Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

L'obiettivo generale di questo esperimento è differenziare cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti con elevata efficienza e riproducibilità. Questo protocollo può essere ampliato in un biorreattore o modificato per linee cellulari che differenziano, le quali sono sensibili alla coltura di singole cellule. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella modellizzazione delle malattie cardiache utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte umane.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che è economica ed ha elevata efficienza, riproducibilità e applicabilità sia per cellule staminali embrionali umane che per cellule staminali pluripotenti indotte. Il nostro dimostratore di oggi è Hananeh Fonoudi, attualmente studentessa di dottorato presso l'Istituto di Ricerca Cardiaca Victor Chang, proveniente dall'Istituto Royan. Prima del rivestimento, utilizzare un pennello per la pulizia e acqua distillata per rimuovere accuratamente ogni traccia di polvere o residuo di coltura da un matraccio agitatore da 100 millilitri con pendolo di vetro.

Successivamente, riempire il pallone con etanolo al 70%. Dopo 30 minuti, sciacquare il pallone con acqua distillata e riempirlo con idrossido di sodio cinque molare. La mattina seguente, sciacquare il pallone sotto acqua corrente per cinque minuti e riempirlo con acido cloridrico uno molare.

Dopo 15 minuti, sciacquare il matraccio sotto acqua corrente per altri cinque minuti, seguiti da due risciacqui con acqua bidistillata. Posizionare il matraccio all'interno di una cappa a sicurezza biologica per farlo asciugare. Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di soluzione siliconante al matraccio e ruotare il matraccio orizzontalmente per ricoprire tutte le superfici con silicone.

Riscaldare il matraccio rivestito in un forno asciutto per un'ora a 100 gradi Celsius. Dopo che il matraccio si è raffreddato, sciacquarlo tre volte per 15 minuti con acqua deionizzata. Successivamente, sterilizzare il contenitore in autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti.

Dopo aver passato sferoidi indifferenziati utilizzando il metodo di passaggio cellulare singolo almeno tre volte, utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire tutti i sferoidi indifferenziati in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare le pozzette con un millilitro di mezzo per cellule staminali embrionali umane per raccogliere eventuali sferoidi residui e unire il lavaggio ai sferoidi raccolti. Lasciare sedimentare i sferoidi per cinque minuti in modo da formare un pellet lento.

Quindi, aspirare il soprannatante, avendo cura di non rimuovere alcun sferoide. Successivamente, risciacquare gli sfereoidi con un millilitro di PBS per cinque minuti e incubarli in 5 millilitri di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius. Dopo quattro o cinque minuti, arrestare la reazione con un millilitro di mezzo per cellule staminali embrionali umane e utilizzare una pipetta P1000 per dissociare gli sfereoidi in una sospensione di cellule singole.

Dopo il conteggio mediante esclusione del blu di tripano, risospendere le cellule a una concentrazione di 200.000 cellule per millilitro in mezzo condizionato integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base e inibitore di ROCK, quindi trasferire 100 millilitri della sospensione cellulare nel flacone del biorreattore siliconato. Posizionare il flacone sull'agitatore a 35 RPM. Dopo 24 ore, aumentare l'agitazione a 40 RPM.

Dopo 48 ore, interrompere l'agitazione per cinque-dieci minuti finché tutti gli sferoidi riformati non si saranno depositati sul fondo del fiasco, quindi sostituire metà del mezzo con mezzo condizionato integrato con fattore di crescita fibroblastico di base. Riavviare quindi l'agitatore a 40 RPM per altre 24 ore, sostituendo ogni giorno metà del mezzo mediante lo stesso procedimento, per i tre giorni successivi. Al quinto giorno, fermare l'agitatore per cinque-dieci minuti.

Successivamente, trasferire tutti gli sferoidi in un tubo da 50 millilitri con 50 millilitri di mezzo o meno. Scartare il mezzo rimanente nel flacone, avendo cura che nessuno sferoide rimanga nel recipiente. Quindi, rimuovere con attenzione il soprannatante dagli sferoidi sedimentati e lavare i cluster cellulari in 25 millilitri di PBS con calcio e magnesio.

Dopo cinque-dieci minuti, rimuovere la soluzione di lavaggio e risospendere gli sferoidi in 40 millilitri di mezzo RPMI-B27 integrato con inibitore della glicogeno sintasi chinasi-3, inibitore della ROCK e alcool polivinilico. Trasferire tutti gli sferoidi nuovamente nel flacone del biorreattore. Quindi, aggiungere mezzo RPMI-B27 fresco fino a un volume totale di 100 millilitri e riavviare l'agitazione a 40 giri al minuto.

Dopo 24 ore, seguire lo stesso procedimento per cambiare il mezzo con il mezzo RPMI-B27. Dopo ulteriori 24 ore, seguire lo stesso procedimento e cambiare il mezzo con RPMI-B27 aggiunto di IWP2, purmorphamina e SB43. Lasciare per 48 ore.

Il primo battito è solitamente osservato dopo sette giorni. Per la rapida differenziazione di linee di cellule staminali pluripotenti umane che non sono state adattate alla coltura di singole cellule, trattare per prima cosa una coltura di cellule staminali pluripotenti umane cresciuta su cellule di fibroblasti embrionali di topo e confluenti al 70-80% con 5 millilitri di soluzione di dissociazione per 30-60 secondi. La soluzione di dissociazione deve essere lasciata agire solo fino a quando le MEF assumono un aspetto arrotondato e i bordi delle colonie di hPSC diventano visibili.

Se le cellule vengono lasciate troppo a lungo, non si differenzieranno correttamente. Al momento opportuno, sostituire rapidamente la soluzione di dissociazione con 75 millilitri di collagenasi di tipo IV e incubare le cellule per cinque-quindici minuti a 37 gradi Celsius, controllando la coltura al microscopio ogni paio di minuti. Quando le colonie intere iniziano a staccarsi, sostituire la collagenasi con 1,5 millilitri di mezzo per cellule staminali embrionali umane e utilizzare una pipetta P1000 per staccare delicatamente le colonie cellulari intere dal fondo della piastra.

Le cellule devono essere staccate con attenzione in modo che le colonie non si frammentino in piccoli pezzi. Successivamente, utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e lavare le pozzette con un millilitro di mezzo per cellule staminali embrionali umane, raccogliendo tutte le cellule residue nel tubo da 15 millilitri. Dopo cinque minuti di sedimentazione, sostituire con attenzione il soprannatante con due millilitri di mezzo fresco per cellule staminali embrionali umane integrato con fattore di crescita fibroblastico di base.

Utilizzando una nuova pipetta da cinque millilitri, trasferire le cellule in una piastra a basso attaccamento, e incubare le colonie per sei-dodici ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire con attenzione gli aggregati coloniali in un nuovo tubo da 15 millilitri, e raccogliere eventuali aggregati rimanenti con un lavaggio in mezzo RPMI-B27. Dopo il deposito delle colonie, sostituire il sopranatante con mezzo RPMI-B27 fresco integrato con inibitore della glicogeno sintasi chinasi-3, e trasferire con attenzione le colonie in piastre rivestite con laminina per l'adesione a 37 gradi Celsius.

Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con mezzo RPMI-B27. Dopo ulteriori 24 ore, sostituire il mezzo con RPMI-B27 contenente IWP2, purmoramina e SB43. Il primo battito è solitamente osservato dopo sette giorni.

Fino ad oggi, il protocollo di differenziazione in sospensione statica è stato testato su cinque linee di cellule staminali embrionali umane e quattro linee di cellule staminali pluripotenti indotte umane, ottenendo più del 90% di sferoidi contrattili da ciascuna linea, dimostrando l'elevata riproducibilità di questo protocollo tra diverse linee di cellule staminali pluripotenti umane. I sferoidi in differenziazione mostrano un comportamento simile in un ambiente di biorreattore in sospensione agitata rispetto al sistema statico, con circa il 100% dei sferoidi osservati in contrazione al giorno 10. In effetti, sezioni di sferoidi contrattili raccolte al giorno 30 rivelano rispettivamente l'espressione citoplasmatica e nucleare della troponina T cardiaca e del fattore di trascrizione cardiaco NKX2.5.

Inoltre, quando gli sferoidi indifferenziati vengono sostituiti con aggregati cellulari indifferenziati, compaiono aggregati contrattili sette giorni dopo la differenziazione. Con 42 linee cellulari umane di cellule staminali pluripotenti indotte testate, si ottiene in media oltre il 60% di popolazioni cellulari positive per la troponina T cardiaca entro il giorno 15. Gli aggregati contrattili mostrano anche un'espressione citoplasmatica della troponina T cardiaca e nucleare di NKX2.5 simile a quella osservata negli sferoidi generati nel bioreattore a sospensione agitata.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di utilizzare cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) adattate alla coltura in singole cellule per almeno tre passaggi prima della differenziazione nel biorreattore. Questa procedura può essere combinata con altri metodi di arricchimento dei cardiomiociti per ottenere una popolazione cellulare pura. Questa tecnica ha aperto la strada alla commercializzazione dei cardiomiociti derivati da hPSC.

Ha un potenziale utilizzo in ambito clinico, farmaceutico, nell'ingegneria tissutale e nello sviluppo di organi o organoidi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come differenziare in modo efficiente cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti e di come ampliare la coltura in un biorreattore.