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> Figura 3. Co-IP diagramma di flusso. Le cellule di mammiferi, co-trasfettate con plasmidi X e Y, omogeneizzazione e detergente-solubilizzato per produrre il lisato cellulare usato nel saggio di co-IP, seguito da SDS-PAGE e immunoblotting.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Figura 4. Co-IP indica RyR2 N-terminale del dominio Self-interazione in cellule di mammifero. HEK293 cellule sono state co-trasfettate per transitoria co-espressione di cMyc-tag (BT4L) e HA-tagged dominio (AD4L) RyR2 N-terminale ( residui 1 - 906). AD4L stato immunoprecipitato con Ab HA da CHAPS-solubilizzate e ditiotreitolo trattati HEK293 lisato, che saggi di controllo, co-IP come negativi sono stati effettuati con non-immuni IgG di coniglio. Proteine ​​immunoprecipitate sono stati riscaldati a 85 ° C per 5 min e risolti a 20 mA per 3 ore attraverso separati 6% gel SDS-PAGE carichi di 1/10 o 9/10 th di campioni IP. trasferimento proteina seguito a 80 V per 2 ore su polyvinylidene membrana difluoruro, analisi immunoblotting è stata effettuata utilizzando (1: 1.000 diluizione) Ab HA (A) o Ab cMyc (B), rispettivamente, seguito da rafano perossidasi-coniugato anti-IgG di topo (1: 10.000 diluizione) e rivelazione chemiluminescente (1 min di esposizione). Un&#39;aliquota di lisato cellulare, 1/50 esimo del volume elaborato nei campioni IP, è stato incluso anche per servire standard di massa molecolare. Modificato da 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Figura 5. reticolazione diagramma di flusso. Le cellule di mammiferi, trasfettate con il plasmide X, sono omogeneizzati e sottoposti a reazione con glutaraldeide nel saggio di reticolazione, seguita da SDS-PAGE e immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Figura 6. La reticolazione Indica RyR2 N-terminale del dominio Tetramero Formazione HEK293 cellule sono state trasfettate per l&#39;espressione transiente di cMyc-tag dominio (BT4L) RyR2 N-terminale (residui 1 - 906).. Cellulare omogeneizzato, trattati con la riduzione dei ditiotreitolo agente, è stata incubata con glutaraldeide per i punti di tempo indicato. I campioni sono stati riscaldati a 85 ° C per 5 min e risolti mediante SDS-PAGE (6% gel) a 20 mA per 3 ore. Dopo il trasferimento proteine ​​a 80 V per 2 ore su una membrana di polivinilidene difluoruro, analisi immunoblotting è stata effettuata utilizzando (1: 1.000 diluizione) Ab cMyc, seguita da rafano perossidasi-coniugato anti-IgG di topo (1:10.000 diluizione) e la rilevazione chemiluminescenza potenziata (1 min di esposizione). Monomerico (M: ~ 100 kDa) e tetramerica (T) forme sono indicati dalle frecce. Modificato da 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

L'oligomerizzazione del recettore della rianodina, un canale ionico omo-tetramerico che media il rilascio di Ca2+ dai depositi intracellulari, è fondamentale per la contrazione del muscolo scheletrico e cardiaco. Qui, presentiamo metodi complementari in vivo e in vitro per rilevare l'autoassociazione proteica e determinare la stechiometria omo-oligomera.

Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

L'obiettivo generale di queste tre tecniche sperimentali complementari, ovvero il test del doppio ibrido nel lievito, l'immunoprecipitazione coniugata e il cross-linking chimico, è valutare le interazioni proteina-proteina e in particolare l'autoassociazione, nonché determinare la composizione stechiometrica degli oligomeri omologhi delle proteine. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cardiopatie, come l'oligomerizzazione dei recettori ultra-dry, alla base di aritmie cardiache e morte improvvisa. I principali vantaggi di queste tecniche risiedono nell'elevata capacità di screening, nella semplicità d'uso e nei risultati altamente riproducibili, richiedendo al contempo attrezzature e reagenti minimi.Le implicazioni di queste tecniche si estendono alla terapia delle malattie cardiache aritmogeniche, poiché contribuiscono a chiarire il meccanismo d'azione molecolare dei farmaci antiaritmici. In generale, le persone alle prime esperienze con la co-immunoprecipitazione possono incontrare difficoltà, rischiando di scartare le perle di agarosio legate alle proteine, che sono molto piccole, durante l'aspirazione del sopranatante nei passaggi di centrifugazione. In questo saggio di due ibridi nel lievito, si utilizzano cellule di lievito in fase mid-log per la trasformazione.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione, risospendere ogni pellet in cinque millilitri di acqua sterile e unire le sospensioni cellulari. Centrifugare la sospensione cellulare. Dopo aver eliminato il soprannatante, risospendere il pellet di lievito in un millilitro di acetato di litio al uno-x e TE, appena preparati e sterili. Le cellule di lievito competenti devono essere utilizzate entro un'ora dalla preparazione.Preparare i campioni di plasmide mescolando il DNA plasmidico bersaglio e DNA plasmidico con 100 microgrammi di DNA di carrier da testicolo di aringa. In ogni tubo da 1,5 millilitro, aggiungere 100 microlitri di sospensione di lievito competente e 600 microlitri di soluzione di acetato di litio e PEG uno-X, quindi vortexare per circa 30 secondi. Incubare a 30 gradi Celsius per 30 minuti, con agitazione.Aggiungere 80 microlitri di dimetilsolfossido e mescolare bene mediante inversione delicata. Effettuare uno shock termico di 15 minuti in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius, mescolando ogni due o tre minuti. Raffreddare la sospensione cellulare su ghiaccio per due minuti, quindi centrifugare per recuperare il lievito.Risospendere ogni pellet cellulare in 100 microlitri di tampone TE 1X. Piastrare le cellule su piastre di mezzo minimo SD appropriato per mantenere la pressione selettiva su entrambi i plasmidi, quello dell'esca e quello del bersaglio. Incubare le piastre capovolte a 30 gradi Celsius per quattro-cinque giorni. Le colonie di lievito sono pronte per questo saggio quando raggiungono un diametro di circa due millimetri.Aggiungere con una pipetta 2,5 millilitri di soluzione di tampone Z e X-gal appena preparata in una piastra pulita da 100 millimetri e posizionare un filtro di carta da filtro in cellulosa nella piastra. Posizionare un nuovo foglio di carta da filtro sulla superficie della piastra contenente le colonie di lievito da sottoporre a saggio. Utilizzare una pinzetta per premere delicatamente la carta da filtro sulla piastra e lasciare in posa per circa cinque minuti affinché le colonie aderiscano. Indossando idonei dispositivi di protezione individuale, sollevare con attenzione la carta da filtro e immergerla in una vaschetta di azoto liquido per 30 secondi. Lasciare scongelare la carta da filtro congelata a temperatura ambiente per due minuti. Posizionare la carta da filtro con il lato delle colonie rivolto verso l'alto sopra la carta da filtro preriscaldata all'interno della piastra da 100 millimetri e incubare a 30 gradi Celsius fino alla comparsa di colonie blu.Un giorno prima della trasfezione, aggiungere mezzo di coltura alle cellule HEK293 in una piastra da 100 millimetri, in modo che le cellule raggiungano una confluenza del 60-70% il giorno successivo. Coltivare per 16-18 ore in un incubatore umidificato. Il giorno della trasfezione, diluire 24 microgrammi di DNA plasmidico con 60 microlitri di cloruro di calcio 2,5 M e acqua sterile deionizzata per ottenere un volume totale di 600 microlitri.Vortexare per mescolare. Aggiungere a gocce la soluzione di DNA plasmidico più calcio in un tubo da 50 millilitri contenente 600 microlitri di soluzione salina tamponata con HEPES 2X, mescolando costantemente e vigorosamente mediante vortex. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione di complessi di DNA plasmidico fosfato di calcio.Dopo l'incubazione di 20 minuti, agitare brevemente con il vortex e aggiungere la soluzione goccia a goccia sulle cellule HEK293, coprendo l'intera superficie della piastra di Petri. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in una atmosfera con il cinque percento di anidride carbonica. Dopo circa sei ore, sostituire il mezzo di crescita e rimettere le cellule nell'incubatore.24 ore dopo la trasfezione, raccogliere le cellule come descritto nel testo del protocollo. Ri-sospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di buffer di omogeneizzazione freddo su ghiaccio e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 millilitro contenente perle di vetro. Utilizzare un ago sottile collegato a una siringa da un millimetro per omogeneizzare le cellule sul ghiaccio.Con il tappo della provetta chiuso, perforare il tappo con l’ago e disperdere vigorosamente la sospensione cellulare attraverso le perle di vetro. Centrifugare a 1500 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i nuclei e le cellule non rotte. Conservare il soprannatante, che rappresenta la frazione post-nucleare, per l’uso in esperimenti di co-immunoprecipitazione o di cross-linking.Per iniziare questa procedura, solubilizzare la frazione subcellulare post-nucleare con chaps allo 0,5 percento e incubare per almeno due ore a quattro gradi Celsius con miscelazione costante. Centrifugare a 20.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere il pellet del materiale insolubile. Conservare il soprannatante.Questo è definito lisato cellulare. Preparare le perle di agarosio proteina A nel buffer per immunoprecipitazione come descritto nel testo del protocollo. Aggiungere un microgrammo dell'anticorpo per immunoprecipitazione a una provetta contenente proteina A.Come controllo negativo, aggiungere un microgrammo di IGG non immune all'altro tubo contenente proteina A. Incubare per almeno due ore a quattro gradi Celsius, con miscelazione costante. Recuperare le perline mediante centrifugazione e scartare con attenzione il soprannatante mediante pipettaggio.Trasferire 200 microlitri del lisato cellulare in ciascuna delle due provette contenenti l'anticorpo e le perle di proteina A. Incubare per almeno due ore a quattro gradi Celsius con miscelazione costante per consentire il legame antigene-anticorpo. Recuperare le perle e lavarle con 200 microlitri di buffer per immunoprecipitazione.Incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius con agitazione. Dopo tre lavaggi, rimuovere con attenzione il soprannatante mediante pipettaggio. Aggiungere 30 microlitri di tampone di caricamento proteico alle perle e centrifugare a 1500 ×g per due minuti a quattro gradi Celsius.Conservare il soprannatante contenente il campione di co-IP per successivi SDS-PAGE e immunoblotting. Per eseguire il cross-linking chimico, centrifugare la frazione subcellulare post-nucleare per ottenere un pellet di aggregati proteici. Conservare il soprannat游戏副本Aggiungere glutaraldeide allo 0,0025 percento in volume su volume a un solo campione. Avviare il cronometro e lasciare che la glutaraldeide reagisca a temperatura ambiente per il tempo indicato. Arrestare la reazione della glutaraldeide al tempo specificato con idrazina al 2 percento in volume su volume e aggiungere cinque microlitri di buffer di caricamento proteico 5X per denaturare le proteine.Il sistema two-hybrid nei lieviti &egrave; stato utilizzato per analizzare costrutti sovrapposti che coprono l'intera lunghezza della sequenza peptidica del recettore della rianodina, alla ricerca di interazioni con AD4L e con il frammento terminale. I saggi beta-gal su carta filtro con rilevamento coloniale hanno prodotto colonie di colore blu intenso soltanto per la coppia BT4L/AD4L, dimostrando che AD4L interagisce con se stesso. Sono state rilevate colonie di colore blu chiaro per la coppia BT8/AD4L, suggerendo un'associazione secondaria, pi&ugrave; debole, con il dominio C-terminale estremo.I risultati quantitativi ottenuti da saggi beta-gal liquidi hanno indicato un'interazione BT4L/AD4L robusta, equivalente nell'intensità all'associazione nota tra la proteina P53, pVA3 e l'antigene T grande di SV40, pTD1. L'interazione BT8/AD4L era notevolmente più debole. I risultati del test di due ibridi nel lievito sono confermati da esperimenti di co-immunoprecipitazione eseguiti dopo l'espressione transitoria di AD4L marcati con etichetta HA e BT4L marcati con etichetta cMyc in una linea cellulare di mammifero.È stata osservata un'immunoprecipitazione diretta di AD4L marcati con HA mediante un anticorpo anti-HA e BT4L marcati con cMyc sono stati recuperati solo nell'immunoprecipitazione anti-HA. È stato eseguito un incrocio chimico su omogenato cellulare che esprimeva BT4L con marcatura cMyc, seguito da elettroforesi su SDS-PAGE e immunoblotting, utilizzando un anticorpo anti-cMyc. Oltre al monomero di 100 chilodalton, è stata rilevata in modo dipendente dal tempo una banda proteica ad alto peso molecolare di circa 400 chilodalton, indicativa della formazione di un tetramero del recettore della ryanodina e del terminale.Nel tentativo di trasfettare cellule di mammifero mediante precipitazione di fosfato di calcio, è importante ricordare di agitare costantemente e vigorosamente il buffer fosfato in un tubo grande con un vortex per un'efficace aerazione, aggiungendo molto lentamente la soluzione del DNA plasmidico. Dopo aver seguito queste procedure, possono essere eseguiti altri metodi come la microscopia confocale nell'immagine del calcio. Queste tecniche dovrebbero aiutare a rispondere ad ulteriori domande, come le proprietà di localizzazione e di rilascio del calcio dei canali recettoriali della rianodina nelle cellule vive.Dopo il loro sviluppo, queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori in diversi settori della segnalazione cellulare per valutare l'oligomerizzazione omologa delle proteine, un processo biologico fondamentale che regola l'attività di fattori di trascrizione, enzimi, canali ionici e recettori.

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