Name: Lincorporazione specifici residuo di non canonici amminoacidi in proteine modello utilizzando un Escherichia coli Trascrizione-traduzione sistema non cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Scopri l'incorporazione specifica di amminoacidi non canonici in proteine modello utilizzando un sistema di espressione cell-free di Escherichia coli. Questo metodo consente studi avanzati in biochimica e ingegneria delle proteine.

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E.G. Worst e A. Ott riconoscono il sostegno finanziario da parte della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) all'interno del centro di ricerca collaborativa SFB 1027 e dell'Università del Saarland. E.G. Worst, A. Ott e V. Noireaux riconoscono inoltre l'aiuto finanziario da parte della Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). Gli autori ringraziano Tobias Baumann e Stefan Oehm (Istituto di Chimica, Technische Universität Berlin) per la lettura critica.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un-facile da usare sistema di espressione cell-free come una strategia praticabile per residuo specificamente incorporare NCAAs in proteine, viene presentato. A tal fine, l&#39;estratto grezzo è completato con DNA codificante vettoriale per la proteina di interesse, il buffer di energia e gli amminoacidi corrispondenti. Si noti che il volume dell&#39;aliquota estratto grezzo dipende dalla concentrazione proteica estratto grezzo 34. L&#39;efficienza di espressione acellulare è ottimizzato in funzione della concentrazione di vettore di costruzione di DNA. I volumi dei componenti del tampone di energia variano in funzione della ottimizzato Mg e concentrazioni K-glutammato per consentire alte rese della proteina espressa modello cell-free. Una valutazione preliminare dell&#39;esperimento incorporazione può essere ottenuta eseguendo SDS-PAGE del mezzo di reazione privo di cellule non purificate. Per un&#39;analisi più dettagliata, la spettroscopia di massa HPLC-ESI si propone come un mezzo per verificare la presenza di incor completi e specifici residuiporation della NCAA. Come preparazione per questi ultimi, i sistemi di rotazione delle colonne vengono utilizzate per consentire la purificazione His-tag e buffer di scambio con i piccoli volumi che usiamo in questo protocollo. Tra cui la spettroscopia di massa HPLC-ESI, l&#39;intero protocollo può essere eseguita entro 2 giorni. Non include tutte le misure di particolare criticità. Tuttavia, ottimizzazioni concentrazione di Mg e K-glutammato e del vettore di DNA sono cruciali per esprimere rese elevate della proteina modello. L&#39;uso del altamente efficiente vettore di espressione pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 è fortemente raccomandato. Eluizione di His-tagged proteine ​​è di solito a causa dell&#39;alta concentrazione di imidazolo (&gt; 150 mm) e altri sali, quali NaH 2 PO 4 (&gt; 300 mm) o NaCl (&gt; 50 mm) che generano alto rumore di fondo in analisi spettroscopica di massa 49 . Scambio di tali buffer di eluizione con un buffer di memorizzazione proteina adatto stabilizza il modello protein e riduce drasticamente il rumore di fondo durante l&#39;analisi spettroscopica di massa. Come risultato, può sostituisce Arg in ogni sei posizioni all&#39;interno della proteina modello. Nel sistema di espressione, senza residui Arg possono essere rilevati. Questo semplifica l&#39;incorporazione specifici residui degli analoghi Arg rispetto ad altri sistemi di espressione che richiedono ulteriori strategie esaurimento 29,30. L&#39;approccio cell-free presentato aggira i limiti intrinseci di vivo approcci che sono dovuti alla tossicità può, o la forte dipendenza sequenza di mRNA a singola proteina strategie di produzione 24,31. Contrariamente a quanto impiegato nel sistema vitro, in vivo scissione di Can a omoserina e hydroxyguanidine si verifica 31. Tuttavia, il sistema non cellulare mantiene una quantità sufficiente di Lys per competere con analoghi quali Hyl. L&#39;analisi HPLC-ESI spettroscopia di massa mostra che la proteina Modello contenga sia la canonical così come l&#39;analogo noncanonical in proporzioni diverse. L&#39;incorporazione specifico residuo di Lys è possibile in generale, ma per sostituzione completa, altre strategie di esaurimento, o RAA appositamente progettati e tRNA ottimizzato per il riconoscimento di NCAAs necessario sviluppare. Abbiamo ottenuto ottime rese di cellule libere espressi, proteine ​​modello modificati aggiungendo NCAA alla stessa concentrazione di quelli canonici. L&#39;efficacia di incorporazione dipende dalla natura del NCAA essere incorporati. Anche i rendimenti più elevati potrebbero essere ancora realizzabile ottimizzando la concentrazione del NCAA. I risultati presentati dimostrano l&#39;applicabilità del sistema utilizzato per la costituzione specifica per residuo di NCAAs fintanto che sono accettate dal sistema di traslazione endogena canonica. Per l&#39;inserimento specifico per residuo di NCAAs specifici, un ulteriore bisogno di controllare se i residui del distur CAA analogob il sistema di espressione. Sistemi di trascrizione-traduzione privi di cellule possono essere progettati da organismi diversi per rispondere alle diverse esigenze 54. Il tutto E. coli macchinari trascrizione-traduzione del sistema acellulare qui presentati consentono l&#39;uso di batteriofago ed E. promotori coli, e possono agire in parallelo o consecutivamente in cascata 55. L&#39;applicabilità generale e usabilità rendono il metodo un potente strumento per ulteriori ricerche nella tossicità aminoacidi e applicazioni terapeutiche.

Il codice genetico è universale alla biosfera. Codici per una serie di 20 aminoacidi canonici, che a volte è prorogato di selenocisteina 1 o 2 pirrolisina. È ribosoma che traduce il codice genetico con l&#39;aiuto di tRNA in catene di amminoacidi che si piegano in proteine. I gruppi funzionali degli amminoacidi canonici, in combinazione con modificazioni post-traduzionali, contribuiscono ad una vastissima gamma di funzione proteica 3,4. In linea di massima, limitazioni funzionali a causa del numero limitato di aminoacidi canoniche possono essere superate incorporando ulteriormente, aminoacidi non canonici (NCAAs) che consentono nuove chimiche e nuove funzionalità 3,4. Ci sono due approcci complementari per l&#39;incorporazione di NCAAs: il sito-specifica o l&#39;incorporazione residui. Il primo metodo comporta notevoli difficoltà tecniche, dal momento che la serie canonica-tRNA-synthetases (RAA) e tRNA devono essere ampliati da un paio ortogonali RAA-tRNA che non devono interagire con le macchine di traduzione endogena. Sulla base di un&#39;attenta progettazione, questo approccio incorpora le NCAAs come mutazioni puntiformi singole nei siti proteina desiderata. Site-specific incorporazione di NCAAs è geneticamente codificato da un codone che non è assegnato ad un acido amino canonica (CAA), di solito un codone di stop 5-9. Questo metodo comporta cambiamenti nella funzione in un determinato sito, piuttosto che su tutta la proteina 10-13. Al contrario, l&#39;incorporazione specifico residuo si basa sul riconoscimento errato dell&#39;amminoacido noncanonical dalla macchina di traduzione canonica. L&#39;incorporazione verifica a causa della mancanza di specificità di substrato delle RAA. L&#39;incorporazione specifici residuo di NCAAs, costruita sul lavoro di Cohen e colleghi 14, ha portato a importanti applicazioni 3,10, tra i quali bio-ortogonali etichettatura 15-17 di proteineo la struttura delle proteine ​​delucidazione in cristallografia a raggi X 18. Come AARS naturali in genere preferiscono il loro aminoacido cognate su un NCAA isostructural, efficiente incorporazione vivo specifici residui di solito richiede un host espressione auxotrophic non in grado di sintetizzare l&#39;analogo canonica della NCAA. Le cellule ospiti vengono coltivate in terreno di crescita che fornisce solo una bassa concentrazione del CAA analogo. Il suo esaurimento in combinazione con l&#39;integrazione consecutiva con la NCAA costringe l&#39;host espressione di incorporare la NCAA nella proteina modello a più siti, canonicamente prescritti. In contrasto con l&#39;approccio sito-specifica, questo ha generalmente un profondo impatto su tutta la struttura proteica, determinando modificato notevolmente le proprietà fisiche e chimiche delle proteine ​​19,20. Tuttavia, la maggior parte del NCAAs sono inibitori della crescita per l&#39;espressione ospitante 3, in cui sono incorporati in molti altri proteins oltre a quelli di interesse durante l&#39;espressione del gene ricombinante. Questo limita chiaramente l&#39;approccio in vivo. L&#39;incorporazione in vivo di aminoacidi che sono tossici o che hanno una forte influenza sulla struttura delle proteine ​​rimane particolarmente impegnativo. Tuttavia, queste molecole sono tra i più promettenti per progettare proteine ​​con funzioni straordinarie. Un esempio è il, noncanonical, naturale L-canavanina tossica (Can), un analogo di L-arginina (Arg). Essa colpisce e blocca ARG percorsi associati reazione normativi e catalitiche, e la sua presenza nella cellula vivente può portare a morte immediata 3,21-23. La sua incorporazione in proteine ​​in posizioni di arginina può ridurre la stabilità proteica 21-23. A causa della tossicità risultante, espressione di canavanina contenente proteine ​​in Escherichia coli (E. coli) e altri host di espressione comune rimane una sfida. Per queste ragioni, completa in vivo incorporation di Can in tutte le posizioni Arg è stata adeguatamente confermata solo una volta 24, utilizzando un sistema di produzione elaborato singola proteina. Tuttavia, Can è stato proposto come un agente anti-cancro 25-27, e come stimolatore per le malattie autoimmuni nell&#39;uomo 28. Inoltre, è oggetto di diversi studi sulla sua anti-metabolico, antibatterica, antimicotica e proprietà antivirali 25. Queste proprietà sollevano una domanda di efficiente e facile da eseguire metodi per esprimere Può contenenti proteine ​​per farmacia, mediche e studi funzionali. Anche se molti problemi che sono connessi alla produzione in vivo possono essere aggirate utilizzando sistemi di espressione cell-free, negli approcci vitro specifici residui sono realtà poco esplorata. Sono stati segnalati L&#39;incorporazione privo di cellule specifiche del residuo di un analogo L-triptofano 29 e multipla NCAAs 30. Questi metodi si basano sul altamente efficiente T7 RNA polimerasi. La polimerasi T7 RNA comporta trascrizione batteriofago-like, riducendo in tal modo la funzionalità genetica rispetto alla trascrizione endogeno. L&#39;incorporazione completa specifica per i residui di Can in una proteina modello in tutte le posizioni Arg è stato recentemente riportato 31, utilizzando un sistema di espressione cell-free 32. Una leggera modifica dello stesso sistema ha permesso l&#39;incorporazione site-specific di diversi analoghi pirrolisina in una proteina modello tramite codone di stop soppressione 33. Il sistema non cellulare impiegato 31 - 33 si basa su un all E. sistema di trascrizione-traduzione coli. Tuttavia, consente l&#39;espressione della proteina nel modo più efficiente in sistemi batteriofago correnti (0,5 - 1 mg / ml di proteina ricombinante) 32, pur mantenendo buona parte della modularità trascrizione-traduzione originale. In questo lavoro, un protocollo dettagliato è fornito come il residspecifico ue incorporazione di NCAAs può essere realizzato utilizzando questo tutto E. sistema non cellulare coli 32. Inoltre, vengono proposti ulteriori passi per preparare le proteine ​​espresse per la valutazione del caso tramite spettroscopia di massa HPLC-ESI. Per espandere le proprietà di questo sistema privo di cellule, questo lavoro non si riferisce solo alla incorporazione pubblicato Can 31, ma presenta anche nuovi dati relativi al noncanonical L-lisina analogico L-idrossi-lisina. Il seguente protocollo per l&#39;inserimento specifico per residuo di NCAAs è un adattamento di un protocollo recentemente pubblicato in JoVE 34. Quest&#39;ultimo protocollo descrive come eseguire altamente efficiente libera espressione-cella con amminoacidi standard. Inoltre, esso presenta la preparazione dell&#39;estratto libera cellulari grezzi, la soluzione di aminoacidi, la soluzione di energia stock e il buffer energia utilizzata in questo approccio. Il seguente protocollo concentra su passi modificati rispetto alla precedente pROTOCOLLO al fine di consentire l&#39;integrazione specifica per residuo di NCAAs. pipette calibrate, consigli bassi vincolante pipetta e tubi micro-centrifuga sono raccomandati per la preparazione. Nel seguito, vengono utilizzate le abbreviazioni IUPAC per gli aminoacidi.

<table><tbody><tr><td>Occhiali protettivi</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>Guanti in nitrile (taglia S)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z768960</td><td>Numeri di catalogo altre taglie: Z768979 per M, Z768987 per L e Z768995 per XL</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1,5 ml (PCR clean)</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Microbalance Discovery DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee, Svizzera</td><td>80104140</td><td></td></tr><tr><td>Microspatola (L 6 5/8 pollici, acciaio inossidabile, diametro asta 0,09 pollici)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C9758</td><td>Tossicità acuta: indossare visiere oculari, maschera antipolvere, guanti protettivi</td></tr><tr><td>Idrossilisina (miscela racemica)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-gloves (taglia S, resistente all'acqua)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z183490</td><td>Altri formati: Z183512 per M, Z183520 per L e Z183539 per XL</td></tr><tr><td>RTS Campionatore di Aminoacidi</td><td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germania</td><td>BR1401801</td><td>Per la preparazione casalinga di soluzioni stock di aminoacidi, seguire questo protocollo35 e utilizzare il kit di aminoacidi solidi LAA21-1KT, L-prolina (81709-25G), L-cisteina (30089-25G), L-istidina (53319-25G) e L-lisina (L5501-5G)&nbsp; (tutti da Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stati Uniti</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stati Uniti</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, Stati Uniti</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, Stati Uniti</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, Stati Uniti</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (da E. coli, confezione da 100 mg)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10109541001</td><td>Il numero di catalogo per la confezione da 500 mg è 10109550001</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD (dal lievito</td>) <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A9501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acido folinico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stati Uniti</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stati Uniti</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutammato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stati Uniti</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>K-glutammato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stati Uniti</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, Stati Uniti</td><td>Plasmide #40019</td><td></td></tr><tr><td>4-20% gel di tris-glicina prefabbricati (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 corsi)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germania</td><td>TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>SDS tampone di corsa (10 x concentrato, 5.000 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germania</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>SDS tampone di caricamento (2 x concentrato, 50 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germania</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore proteico non colorato, ampio intervallo (2-212 kDa)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1060091011</td><td>Tossico per inalazione, a contatto con la pelle e in caso di ingestione: indossare guanti protettivi e lavorare sotto la cappa aspirante</td></tr><tr><td>Acido acetico (99,8%)</td><td>VWR International, Darmstadt, Germania</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germania</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep per proteine His-Spin</td><td>Zymo Research Europe, Friburgo, Germania</td><td>P2002</td><td>Prodotto distribuito anche da Zymo Research Corporation, Irvine, USA&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo, 99%</td><td>VWR International, Darmstadt, Germania</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>CentriPure Z25 mini colonne di rotazione</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Germania</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore 5301</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Provette per perline (microfiale in polipropilene)</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>Perline 522S</td><td></td></tr><tr><td>, 0,1&nbsp; mm Ø.</td><td>Biospec, Bartlesville, Stati Uniti</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli ceppo</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Bradford BSA</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Germania</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette, 1.5&nbsp; ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Colonne per cromatografia Micro Bio-Spin Bio-Rad</td><td>, M&uuml; nchen, Germania</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di fondo ottico Nunc a 384 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Nastro sigillante Nunc</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega, Madison, USA</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bibasica di fosfato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione monobasica di fosfato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Cassette per dialisi Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Spermidina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; L bottiglia da centrifuga</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>A98813</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; L Erlenmeyer pallone</td><td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td><td>26500-4000</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Avanti J-26XP</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>393127</td><td>O centrifuga equivalente in grado di centrifugare bottiglie da 1 L.</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale Forma 480</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>480</td><td>O agitatore equivalente in grado di scuotere il torace 6 x 4 L .</td></tr><tr><td>Rotore JLA-8.1000</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>363688</td><td>O rotore equivalente da 5.000 x g per la centrifuga di cui sopra, in grado di centrifugare bottiglie da 1 L.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R microcentrifuga refrigerata</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>368831</td><td>O centrifuga equivalente in grado di centrifugare provette di reazione da 2 ml.</td></tr><tr><td>Blocco riscaldante HLC HBT 130</td><td>Labexchange, Burladingen, Germania</td><td>24465</td><td>O blocco riscaldante equivalente in grado di riscaldare campioni in provette di reazione fino a 100 °C.</td></tr><tr><td>Eppendorf MiniSpin centrifuga</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td>5452000018</td><td>O centrifuga equivalente in grado di centrifugare provette di reazione da 2 ml.</td></tr><tr><td>IKA Vortex 3 (diametro dell'agitatore orbitale di 4 mm, 0 - 2.500 giri/min)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z654760</td><td>Vortice equivalente in Or</td></tr><tr><td>Scotsman AF103 macchina per la fioccatura del ghiaccio</td><td>K&auml; lte-Berlin, Berlino, Germania</td><td>AF103</td><td>O macchina per la fioccatura del ghiaccio equivalente.</td></tr><tr><td>Mini incubatore digitale MyTemp</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z763314</td><td>O incubatore equivalente in grado di riscaldare campioni a 29 °C.</td></tr><tr><td>Cella / camera per elettroforesi EcoCell</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germania</td><td>AN12005</td><td>Camera per elettroforesi o equivalente in grado di eseguire l'elettroforesi verticale su gel con i gel prefabbricati di cui sopra o altri gel utilizzati.</td></tr><tr><td>Alimentatore Power-phor per cella / camera di elettroforesi</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germania</td><td>AN12001</td><td>O alimentatore equivalente in grado di alimentare la cella / camera di elettroforesi sopra utilizzata con alimentazione</td></tr><tr><td>VWR Signature Starter Kit di pipettatori ergonomici a volume variabile a canale singolo ad alte prestazioni VWR</td><td>1 VWR International, Darmstadt, Germania</td><td>613-5278</td><td>O micropipette equivalenti che consentono di pipettare volumi simili con la stessa precisione</td></tr><tr><td>Pipettatori ergonomici a volume variabile monocanale VWR Signature Starter Kit 2</td><td>VWR International, Darmstadt, Germania</td><td>613-5279</td><td>O micropipette equivalenti che consentono di pipettare volumi simili con la stessa precisione</td></tr><tr><td>Puntali Pipetman Diamond D10ST (0,1 - 10 &; l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171101</td><td>O puntali per pipette equivalenti a basso legame che consentono di pipettare volumi simili con la stessa precisione</td></tr><tr><td>Puntali Pipetman Diamond D200ST (2 - 200 &micro; l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171301</td><td>O puntali per pipette equivalenti a basso legame che consentono di pipettare volumi simili con la stessa precisione</td></tr><tr><td>Puntali Pipetman Diamond D1000ST (100 - 1.000&nbsp; &micro; l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171501</td><td>O puntali per pipette equivalenti a basso legame che consentono di pipettare volumi simili con la stessa precisione</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 ml con tappo a vite (sterili)</td><td>VWR International, Darmstadt, Germania</td><td>50-0156</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 ml con tappo a vite (sterili)</td><td>VWR International, Darmstadt, Germania</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polipropilene da 14 ml (fondo tondo, tappo di sfiato a due posizioni, sterile)</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania</td><td>187262</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HPLC Discovery BIO Wide Pore C5 (3 &; micro; m dimensione delle particelle, L x diametro interno 10 cm x 2,1 mm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>567227-U</td><td></td></tr><tr><td>Macchina HPLC Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G1312B</td><td></td></tr><tr><td>Serie 6500 Tempo-di-volo a quadrupolo a massa precisa (Q-TOF) LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G6530BA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>270717</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech, Ortenberg, Germania</td><td>415-101</td><td>O lettore di micropiastre equivalente in grado di misurare la fluorescenza della proteina modello espressa</td></tr><tr><td>Hanna Checker Misuratore di pH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z351091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Additivo eluente per acido formico per LC-MS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>56302</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;incorporazione specifici residuo di non canonici amminoacidi in proteine ​​modello utilizzando un<em&gt; escherichia coli</em&gt; trascrizione-traduzione sistema non cellulare

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

L&#39;insieme canonica di aminoacidi porta ad una vastissima gamma di funzionalità della proteina. Tuttavia, l&#39;insieme di residui impone ancora limitazioni potenziali applicazioni proteine. L&#39;incorporazione di aminoacidi non canonici può allargare questo ambito. Ci sono due approcci complementari per l&#39;incorporazione di aminoacidi non canonici. Per incorporazione sito-specifica, oltre ai endogeni macchinari traslazionali canonici, una coppia-tRNA-sintetasi-tRNA ortogonali deve essere previsto che non interagisce con i canonici. Di conseguenza, un codone che non è assegnato ad un aminoacido canonica, di solito un codone di stop, è anche necessario. Questa espansione codice genetico consente l&#39;incorporazione di un amminoacido non canonica in un unico, determinato sito all&#39;interno della proteina. Il lavoro qui presentato descrive incorporazione specifici residui in cui il codice genetico viene riassegnato all&#39;interno del sistema di traslazione endogeno. Il meccanismo di traduzione di unccepts l&#39;aminoacido non canonica come surrogato per incorporarlo in luoghi canonicamente previsti, vale a dire, tutte le occorrenze di un amminoacido nella proteina canonica sono sostituite da quella canonica. L&#39;incorporazione di amminoacidi non canonici può modificare la struttura della proteina, causando considerevolmente modificate le proprietà fisiche e chimiche. Non canonici analoghi aminoacidi spesso agiscono come inibitori della crescita delle cellule per gli host di espressione in quanto modificano proteine ​​endogene, limitante nella produzione di proteine ​​vivo. In vivo incorporazione di aminoacidi non canonici tossici in proteine ​​rimane particolarmente impegnativo. Qui, un approccio senza cella per una sostituzione completa di L-arginina dal noncanonical aminoacido L-canavanina è presentato. Si aggira le difficoltà insite di espressione in vivo. Inoltre, un protocollo per preparare proteine ​​bersaglio per l&#39;analisi spettrale di massa è inclusa. E &#39;dimostrato che la L-lisina può essere sostituito da L-idrossi-lisina,anche se con minore efficienza. In linea di principio, qualsiasi analogico amminoacido noncanonical può essere incorporato con il metodo presentato finché il sistema in vitro traduzione endogena riconosce.

Questo protocollo guida attraverso l&#39;incorporazione specifici residuo privo di cellule di NCAAs in proteine ​​modello. Essa propone SDS-PAGE per una valutazione preliminare dell&#39;esperimento costituzione e ulteriori passi per preparare le proteine ​​modello per un adeguato HPLC-ESI analisi spettroscopica di massa. Qui, risultati rappresentativi dell&#39;incorporazione specifico residuo privo di cellule del analogico Arg Can, nonché la Lys analogico L-idrossi-lisina (Hyl) sono presentati. Le diverse soluzioni di aminoacidi, il buffer di energia, il DNA codificante vettoriale per il modello proteine ​​e reazioni privi di cellule sono preparati come descritto sopra. La reazione libera-cella di riferimento è fornito con la soluzione di aminoacidi costituito dai 20 CAAS. Per ogni esperimento, una reazione cell-free controllo negativo viene fornito con la soluzione di aminoacidi che manca l&#39;analogo canonica della NCAA in questione. Per ogni approach, una reazione cell-free esprime la proteina modello in presenza della soluzione di aminoacidi, in cui la CAA è sostituito dalla analogico non canonica. His-tag purificazione, lo scambio di buffer e HPLC-ESI analisi di spettrometria di massa vengono eseguiti secondo il protocollo sopra descritto. La proteina modello è il C-terminale His-tagged deGFP 32, una versione troncata di EGFP 53. La sua una lettera sequenza aminoacidica in cui si trovano (materiale supplementare 2). Questa proteina modello contiene 6 Arg e 18 posizioni Lys, rispettivamente. Il vettore di espressione è pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Nel caso di completa incorporazione della NCAA, si può supporre che la reazione di controllo negativo non esprime deGFP, dal momento che uno dei 20 CAAS è mancante. Al contrario, deGFP deve essere rilevabili negli altri due reazioni: quello nativo nel refeRence reazione cell-free e la proteina modificata nella reazione priva di cellule che viene fornito con la NCAA. La figura 1A mostra la valutazione preliminare SDS-PAGE dell&#39;esperimento incorporazione Can. La reazione di riferimento-cella libera ha il più alto livello di espressione deGFP. Nella reazione priva di cellule che viene fornito con Can, deGFP è espressa a concentrazioni leggermente inferiori. Nessuna espressione deGFP può essere rilevata nel controllo negativo. Questo risultato SDS-PAGE è una buona indicazione per un inserimento di successo di Can nel deGFP proteina bersaglio. Per dimostrare l&#39;incorporazione completa ipotizzato di Can in deGFP, entrambe le proteine ​​purificate modello, visualizzati nella figura 1B, sono analizzati tramite spettroscopia di massa HPLC-ESI. Figura 1C mostra gli spettri di massa deconvoluzione delle molecole deGFP purificate. La massa deconvoluzione di °?<html> P che si esprime nella reazione priva di cella di riferimento è 26,192.8 Da. Per deGFP espresso nella Can contenente reazione priva di cella appare una massa di 26202,5 ​​Da. Le masse attesi per il nativo deGFP6Arg e la deGFP6Can modificato con Arg essere completamente sostituiti da Can sono 26.193 e 26.204 Da Da, rispettivamente. La differenza di massa di 1,5 Da per deGFP6Can si trova l&#39;errore dello spettro deconvoluzione. Così, è confermata la piena integrazione di Can in deGFP in tutte le 6 posizioni Arg. I due picchi di intensità ridotta corrispondono alla deGFP6Arg nativo e deGFP6Can modificati che non ha raggiunto il fluoroforo maturo. Il fluoroforo viene autocatalytically generato dalla eliminazione di una molecola di H 2 O, seguita da ossidazione. Questo porta ad una massa maggiore del 20 Da se questo processo non procede. pg &quot;/&gt; Figura 1. valutazione SDS-PAGE del esperimento può costituzione e spettroscopia di massa HPLC-ESI dei cell-free molecole deGFP espressi e purificati. (A) la valutazione preliminare della esperimento può incorporazione mediante SDS-PAGE. Da sinistra a destra: standard di proteine, reazione priva di cella di riferimento, controllo negativo e la reazione cell-free che fornisce Can invece di Arg. (B) SDS-PAGE dopo His-tag purificazione e buffer di scambio delle molecole deGFP espresse. Da sinistra a destra: standard di proteine, deGFP purificata dalla reazione di riferimento, purificato deGFP dalla reazione può che contiene. (C) La conferma della piena incorporazione di Can mediante spettroscopia di massa HPLC-ESI. Le masse attesi del nativo deGFP e la deGFP modificato con Arg completamente sostituite da Can sono 26.193 e 26.204 Da Da, rispettivamente. Ogni spettro è normalizzata alla sua massima intensità (conteggi). posizioni di picco sono indicatein Da. Per scopi di visualizzazione, le corsie del gel vengono estratti dalle immagini gel, uniti insieme, sono convertiti in formato scala di grigi, formato è ottimizzato e contrasto e luminosità vengono migliorate. Corsie del gel originali sono presentati in materiale supplementare 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> La figura 2A mostra la valutazione preliminare SDS-PAGE dell&#39;esperimento incorporazione Hyl. Nella reazione priva di cellule che viene fornito con Hyl, deGFP si esprime. Contrariamente al primo esperimento, una banda deGFP debole può essere osservato nella reazione di controllo negativo. Questo potrebbe essere dovuto a residui di Lys nelle reazioni cell-free. Ciò consente un&#39;espressione deGFP debole nella reazione di controllo negativo, in cui vengono aggiunti né Lys né Hyl. Per H<html> Spettroscopia di massa PLC-ESI, le molecole deGFP della reazione privo di cellule dotate Hyl sono purificati e buffer vengono scambiati (Figura 2B). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> Figura 2. valutazione SDS-PAGE dell&#39;esperimento incorporazione Hyl (A) Da sinistra a destra:. Reazione priva di cellule di controllo negativo, la reazione senza cella contenente Hyl e standard di proteine. (B) SDS-PAGE dopo His-tag purificazione e buffer di scambio delle molecole deGFP espresse. Da sinistra a destra: purificata deGFP dal Hyl contenente reazione e standard di proteine. Per scopi di visualizzazione, le corsie del gel vengono estratti dalle immagini gel, uniti insieme, sono convertiti in formato scala di grigi, formato è ottimizzato e contrasto e luminosità vengono migliorate. corsie del gel originali sono presentati in materiale supplementare 3.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. La figura 3 mostra lo spettro di massa deconvoluzione di molecole deGFP purificati. Figura 3A conferma l&#39;ipotesi del già presenti residui Lys nelle reazioni acellulari. Il picco predominante dello spettro corrisponde al nativo (massa prevista: 26.193 Da) deGFP. Anche in questo caso, deGFP molecole di un 20 Da massa superiore che non hanno sviluppato la loro fluoroforo possono essere rilevati. I residui Lys sono preferenzialmente caricati sul tRNA Lys da lysyl-tRNA-sintetasi portando ad un alto livello di espressione dei deGFP18Lys nativi. La differenza di massa tra Hyl e Lys è di 16 bis. A causa della presenza di Hyl che è in concorrenza ai residui Lys tutte le specie deGFP possibili sono generate (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (Figura 3B). Certamente, il picco di deGFP1Hyl + 17Lys sovrappone con il picco del deGFP nativa che non producono sua fluoroforo (Figura 3A) e la massa di alcuni picchi differisce più di 2 Da dalla massa prevista. Queste differenze di massa possono essere attribuiti al rumore elevato a causa di basse quantità di specie deGFP. Tuttavia, Hyl è generalmente costituita dal sistema privo di cellule. Ulteriori miglioramenti devono essere fatte per abolire i residui di Lys nelle reazioni cell-free. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . Figura 3. HPLC-ESI spettroscopia di massa delle molecole deGFP purificate della reazione priva di cella che contiene Hyl (A) I deGFP18Lys nativi è prevalentemente rilevata (masse attese: con fluoroforo 26.193 Da, senza fluoroforo maturo 26.213 Da). (B)Ingrandimento rivela l&#39;esistenza di tutte le possibili specie deGFP (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Le loro masse sono attesi 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). Lo spettro è normalizzata alla sua massima intensità (conteggi). Posizioni di picco sono indicate in Da. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> Supplemental materiale 1. modello di calcolo. Nella sezione 2, la preparazione del master mix buffer di energia è esemplificato con aliquote greggio estratto di 30 ml e ottimale Mg e le concentrazioni di K-glutammato rispettivamente 3 mm e 30 mm. Questo esempio conduce ad un volume master mix che produce 3 aliquote tampone energia. nel seczione 3, la preparazione della reazione acellulare è esemplificato utilizzando una soluzione a 90 nm il DNA stock portando ad una concentrazione ottimale di DNA vettore di 10 Nm nella reazione acellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a> Per un&#39;adeguata tracciabilità, l&#39;uso del modello di calcolo è esemplificato mediante inserimento di questi valori tipici che differiscono dall&#39;esempio precedente: Crude volumi estratto: 28 microlitri, ottimale Mg-glutammato: 2 mM, ottimale K-glutammato: 40 mm, N. di aliquote tampone desiderati: 100, concentrazione ottimale vettore in reazione cell-free: 8 nm, DNA vettore stock soluzione: 150 nm. Prima immettere 28 microlitri come volume estratto grezzo nel campo arancione della prima sezione del modello. Poi, entrare nella seconda sezione del modello da 2 mm und 40 mm come ottimale Mg e le concentrazioni di K-glutammato nei campi di colore arancione. Tenendo conto della ottimale Mg e K concentrazioni, la composizione di un buffer di energia 15 microlitri, nonché un corrispondente, scalati aliquota 16 microlitri viene calcolato. Qui di seguito, di conseguenza immettere 100 come numero desiderato di aliquote di buffer di energia (16 ml). Il modello si adatta ai volumi dei diversi componenti del tampone per il master mix 1.700 ml come segue: 204 ml di soluzione madre 100 mM Mg-glutammato, 136 ml di soluzione madre 3 M K-glutammato, 728.73 ml di 14x soluzione di energia, 510 microlitri del 40% PEG-8000 e 121.27 ul sterile DDH 2 O. Infine, nella terza sezione del modello, inserire 8 nm e 150 nm come concentrazione ottimale vettore nella reazione privo di cellule e, rispettivamente, il DNA vettore concentrazione della soluzione. Il modello adatta i volumi dei diversi componenti che devono essere aggiunti ai 28 ml di estratto grezzo per finalizzare la preparazione di un 90 microlitrireazione cell-free come segue: 15 microlitri di tampone di energia, 15 ml di una delle 3 soluzioni aminoacidi diversamente composte, 4,80 ml ​​di soluzione di DNA vettoriale (150 nM) e 27.20 ml di DDH sterile 2 O. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> Supplemental Materiale 2. Una lettera sequenza aminoacidica della proteina modello deGFP. Questa proteina modello contiene 6 Arg e 18 posizioni Lys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> Materiale supplementare 3. lunghezza e corsie del gel non modificati che corrispondono alle tabelle gel presentato Figura Figura 1 e 2. Le corsie del gel presentato in ogni individuo s<html> ubfigure sono estratti dal medesimo gel di poliacrilammide SDS. Nella figura 1 e 2 queste corsie sono state riunite insieme per scopi di presentazione. pesi molecolari di bande proteiche di serie sono indicate accanto alle figure. (A.1) corsie del gel non tagliate di figura 1A. Da sinistra a destra: standard di proteine, reazione priva di cella di riferimento, controllo negativo e la reazione cell-free che fornisce Can invece di Arg. (A.2) corsie del gel non tagliate di Figura 1B. Da sinistra a destra: standard di proteine, deGFP purificata dalla reazione di riferimento, purificato deGFP dalla reazione può che contiene. (B.1) corsie del gel non tagliate di figura 2A. Da sinistra a destra: la reazione priva di cellule di controllo negativo, la reazione senza cella contenente Hyl e standard di proteine. (B.2) corsie del gel non tagliate di figura 2B. Da sinistra a destra: purificata deGFP dal Hyl contenente reazione e standard di proteine.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Un protocollo di espressione facile da usare e privo di cellule per l'incorporazione specifica del residuo di analoghi di amminoacidi non canonici nelle proteine, compresa l'analisi a valle, viene presentato per studi medici, farmaceutici, strutturali e funzionali.

L&#39;incorporazione specifici residuo di non canonici amminoacidi in proteine ​​modello utilizzando un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Trascrizione-traduzione sistema non cellulare

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

L'obiettivo generale di questa procedura è incorporare in modo specifico per residuo analoghi di aminoacidi non canonici in proteine modello utilizzando un sistema di espressione cell-free e fornire un'analisi a valle. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nei settori della farmacologia medica e della biologia strutturale, come ad esempio il ruolo degli aminoacidi non canonici nella struttura proteica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, in assenza di un ospite vivente, aminoacidi tossici possono essere incorporati nelle proteine modello. Per iniziare l'esperimento, preparare soluzioni stock complete dei 20 aminoacidi canonici, o CAAs, e della soluzione stock di aminoacido non canonico, o ncAA, precedentemente preparata, a temperatura ambiente. Una volta che le soluzioni si sono scongelate, vortexarle ripetutamente per ridisciorre gli aminoacidi precipitati e posizionare gli aminoacidi sul ghiaccio. Successivamente, trasferire 1,4 millilitri di acqua sterile doppiamente distillata in un tubo da centrifuga da 15 millilitri e posizionarlo sul ghiaccio. Aggiungere 175 microlitri di ciascuna soluzione stock di aminoacido, uno alla volta, vortexando accuratamente il tubo dopo ogni aggiunta e riposizionandolo sul ghiaccio. Dopo aver aggiunto tutti gli aminoacidi, vortexare accuratamente il tubo. Incubare il tubo finché la soluzione non risulti il più possibile limpida. Suddividere la soluzione della miscela master di aminoacidi in tre volumi uguali di 1,35 millilitri in tubi da reazione da 1,5 ml e mantenerli sul ghiaccio. Aggiungere 50 microlitri della soluzione stock da 168 millimolare del CAA corrispondente al ncAA al primo volume suddiviso, per creare la soluzione di aminoacidi contenente tutti e 20 i CAAs. Vortexare accuratamente la soluzione, quindi riposizionare il tubo sul ghiaccio. Aliquotare la soluzione in tubi da reazione e etichettarli come più CAA. Congelare rapidamente gli aliquote in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di acqua sterile doppiamente distillata al secondo volume suddiviso della miscela master di aminoacidi per preparare una miscela di aminoacidi contenente 19 CAAs, vortexare accuratamente la soluzione e riposizionarla sul ghiaccio. Aliquotare la soluzione ed etichettare i tubi come meno CAA. Infine, aggiungere 50 microlitri della soluzione stock da 168 millimolare del ncAA all'ultimo volume di 1,35 millilitri per preparare una miscela di aminoacidi contenente 19 CAAs e il ncAA. Vortexare accuratamente la miscela e riposizionarla sul ghiaccio. Aliquotare, etichettare e congelare i tubi. Sul ghiaccio, scongelare tre aliquote da 30 microlitri di estratto grezzo, un'aliquote da più CAA, un'aliquote da meno CAA, un'aliquote da ncAA, tre aliquote di tampone energetico e la soluzione di DNA vettore. Posizionare l'acqua sterile doppiamente distillata sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere 15 microlitri di tampone energetico e aspirare e dispensare ripetutamente, quindi vortexare delicatamente la soluzione per mescolare. Aggiungere 15 microlitri dell'aliquote della soluzione di aminoacidi più CAA, 10 microlitri di soluzione di DNA vettore da 90 nanomolari e 20 microlitri di acqua sterile doppiamente distillata ai 30 microlitri di estratto grezzo. Impostare il controllo negativo aggiungendo 15 microlitri di tampone energetico, 15 microlitri di meno CAA, 10 microlitri di soluzione di DNA vettore da 90 nanomolari e 20 microlitri di acqua sterile doppiamente distillata ai 30 microlitri di estratto grezzo. Procedere con la reazione ncAA combinando 15 microlitri di tampone energetico, 15 microlitri di più ncAA, 10 microlitri di soluzione di DNA vettore da 90 nanomolari e 20 microlitri di acqua sterile doppiamente distillata ai 30 microlitri di estratto grezzo. Quindi incubare tutti i tubi. Dieci minuti prima di eseguire l'SDS-PAGE, diluire un microlitro di ciascuna delle reazioni viscose cell-free in quattro microlitri di acqua sterile doppiamente distillata in tubi da reazione. Vortexare accuratamente e centrifugare brevemente i liquidi con una mini centrifuga. Aggiungere cinque microlitri di tampone di carico 2X ai cinque microlitri di reazione cell-free diluita. Vortexare accuratamente e centrifugare i liquidi con una mini centrifuga. Posizionare i tubi da reazione su un blocco riscaldante e assicurarsi che i coperchi siano ben chiusi. Nel frattempo, trasferire il tampone di corsa nella camera di elettroforesi su gel. Dopo il riscaldamento, centrifugare i liquidi con una mini centrifuga. Dopo la centrifugazione, vortexare brevemente i tubi e ripetere l'operazione. Trasferire 15 microlitri di standard proteico e 10 microlitri di ciascun campione nei pozzetti e avviare l'elettroforesi. Estrarre con attenzione il gel dalla cassetta e fissarlo per 30 minuti. Successivamente, trasferire il gel nella soluzione di colorazione per 60 minuti. Dopo la colorazione, trasferire il gel nella soluzione di decolorazione per 60-120 minuti. Mescolare volumi uguali di tampone di legame his e la reazione cell-free, aspirando e dispensando ripetutamente la miscela. Successivamente, vortexare delicatamente il tubo. Assemblare il sistema della colonna. Vortexare accuratamente la soluzione stock del gel di affinità his finché la resina del gel non sia completamente disciolta. Utilizzando una punta da pipetta da un millilitro, trasferire 250 microlitri di resina del gel nella colonna. Centrifugare la colonna per cinque-dieci secondi a 13-15.000 ×g. Assicurarsi che la resina del gel sia completamente drenata, quindi trasferire 150-300 microlitri della miscela di reazione cell-free e tampone di legame his nella colonna. Centrifugare la colonna. Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna nel tubo di raccolta. Aggiungere 250 microlitri di tampone di lavaggio his, agitare e vortexare delicatamente la colonna per risospendere la resina del gel. Centrifugare il tubo della colonna. Scartare il tubo di raccolta e posizionare la colonna in un nuovo tubo da reazione standard da 1,5 millilitri. Aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione e risospendere la resina del gel agitando e vortexando delicatamente. Quindi centrifugare la colonna per diluire la proteina purificata nel tampone di eluizione. Rimuovere prima il tappo inferiore dalla colonna spin per filtrazione su gel, quindi togliere il tappo superiore. Posizionare la colonna in un tubo da lavaggio da due millilitri e centrifugare la colonna per rimuovere il tampone di conservazione del gel. Scartare il flusso passante, quindi aggiungere fino a 400 microlitri del tampone di conservazione delle proteine e centrifugare la colonna. Ripetere questo passaggio una volta in modo che l'intero tampone di conservazione delle proteine venga caricato nel gel. Posizionare la colonna in un tubo di raccolta nuovo e aggiungere con attenzione fino a 100 microlitri della soluzione della proteina modello purificata direttamente al centro del letto di gel. Centrifugare la colonna. Dopo lo scambio di tampone, posizionare i 100 microlitri completi della soluzione della proteina modello in un tubo aperto nel concentratore a vuoto rotante. Chiudere il coperchio del concentratore e avviare la rotazione a 30 gradi Celsius. Questo SDS-PAGE mostra l'incorporazione riuscita della L-canavanina, o Can, nella proteina bersaglio deGFP; la reazione cell-free di riferimento presenta il livello più alto di espressione di deGFP. La reazione cell-free con Can produce una concentrazione di deGFP leggermente inferiore, mentre nell'analisi del controllo negativo non viene rilevata alcuna espressione di deGFP. È stata eseguita un'analisi SDS-PAGE dopo la purificazione tramite his-tag e lo scambio di tampone delle molecole di deGFP espresse. HPLC

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