Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di differenziare le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti con elevata efficienza e riproducibilità. Questo protocollo può essere scalato in un bioreattore o modificato per differenziare linee cellulari sensibili alla coltura di singole cellule. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella modellazione delle malattie cardiache utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte umane.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che è economica e ha un'elevata efficienza, riproducibilità e applicabilità sia per le cellule staminali embrionali umane che per quelle pluripotenti indotte. La nostra dimostratrice di oggi è Hananeh Fonoudi, attualmente dottoranda presso il Victor Chang Cardiac Research Institute, che viene da noi dal Royan Institute. Prima del rivestimento, utilizzare una spazzola per la pulizia e acqua distillata per rimuovere accuratamente la polvere o i residui di coltura da un pallone da 100 millilitri con pendolo di vetro.

Quindi, riempi il pallone con etanolo al 70%. Dopo 30 minuti, sciacquare il pallone con acqua distillata e riempirlo con idrossido di sodio a cinque molari. La mattina dopo, sciacquare il flash sotto l'acqua corrente per cinque minuti e riempirlo con un molare di acido cloridrico.

Dopo 15 minuti, sciacquare il pallone sotto l'acqua corrente per altri cinque minuti, seguito da due risciacqui con acqua bidistillata. Mettere il pallone in una cabina di biosicurezza ad asciugare. Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di soluzione siliconizzante al pallone e ruotare il pallone orizzontalmente per coprire tutte le superfici con silicone.

Scaldare il pallone rivestito in forno asciutto per un'ora a 100 gradi Celsius. Quando il pallone si è raffreddato, sciacquarlo tre volte per 15 minuti con acqua deionizzata. Quindi, sterilizzare in autoclave il contenitore a 121 gradi Celsius per 20 minuti.

Dopo aver fatto passare gli sferoidi indifferenziati, utilizzando il metodo del passaggio a cella singola almeno tre volte, utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire tutti gli sferoidi indifferenziati in una provetta conica da 15 millilitri. Lavare i pozzetti con un millilitro di terreno di coltura di cellule staminali embrionali umane per raccogliere eventuali sferoidi rimanenti e unire il lavaggio con gli sferoidi raccolti. Lasciare sedimentare gli sferoidi per cinque minuti per formare una pallina sciolta.

Quindi, aspirare il surnatante, facendo attenzione a non rimuovere gli sferoidi. Successivamente, sciacquare gli sferoidi con un millilitro di PBS per cinque minuti e incubarli in 5 millilitri di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius. Dopo quattro o cinque minuti, interrompere la reazione con un millilitro di terreno di cellule staminali embrionali umane e utilizzare una pipetta P1000 per dissociare gli sferoidi in una singola sospensione cellulare.

Dopo aver contato per esclusione del blu di tripano, risospendere le cellule a una concentrazione di 200.000 cellule per millilitro, in terreno condizionato integrato con fattore di crescita basico dei fibroblasti e inibitore ROCK, e trasferire 100 millilitri della sospensione cellulare nel pallone del bioreattore siliconato. Posizionare il pallone sull'agitatore a 35 giri/min. Dopo 24 ore, aumentare l'agitazione a 40 giri/min.

Dopo 48 ore, interrompere l'agitazione per cinque-dieci minuti fino a quando tutti gli sferoidi riformati si sono depositati sul fondo del pallone e sostituire metà del terreno con un terreno condizionato integrato con un fattore di crescita basico dei fibroblasti. Quindi, riavviare l'agitatore a 40 giri/min per altre 24 ore, sostituendo metà del fluido con lo stesso processo ogni giorno per i successivi tre giorni. Il quinto giorno, arrestare l'agitatore per cinque-dieci minuti.

Quindi, trasferire tutti gli sferoidi in una provetta da 50 millilitri in 50 millilitri di terreno o meno. Scartare il terreno rimanente nel pallone, facendo attenzione che non rimangano sferoidi nel recipiente. Quindi, rimuovere con cura il surnatante dagli sferoidi depositati e lavare i gruppi cellulari in 25 millilitri di PBS con calcio e magnesio.

Dopo cinque-dieci minuti, rimuovere il lavaggio e risospendere gli sferoidi in 40 millilitri di terreno RPMI-B27 integrato con inibitore della glicogeno sintasi chinasi-3, inibitore ROCK e alcol polivinilico. Trasferire tutti gli sferoidi nel pallone del bioreattore. Quindi, aggiungere il terreno RPMI-B27 fresco fino a un volume totale di 100 millilitri e riavviare l'agitazione a 40 giri/min.

Dopo 24 ore, seguire la stessa procedura per cambiare il supporto dal supporto RPMI-B27. Dopo altre 24 ore, seguire la stessa procedura e sostituire il supporto con RPMI-B27 più IWP2, purmorfemina e SB43. Lasciare agire per 48 ore.

Il primo battito si osserva di solito dopo sette giorni. Per la differenziazione rapida di linee di cellule staminali pluripotenti umane che non sono state adattate alla coltura di singole cellule, trattare prima con una coltura di cellule staminali pluripotenti umane confluenti al 70-80%, coltivate su cellule di fibroblasti embrionali di topo, con 5 millilitri di soluzione di dissociazione per 30-60 secondi. La soluzione di dissociazione deve essere lasciata solo fino a quando i MEF non si arrotondano e i bordi della colonia di hPSC diventano chiari.

Se le cellule vengono lasciate troppo a lungo, non si differenzieranno correttamente. Al momento opportuno, sostituire rapidamente la soluzione di dissociazione con 75 millilitri di collagenasi di tipo IV e incubare le cellule per 5-15 minuti a 37 gradi Celsius, controllando la coltura al microscopio ogni pochi minuti. Quando le colonie intere iniziano a staccarsi, sostituire la collagenasi con 1,5 millilitri di terreno di cellule staminali embrionali umane e utilizzare una pipetta P1000 per staccare delicatamente le colonie di cellule intere dal fondo della piastra.

Le cellule devono essere staccate con cura in modo che le colonie non si rompano in piccoli pezzi. Quindi, utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri e lavare i pozzetti con un millilitro di terreno di cellule staminali embrionali umane, raggruppando le cellule rimanenti nella provetta da 15 millilitri. Dopo cinque minuti di sedimentazione, sostituire con cura il surnatante con due millilitri di terreno di cellule staminali embrionali umane fresche integrate con il fattore di crescita basico dei fibroblasti.

Utilizzando una nuova pipetta da cinque millilitri, trasferire le cellule in una piastra di attacco ultra-bassa e incubare le colonie per sei-12 ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire con cura gli aggregati di colonia in una nuova provetta da 15 millilitri e raccogliere gli aggregati rimanenti con un lavaggio medio RPMI-B27. Quando le colonie si sono stabilizzate, sostituire il surnatante con un terreno RPMI-B27 fresco integrato con l'inibitore della glicogeno sintasi chinasi-3 e trasferire con cura le colonie su piastre rivestite di laminina per l'attacco a 37 gradi Celsius.

Dopo 24 ore, sostituire il supporto con il supporto RPMI-B27. Dopo altre 24 ore, sostituire il mezzo con RPMI-B27 contenente IWP2, purmorfemina e SB43. Il primo battito si osserva di solito dopo sette giorni.

Ad oggi, il protocollo di differenziazione statica in sospensione è stato testato su cinque linee di cellule staminali embrionali umane e quattro linee di cellule staminali pluripotenti indotte umane con conseguente battitura di oltre il 90% di sferoidi da ciascuna linea, dimostrando l'elevata riproducibilità di questo protocollo tra diverse linee di cellule staminali pluripotenti umane. Gli sferoidi differenzianti mostrano un comportamento simile in un ambiente di bioreattore in sospensione agitata come nel sistema statico, con circa il 100% degli sferoidi osservati in battuta, al giorno 10. Infatti, le sezioni sferoidi di battimento raccolte al giorno 30 rivelano l'espressione citoplasmatica e nucleare rispettivamente della troponina T cardiaca e del fattore di trascrizione cardiaco NKX2.5.

Inoltre, quando gli sferoidi indifferenziati vengono sostituiti con aggregati cellulari indifferenziati, i cluster battenti compaiono sette giorni dopo la differenziazione. Con 42 linee di cellule staminali pluripotenti indotte umane testate che hanno generato in media oltre il 60% di popolazioni di cellule T positive alla troponina cardiaca entro il giorno 15. I cluster di battimento dimostrano anche un'espressione citoplasmatica della troponina T cardiaca e di NKX2.5 simile a quella osservata per gli sferoidi generati dal bioreattore in sospensione agitata.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare hPSC che sono state adattate alla coltura di singole cellule per almeno tre passaggi prima del differenziamento nel bioreattore. Questa procedura può essere combinata con altri metodi per arricchire i cardiomiociti per acquisire una popolazione pura di cellule. Questa tecnica ha aperto la strada alla commercializzazione di cardiomiociti derivati da hPSC.

Ha il potenziale per l'uso in applicazioni cliniche, farmaceutiche, di ingegneria tissutale e di sviluppo di organi o organoidi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come differenziare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti e di aumentare la coltura nel bioreattore.