Name: Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine 27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri l'interferenza RNA per studiare il ruolo di HSP27 nella guarigione delle ferite epiteliali corneali. Questo metodo consente di valutare la funzione proteica in cellule epiteliali umane.

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Questo studio è stato sostenuto dalla Student Research Grant (13-14) dell&#39;Università di Ulsan College of Medicine, Seoul, Corea e una borsa di studio (2014-464) presso l&#39;Istituto di Scienze della Vita Asan, Seoul, Corea.

1. Cell Line <ol><li> Culture 10 6 umani corneali cellule epiteliali telomerasi-immortalata (HCECs) in un 6-pozzetti (densità: 1039,9 cellule / mm 2) in un incubatore a 37 ° con un&#39;atmosfera 5% di CO 2 con terreno di crescita dell&#39;epitelio bronchiale (BEGM) fino raggiungono il 95% di confluenza. </li></ol> 2. Analisi Western Blot dopo aver creato epiteliali Ferite Scratch <ol><li> Streak uno sterile 200 ml punta della pipetta sulla superficie di un pozzo di confluenti HCECs coltivate quattro volte al piatto in un armadio di sicurezza biologica (Classe II, Tipo A2) e incubare HCECs separatamente in un incubatore a 37 ° con un CO 2 atmosfera 5% per 1, 5, 10, 30, 60 e 120 min. </li><li> Utilizzare una piastra da 6 pozzetti per sei campioni differenti a seconda del tempo di incubazione dopo corneale ferimento epiteliale. </li><li> Lavare feriti monostrati HCEC tre volte con PBS 1x e quindi aggiungere 2,0 ml BEGM in ogni pozzetto. </li><li> Staccare HCECs utilizzando 2ml 0,25% di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) per pozzetto per 5 minuti, centrifugare a 900 xg per 5 minuti in una provetta da 15 ml, e aspirare tripsina-EDTA con una pipetta 1 ml. </li><li> Sospendere HCECs con 1 ml di PBS 1x e trasferirli in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Centrifuga HCECs a 10.000 xg per 15 sec e aspirare 1x PBS utilizzando una pipetta 1 ml. </li><li> Risospendere HCECs in 100 microlitri tampone di lisi ghiacciata (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro [PMSF], inibitori della proteasi [1 micron pepstatina A, 1 pM leupeptina, e 0,1 pM aprotinina] e 0,5% Triton X-100 [pH 7]) e mescolare bene. </li><li> Incubare le cellule per 30 min in ghiaccio per indurre lisi cellulare. </li><li> lisati centrifugare a 4 ° C a 10.000 xg per 15 minuti, e poi il trasferimento a surnatanti freschi provette da 1,5 ml (90 aliquote microlitri) e conservarli a -80 ° C. </li><li> Determinare le concentrazioni di proteine ​​totali di lisati cellulari che utilizzano il pr Bradfordsaggio otein. 9 </li><li> Carico 30 mg proteine ​​cellulari totali in un gel di acrilammide 10% o 12% di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel (SDS-PAGE) e quindi elettroforesi trasferimento separate bande proteiche filtri di nitrocellulosa con una corrente di 200 mA per 1 ora a 4 ° C da utilizzare in saggi di Western blot. </li><li> Blocco di nitrocellulosa membrane filtranti con il 5% di latte scremato in soluzione salina Tris tamponata con Tween 20 (TBST) per 1 ora, aggiungere anticorpi policlonali di coniglio primaria contro i non-fosforilata HSP27 (1: 1.000 diluizione) o primaria anticorpo policlonale di coniglio contro fosforilata HSP27 (1 : 1.000 diluizione) in 5% di albumina di siero bovino (BSA), e incubare le membrane notte a 4 ° C su un agitatore. </li><li> Rileva bande immunoreattive con rafano anticorpi di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi (1: 10.000) diluizione in 5% di BSA dopo il lavaggio per 10 minuti 3 volte con TBST. </li><li> Incubare la membrana nei reagenti luminol Western blotting (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membrane) per 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la membrana dalla soluzione del reagente, rimuovere il liquido in eccesso con un panno assorbente, e posto in un protettore foglio di plastica. </li><li> Lavorare in una stanza buia con una luce di sicurezza, posizionare la membrana ricoperta di una cassetta pellicola con il lato rivolto verso l&#39;alto di proteine. </li><li> Posizionare pellicola a raggi X in cima a membrana ed esporre per 1 min. </li></ol> 3. siRNA Transfection Assay 10 <ol><li> HCECs Culture a 5 × 10 5 cellule / pozzetto in una piastra da 6 pozzetti in un incubatore a 37 ° con un&#39;atmosfera 5% CO 2 utilizzando BEGM fino a raggiungere il 95% di confluenza. </li><li> Diluire il reagente di trasfezione (2.5 o 7.5 ml) con 100 ml riduzione media siero per trasfezione (il fattore di diluizione è 41 o 14.3) e sciogliere il HSP27-specifica e strapazzate controllo siRNA in 100 ml di medio siero ridotto per creare 10 o 50 nm di specifici HSP27 e si arrampicò di controllo siRNA. </li><li> Mescolare 100 μ; L soluzione siRNA con 100 microlitri di reagente diluito trasfezione (rapporto 1: 1) e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere i complessi siRNA-lipidi alle cellule. Poi, dopo 4 mezzi di modifica ore per completare BEGM e incubare le cellule per 2 giorni a 37 ° C. </li><li> Analizzare le cellule trasfettate mediante western blotting, come descritto dalle sezioni da 4.1 a 4.7. </li></ol> 4. Western Blot test per celle siRNA-trasfettate 11 <ol><li> Estrarre specifici HSP27 e strapazzate controllo HCECs siRNA-trasfettate in una cappa di sicurezza biologica con 100 microlitri tampone di lisi ghiacciata (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), inibitori della proteasi, e 0,5% Triton X-100, pH 7). </li><li> Incubare le cellule per 30 min in ghiaccio per indurre lisi cellulare. </li><li> lisati pellet a 10.000 xg per 15 minuti e poi trasferire surnatanti di fresco 1,5 ml vascaes (90 microlitri aliquote) e conservarli a -80 ° C. </li><li> Determinare le concentrazioni di proteine dei lisati cellulari che utilizzano il Metodo di Bradford. 9 </li><li> Caricare i campioni con la stessa quantità di proteine ​​cellulari totali su un gel di acrilammide 10% o 12%, sottopongono il gel di SDS-PAGE, e trasferire elettroforeticamente le bande proteiche separate su filtri di nitrocellulosa con una corrente di 200 mA per 1 ora a 4 ° C a utilizzare nei test Western blot. </li><li> Blocco membrane filtranti di nitrocellulosa con 5% di latte scremato in soluzione salina Tris tamponata con Tween 20 (TBST) per 1 ora, aggiungere anticorpi primari contro fosforilata e non fosforilata HSP27 (1: 1000 diluizione), fosforilata Akt (1: 1000 diluizione), non fosforilata Akt (1: 1000 diluizione, usato come marcatore sopravvivenza cellulare), Bcl-2 associata X proteina (1: 1000 diluizione, usato come una proteina pro-apoptotica) e gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 1 : 200 diluizione, usato come controllo di carico) in 5% di albumina di siero bovino (BSA), eincubare le membrane notte a 4 ° C su un agitatore. </li><li> Rileva bande immunoreattive con rafano anticorpi di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi (1: 10.000) diluizione in 5% di BSA dopo il lavaggio 3 volte con TBST, 10 minuti ogni lavaggio. </li><li> Incubare la membrana nei reagenti luminol Western blotting (6-7 ml per 10 cm cm x 5 cm membrane) per 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la membrana dalla soluzione del reagente, rimuovere il liquido in eccesso con un panno assorbente, e posto in un protettore foglio di plastica. </li><li> Lavorando in una stanza buia con una luce di sicurezza, posizionare la membrana coperto in una cassetta pellicola con il lato rivolto verso l&#39;alto proteine. </li><li> Posizionare pellicola per raggi X sulla parte superiore della membrana ed esporre per 1 min. </li></ol> 5. Scratch-indotta direzionale Ferimento test di valutazione della migrazione delle cellule 12 <ol><li> In una cappa di sicurezza biologica, fare una ferita trascinando una punta di pipetta sterile attraverso la superficie di un pozzo di culture confluenti dispecifici HSP27 siRNA-trasfettate o HCECs siRNA-trasfettate controllo strapazzate. </li><li> Subito dopo il ferimento, lavare le cellule due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS) e mantenerli nelle culture BEGM in un incubatore a 37 ° con un CO 2 atmosfera 5% per 24 ore dopo il ferimento. </li><li> Fotografare immagini HCEC utilizzando un microscopio in posizione verticale a ingrandimento 100X 24 ore dopo il ferimento ed eseguire sfondo appiattimento utilizzando il filtro comando nel software di analisi delle immagini. </li><li> Utilizzando il comando SELECT Misure, definire l&#39;area di interesse (AOI), con la stessa forma poligonale dimensioni che possono coprire perpendicolarmente da un capo all&#39;altro della ferita iniziale, e determinare tre diversi AOI nella zona ferita di ciascun campione. </li><li> contare automaticamente il numero di cellule in ogni campo usando il conteggio / Dimensioni opzioni di menu Misura. </li></ol> 6. flusso Analisi Citometria di Apoptosis <ol><li> Cultura HSP27-specifici siRNA-trasfettate e controllo sHCECs contenenti ciascuna 10 nM siRNA iRNA-trasfettate ad una concentrazione di 5 x 10 5 cellule / pozzetto in piastre da 6 pozzetti fino a quando le cellule raggiungono il 95% di confluenza in un incubatore a 37 ° con CO 2 atmosphere 5% in BEGM. </li><li> Sfilare HCECs utilizzando 2 ml 0,25% tripsina-EDTA per pozzetto per 5 minuti, centrifugare a 900 xg per 5 minuti in una provetta da 15 ml, e aspirare tripsina-EDTA con una pipetta 1 ml. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS freddo e risospendere le cellule in 1x tampone (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1.4 M NaCl, e 25 mM CaCl 2) rilegatura ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml. </li><li> Trasferire 100 microlitri sospensione cellulare (1 x 10 5 cellule) in una provetta 5 ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di fluoresceina isotiocianato coniugato annessina V e 5 ml ioduro di propidio. </li><li> Delicatamente vortice le cellule e incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio. </li><li> Aggiungere 200 ml di 1x tampone di legame a ciascuna provetta e analizzare le cellule da un flusso cytometer entro 1 ora. </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari o esclusive in qualunque materiale o metodi citati in questo studio.

In questo studio, abbiamo valutato il potenziale ruolo di HSP27 nel wounding epiteliale corneale utilizzando approcci in vitro . I passaggi critici hanno riguardato la trasfezione di siRNA per il knock-down di HSP27 per osservare la funzione di HSP27 nelle cellule sottoposte a stress. In particolare, un ruolo per HSP27 è stato rivelato da questi esperimenti nella migrazione delle cellule epiteliali e nell'apoptosi durante la guarigione delle ferite epiteliali corneali. A differenza degli studi precedenti10<...

Corneali cellule epiteliali (PEC) sono continuamente capannone in film lacrimale, mentre sono allo stesso tempo sostituite da cellule del limbus e corneali strati basali epiteliali. 1 vari fattori di stress estrinseci possono indurre l&#39;apoptosi e desquamazione della CEC. 2 Le proteine da shock termico (HSP) sono altamente conservati e possono essere suddivisi in due famiglie secondo dimensione molecolare. 3 la più grande famiglia HSP comprende HSP90, HSP70 e HSP60, e la famiglia più piccola comprende HSP27. 4 la fosforilazione di HSP27 è noto a svolgere un ruolo importante nella sopravvivenza cellulare ed è necessario per la migrazione delle cellule a causa del ruolo di questa proteina in actina rimodellamento. 5-7 Pertanto, abbiamo cercato di verificare il ruolo potenziale di HSP27 fosforilazione nella migrazione CEC e l&#39;apoptosi in un modello in vitro di cellule epiteliali guarigione della ferita. RNA interference (RNAi) utilizzando sia piccoli o brevi RNA interferenti (siRNA) ha geinteressi nerated sia in biologia di base e applicata, in quanto consente potenzialmente l&#39;espressione di un gene di interesse da abbattuto. 8 In questo, abbiamo usato specifici siRNA-HSP27 per valutare il contributo di HSP27 a CEC guarigione della ferita e l&#39;apoptosi. i metodi tradizionali per RNAi gene knock-down in cellule utilizzano duplex RNA sintetici, tra cui due non modificati oligonucleotidi 21-mer che possono essere assemblati per creare siRNA. La RNAi siRNA che abbiamo usato in questo studio è un metodo semplice e molto efficace trasfezione le cellule, e questo reagente funziona con varie linee cellulari immortalizzate. In questo studio, abbiamo dimostrato i metodi utilizzati per questa analisi, tra cui un saggio di zero-indotta ferita direzionale, western blotting, saggio di transfezione siRNA, test di immunofluorescenza e citometria a flusso.

<table><tbody><tr><td>Cabina di sicurezza biologica</td><td>CHC LAB Co., Ltd,&nbsp; Daejeon, Repubblica di Corea&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>Classe II, Tipo A2&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>RNAi siRNA; siRNA di controllo criptato e siRNA specifico per HSP27</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>Terreno di crescita dell'epitelio bronchiale</td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>P8340, P7626</td><td>1 &#956; M Pepstatina A, 1 &#956; M Leupeptina, 0,1 &#956; M Saggio</td></tr> delle proteine di Bradford con aprotina<tr><td>&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>#500-0001</td><td>Saggio delle proteine di Bradford&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtri nitrocellulosici&nbsp;</td><td>Amersham, Little Chalfont, Regno Unito</td><td>RPN3032D</td><td>Membrana di blotting</td></tr><tr><td>occidentale HSP27 non fosforilata</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351</td><td>Diluizione 1:1.000 (HSP27 totale)</td></tr><tr><td>HSP27 fosforilata (Ser85)</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594</td><td>Diluizione 1:1.000 HSP27 è stata fosforilata a Ser85</td></tr><tr><td>Lipofectamina&reg; Reagente RNAiMAX&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Akt fosforilato (Ser473)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA</td><td>n. 4060</td><td>Diluizione 1:1.000 Akt è stato fosforilato a Ser473 (marcatore di sopravvivenza cellulare)</td></tr><tr><td>Akt non fosforilato</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>n. 4061</td><td>Diluizione 1:1.000 (Total Akt)</td></tr><tr><td>Proteina X associata a Bcl-2&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>No. 4062</td><td>1:1.000 (marcatore proteico anti-apoptotico)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>No. 4063</td><td>1:1.000 marcatore di controllo del carico (gene housekeeping)</td></tr><tr><td>Anticorpi anti-coniglio di capra coniugati con perossidasi di rafano</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>31985</td><td>terreno sierico ridotto per trasfezione</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Olympus, Inc., Tokyo, Giappone</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germania</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a sei pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td> Piastra di coltura a 24 <td>pozzetti di diametro 35,00 mm / pozzetto</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>N-Bioteck, Inc., Seoul, Corea del Sud</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td> Pellicola a raggi X per <td>citometria a flusso</td></tr><tr><td></td><td>Kodak, Rochester, NY</td><td></td><td>Cassetta a raggi X medica con schermo verde 400</td></tr><tr><td>reagente luminol western blotting</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rilevamento dell'apoptosi dell'annessina V FITC I</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

indagine basata rna interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Il piccolo RNA interferente (siRNA) è tra i metodi di interferenza dell'RNA più utilizzati per il silenziamento a breve termine di geni codificanti proteine. siRNA è un duplex di RNA sintetico creato per colpire specificamente un trascritto di mRNA per indurne la degradazione ed è stato utilizzato per identificare nuovi percorsi in vari processi cellulari. Esistono pochi studi sul ruolo della proteina da shock termico fosforilata 27 (HSP27) nella guarigione delle ferite epiteliali corneali. In questo caso, le cellule epiteliali corneali umane in coltura sono state suddivise in un gruppo trasfettato con siRNA di controllo criptato e in un gruppo trasfettato con siRNA specifico per HSP27. Sono stati quindi eseguiti saggi di ferita direzionale indotta da graffio, western blotting e citometria a flusso. Concludiamo che HSP27 ha un ruolo nella guarigione delle ferite epiteliali corneali che può comportare l'apoptosi e la migrazione delle cellule epiteliali. Qui vengono fornite descrizioni dettagliate della preparazione del campione e del protocollo di studio.

L&#39;espressione di HSP27 fosforilata significativamente aumentata a 5, 10, e 30 minuti dopo il ferimento zero confrontato con HCECs illesi 13. Analisi Western Blot ha rivelato che l&#39;espressione di HSP27 fosforilata e fosforilata Akt sono stati entrambi significativamente ridotto, mentre l&#39;espressione di Bax era significativamente aumentata in HCECs siRNA-trasfettate specifici Hsp27 (Figura 1A-E). L&#39;espressione HSP27 fosforilata è stato ridotto de...

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare il piccolo RNA interferente specifico della proteina da shock termico 27 (HSP27) per valutare la funzione di HSP27 durante la guarigione delle ferite epiteliali corneali. L'interferenza dell'RNA è il metodo migliore per abbattere efficacemente l'espressione genica per studiare la funzione delle proteine in vari tipi di cellule.

Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

L'obiettivo generale di questo saggio di trasfezione dell'RNA è utilizzare un RNA interferente specifico per HSP27 per valutare il potenziale ruolo di HSP27 nella riparazione delle ferite dell'epitelio corneale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo alla funzione della proteina da shock termico 27 durante il processo di guarigione delle ferite epiteliali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'RNA interferente è un RNA sensibile al saccarosio progettato specificamente per bersagliare un trascritto di RNA messaggero e indurne la degradazione.È stato utilizzato per identificare nuovi fattori implicati in vari processi cellulari. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sul processo di guarigione della ferita nell'epitelio corneale, potrebbe essere applicata anche a un altro sistema, come la pelle e la mucosa. La procedura sarà dimostrata da Soon-Suk Kang, un tecnico del mio laboratorio.Per iniziare questa procedura, coltivare cellule epiteliali corneali umane in una piastra a sei pozzetti con mezzo di crescita per epitelio bronchiale a 37 gradi Celsius e cinque percento di anidride carbonica fino al raggiungimento di una conflu

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Un esempio di terapia genica adenovirale nelle cornee umane in coltura di organi diabetici viene presentato verso la normalizzazione della guarigione ritardata delle ferite e l'espressione marcatamente ridotta dei marcatori delle cellule staminali epiteliali in queste cornee. Descrive anche l'ottimizzazione di questo processo in colture epiteliali limbari arricchite con cellule staminali.

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

Screening RNA inibitorio piccolo su vasta scala è uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida dei modelli di esposizione e dei metodi per lo screening di elevato throughput di indotta da acido fluoridrico e cloropicrina lesioni epiteliali cornea.

High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico

Questo protocollo descrive un metodo per infliggere un'abrasione sulla superficie oculare del mouse e a seguire da allora in poi il processo di cicatrizzazione. Il protocollo si avvale di un oculare burr parzialmente rimuovere l'epitelio di superficie dell'occhio nei topi anestetizzati.

Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto delle malattie.

Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali

Qui, vengono sviluppati modelli animali basati su topo e coniglio per il danno meccanico e chimico dell'epitelio corneale per lo screening di nuove terapie e del meccanismo sottostante.

Modelli animali ex vivo e in vivo per lesioni meccaniche e chimiche dell'epitelio corneale

Il presente protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. Le cornee rigeneranti o completamente restaurate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari seguendo la procedura di ferita.

Studiare la rigenerazione dei tessuti senza cicatrici nelle cornee embrionali dei pulcini feriti

Questo protocollo si concentra sul danneggiamento della superficie oculare del pesce zebra attraverso l'abrasione per valutare la successiva chiusura della ferita a livello cellulare. Questo approccio sfrutta una bava oculare per rimuovere parzialmente l'epitelio corneale e utilizza la microscopia elettronica a scansione per tracciare i cambiamenti nella morfologia cellulare durante la chiusura della ferita.

Zebrafish Corneal Wound Healing: dall'abrasione all'analisi di imaging della chiusura della ferita

Il presente lavoro descrive un nuovo protocollo sperimentale che utilizza un supporto stampato in 3D per consentire l'imaging di cellule vive ad alta risoluzione di globi enucleati. Attraverso questo protocollo, l'attività di segnalazione del calcio cellulare nell'epitelio corneale ferito da globi ex vivo può essere osservata in tempo reale.

Imaging di cellule vive di globi ex vivo intatti utilizzando un nuovo supporto stampato in 3D

Abbiamo sviluppato un modello di ratto di grave infiammazione corneale attraverso il curettage dell'epitelio corneale combinato con suture corneali. Lo studio ha valutato i modelli di infiammazione corneale, la proliferazione epiteliale e i cambiamenti nelle cellule staminali limbari in condizioni infiammatorie.

Definizione di un modello di grave infiammazione corneale nei ratti basato sul curettage dell'epitelio corneale combinato con suture corneali

La coltura di organi corneali suini ex vivo e la guarigione delle ferite epiteliali forniscono un mezzo economico, etico, riproducibile e quantitativo per testare la tossicità oculare delle sostanze chimiche. Aiutano anche a chiarire i meccanismi alla base della regolazione dell'epitelizzazione e della riparazione dei tessuti e a valutare le terapie per il trattamento della cheratopatia diabetica e della guarigione ritardata delle ferite.

Valutazione della tossicità terapeutica e chimica mediante cornee suine coltivate in organo e guarigione delle ferite epiteliali

Scopri l'interferenza RNA per studiare il ruolo di HSP27 nella guarigione delle ferite epiteliali corneali. Questo metodo consente di valutare la funzione proteica in cellule epiteliali umane.

Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale (Video) | JoVE Journal

Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

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