Approcci genetici e biochimici per In Vivo e In Vitro La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

L'obiettivo generale di queste tre tecniche sperimentali complementari, vale a dire, il lievito a due ibridi, la co-immunoprecipitazione e il cross linking chimico, è quello di valutare le interazioni proteina-proteina e, in particolare, l'auto-associazione, e di determinare la composizione stechiometrica degli omo-oligomeri proteici. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cardiopatie come l'oligomerizzazione del recettore ultra-secco, le aritmie cardiache sottostanti e la morte improvvisa. I principali vantaggi di queste tecniche sono lo screening ad alta produttività, la facilità d'uso e i risultati altamente riproducibili, pur richiedendo attrezzature e reagenti minimi.

Le implicazioni di queste tecniche si estendono alla terapia della cardiopatia aritmogena, perché aiutano a stabilire il meccanismo molecolare d'azione dei farmaci antiaritmici. In generale, gli individui che non conoscono la co-immunoprecipitazione avranno difficoltà a causa del potenziale scarto delle perle proteiche di agarosio, che sono molto piccole, durante l'aspirazione del surnatante durante le fasi di centrifugazione. In questo saggio a due ibridi di lievito, le cellule di lievito in fase logaritmica centrale vengono utilizzate per la trasformazione.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione, risospendere ogni pellet in cinque millilitri di acqua sterile e raggruppare le sospensioni cellulari. Centrifugare la sospensione cellulare. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet di lievito in un millilitro di acetato di litio sterile appena preparato e TE. Le cellule di lievito competenti devono essere utilizzate entro un'ora dalla preparazione.

Preparare campioni di plasmidi mescolando il DNA del plasma esca e bersaglio con 100 microgrammi di DNA portatore dei testicoli di aringa. A ciascuna provetta da 1,5 millilitri, aggiungere 100 microlitri della sospensione di lievito competente e 600 microlitri di acetato di litio one-X e soluzione PEG, quindi agitare per circa 30 secondi. Incubare a 30 gradi Celsius per 30 minuti, agitando.

Aggiungere 80 microlitri di dimetilsolfossido e mescolare bene per leggera inversione. Shock termico per 15 minuti a bagnomaria a 42 gradi Celsius, mescolando ogni due o tre minuti. Raffreddare la sospensione cellulare con ghiaccio per due minuti, quindi centrifugare per recuperare il lievito.

Risospendere ogni pellet cellulare in 100 microlitri di one-X TE. Piastra le cellule su piastre medie SD minime appropriate per mantenere la pressione selettiva sia sull'esca che sui plasmidi bersaglio. Incubare le piastre capovolte a 30 gradi Celsius per quattro o cinque giorni. Le colonie di lievito sono pronte per questo test quando hanno un diametro di circa due millimetri.

Pipettare 2,5 millilitri di tampone Z appena preparato e una soluzione X-gal in una piastra pulita da 100 millimetri e posizionare una carta da filtro di cellulosa nella piastra. Posizionare una nuova carta da filtro sulla superficie della piastra con le colonie di lievito da analizzare. Usa una pinza per strofinare delicatamente la carta da filtro sulla piastra e lascia agire per circa cinque minuti affinché le colonie si attacchino.

Durante l'utilizzo di adeguati dispositivi di protezione individuale, sollevare con cautela la carta da filtro e immergerla in una pozza di azoto liquido per 30 secondi. Lascia scongelare la carta da filtro congelata a temperatura ambiente per due minuti. Posiziona la carta da filtro con la colonia rivolta verso l'alto sopra la carta da filtro pre-imbevuta all'interno della piastra da 100 millimetri e incuba a 30 gradi Celsius fino a quando non compaiono colonie blu.

Un giorno prima della trasfezione, alimentare le cellule HEK293 in una capsula di Petri da 100 millimetri, in modo che le cellule siano confluenti al 60-70% il giorno successivo. Coltura per 16-18 ore in un'incubatrice umidificata. Il giorno della trasfezione, diluire 24 microgrammi di DNA plasmatico con 60 microlitri di cloruro di calcio molare 2,5 molare e acqua deionizzata sterile per ottenere un volume totale di 600 microlitri.

Vortice per mescolare. Aggiungere il DNA plasmatico più la soluzione di calcio per goccia in una provetta da 50 millilitri contenente 600 microlitri di soluzione salina tamponata con HEPES 2X, mescolando costantemente e vigorosamente mediante vortex. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione di complessi di DNA plasmatico di fosfato di calcio.

Dopo l'incubazione di 20 minuti, agitare brevemente e aggiungere la soluzione goccia a goccia sulle cellule HEK293 per coprire l'intera superficie della capsula di Petri. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al cinque percento. Dopo circa sei ore, cambiare il terreno di coltura e riposizionare le cellule nell'incubatore.

24 ore dopo la trasfezione, prelevare le cellule come descritto nel testo del protocollo. Risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di omogeneizzazione ghiacciato e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 millilitri contenente perle di vetro. Usa un ago sottile attaccato a una siringa da un millimetro per omogeneizzare le cellule sul ghiaccio.

Con il tappo della provetta chiuso, forare il tappo con l'ago e disperdere vigorosamente la sospensione cellulare attraverso le perle di vetro. Centrifugare a 1500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i nuclei e le cellule integre. Conservare il surnatante che rappresenta la frazione post-nucleare per l'uso in esperimenti di co-immunoprecipitazione o di reticolazione.

Per eseguire questa procedura, solubilizzare la frazione subcellulare post-nucleare con lo 0,5% di chaps e incubare per almeno due ore a quattro gradi Celsius con miscelazione costante. Centrifugare a 20.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare il materiale insolubile. Salvate il surnatante.

Questo è chiamato lisato cellulare. Preparare le perle di agarosio proteina-A nel tampone di immunoprecipitazione come descritto nel testo del protocollo. Aggiungere un microgrammo dell'anticorpo immunoprecipitante a una provetta contenente proteina A.

Come controllo negativo, aggiungere un microgrammo di IGG non immuni all'altra provetta contenente proteina-A. Incubare per almeno due ore a quattro gradi Celsius, mescolando costantemente. Recuperare le perle mediante centrifugazione e scartare con cura il surnatante mediante pipettaggio.

Trasferire 200 microlitri di lisato cellulare in ciascuna delle due provette contenenti anticorpi e perle di proteina-A. Incubare per almeno due ore a quattro gradi Celsius mescolando costantemente per consentire il legame antigene-anticorpo. Recuperare le perle e lavare con 200 microlitri di tampone di immunoprecipitazione.

Incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius mescolando. Dopo tre lavaggi, scartare con cura il surnatante pipettandolo. Aggiungere 30 micorlitri di tampone di carico proteico alle perle e centrifugare a 1500 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius.

Salvare il surnatante contenente il campione di co-IP alluso per la successiva pagina SDS e l'immunoblotting. Per eseguire la reticolazione chimica, centrifugare la frazione subcellulare post-nucleare in aggregati proteici in pellet. Conservare il surnatante e dividerlo in otto aliquote da 20 microlitri ciascuna.

Aggiungere lo 0,0025% di glutaraldeide in volume per volume a un solo campione. Avviare il timer e lasciare che la glutaraldeide reagisca a temperatura ambiente per il periodo di tempo indicato. Arrestare la reazione della glutaraldeide al momento specificato con il due percento di idrazina in volume e aggiungere cinque microlitri di tampone di caricamento proteico 5X per denaturare le proteine.

Il lievito due-ibrido è stato utilizzato per lo screening di costrutti sovrapposti che coprono l'intera lunghezza della sequenza peptidica del recettore della rianodina per l'interazione con AD4L e il frammento terminale terminale. I saggi beta-gal con carta da filtro a sollevamento di colonie hanno prodotto colonie di colore blu vivido solo per la coppia BT4L/AD4L, dimostrando che AD4L interagisce con se stesso. Colonie blu pallido sono state rilevate per la coppia BT8/AD4L, suggerendo un'associazione secondaria più debole con il dominio C-terminale estremo.

I risultati quantitativi dei saggi beta-gal liquidi hanno indicato una robusta interazione BT4L/AD4L, equivalente in forza all'associazione nota tra la proteina P53, pVA3 e l'antigene SV40 large T, pTD1. L'interazione BT8/AD4L era considerevolmente più debole. I risultati dei due ibridi di lievito sono rafforzati da esperimenti di co-immunoprecipitazione a seguito dell'espressione transitoria di AD4L marcato con HA e BT4L marcato con cMyc in una linea cellulare di mammifero.

È stata osservata un'immunoprecipitazione diretta di AD4L marcato con HA da parte di un anticorpo 2 HA e BT4L marcato con cMyc è stato recuperato solo nell'immunoprecipitazione anti-HA. Il cross-linking chimico è stato eseguito su omogenato cellulare che esprime cMyc BT4L, seguito da SDS page e immunoblotting, utilizzando un anticorpo contro cMyc. Oltre al monomero da 100 kilodalton, è stata rilevata una banda proteica ad alta massa molecolare di circa 400 kilodalton in modo tempo-dipendente, indicando la formazione del recettore della rianodina e del tetramero terminale.

Quando si tenta la trasfezione di cellule di mammifero mediante precipitazione di fosfato di calcio, è importante ricordare di agitare costantemente e vigorosamente il tampone fosfato in un tubo grande per un'aerazione efficiente, aggiungendo molto lentamente la soluzione plasmatica che consuma DNA. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altri metodi come il confocale nella micoscopia nell'imaging del calcio. Queste tecniche dovrebbero aiutare a rispondere ad altre domande, come la localizzazione e le proprietà di rilascio del calcio dei canali del recettore della rianodina nelle cellule viventi.

Dopo il loro sviluppo, queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori in diversi campi della segnalazione cellulare per valutare l'omo-oligomerizzazione delle proteine, un processo biologico fondamentale che regola l'attività dei fattori di trascrizione, degli enzimi, dei canali ionici e dei recettori.