Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

L'obiettivo generale di questo saggio di trasfezione dell'RNA è utilizzare un RNA interferente specifico per HSP27 per valutare il potenziale ruolo di HSP27 nella riparazione delle ferite dell'epitelio corneale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo alla funzione della proteina da shock termico 27 durante il processo di guarigione delle ferite epiteliali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'RNA interferente è un RNA sensibile al saccarosio progettato specificamente per bersagliare un trascritto di RNA messaggero e indurne la degradazione.

È stato utilizzato per identificare nuovi fattori implicati in vari processi cellulari. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sul processo di guarigione della ferita nell'epitelio corneale, potrebbe essere applicata anche a un altro sistema, come la pelle e la mucosa. La procedura sarà dimostrata da Soon-Suk Kang, un tecnico del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, coltivare cellule epiteliali corneali umane in una piastra a sei pozzetti con mezzo di crescita per epitelio bronchiale a 37 gradi Celsius e cinque percento di anidride carbonica fino al raggiungimento di una confluenza del 95 percento. Successivamente, diluire 2,5 microlitri o 7,5 microlitri del reagente di trasfezione con 100 microlitri di mezzo con siero ridotto per la trasfezione. Quindi, sciogliere siRNA specifico per HSP27 e siRNA di controllo randomizzato in 100 microlitri di mezzo con siero ridotto per ottenere rispettivamente 10 nanomolari di siRNA specifico per HSP27 e 15 nanomolari di siRNA di controllo randomizzato.

In seguito, mescolare 100 microlitri di soluzione di siRNA con 100 microlitri di reagente di trasfezione diluito e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere i complessi lipidici di siRNA alle cellule. Dopo un'incubazione di quattro ore, sostituire il mezzo con il mezzo completo per la crescita dell'epitelio bronchiale e incubare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius prima dell'analisi mediante western blot.

In questo passaggio, estrarre le HCEC trasfettate con siRNA specifico per HSP27 e siRNA di controllo randomizzato in una cappa a sicurezza biologica utilizzando 100 microlitri di tampone di lisi freddo. Successivamente, incubare le cellule per 30 minuti sul ghiaccio per indurre la lisi cellulare. Poi, centrifugare i lisati a 10.000 ×g per 15 minuti.

Successivamente, trasferire i soprannatanti in nuove provette da 1,5 millilitri e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Dopodiché, determinare le concentrazioni proteiche dei lisati cellulari utilizzando il saggio proteico di Bradford. Quindi, caricare i campioni con quantità uguali di proteine cellulari totali su un gel di acrilamide al 10 percento o al 12 percento.

Sottoporre il gel a elettroforesi SDS-PAGE e trasferire elettroforeticamente le bande proteiche separate sui filtri di nitrocellulosa con una corrente di 200 milliampere per un'ora a quattro gradi Celsius. Successivamente, bloccare le membrane di nitrocellulosa con il cinque percento di latte scremato in TBST per un'ora. Quindi aggiungere gli anticorpi primari e incubare le membrane tutta la notte a quattro gradi Celsius su un agitatore.

Il giorno successivo, lavare le membrane tre volte con TBST, consentendo dieci minuti per ogni lavaggio. Quindi rivelare le bande immunoreattive utilizzando anticorpi di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano in BSA al cinque percento. Successivamente, incubare le membrane nei reagenti luminol per il western blotting per un minuto a temperatura ambiente.

Rimuovere la membrana dalla soluzione del reagente. Successivamente, asportare il liquido in eccesso con un panno assorbente e posizionarla in una bustina di plastica protettiva. In seguito, inserire la membrana protetta in una cassetta per pellicole con il lato proteico rivolto verso l'alto.

Posizionare un film a raggi X sopra le membrane ed esporlo per un minuto. All'interno di una cappa a sicurezza biologica, creare una ferita trascinando una punta di pipetta sterile attraverso colture confluenti di HCEC trasfettate con siRNA specifico per HSP27 o siRNA di controllo randomizzato. Subito dopo la ferita, lavare le cellule due volte con PBS 1X e mantenerle in mezzo di crescita per epitelio bronchiale a 37 gradi Celsius e cinque percento di anidride carbonica per 24 ore.

24 ore dopo la ferita, acquisire l'immagine delle HCEC utilizzando un microscopio verticale a 100x ed eseguire l'appiattimento dello sfondo mediante il comando filtro nel software di analisi delle immagini. Utilizzando il comando seleziona misurazioni, definire l'area di interesse con una forma poligonale delle stesse dimensioni, in grado di coprire perpendicolarmente la ferita iniziale da un'estremità all'altra. Successivamente, determinare tre diverse aree di interesse nella zona ferita di ciascun campione.

Contare automaticamente il numero di cellule in ogni campo utilizzando l'opzione del menu misura dimensione conteggio. L'analisi di Western blot mostrata qui ha rivelato che l'espressione di HSP27 fosforilata e di Akt fosforilata era significativamente ridotta. Mentre l'espressione di backs era significativamente aumentata nelle HCEC trasfettate con siRNA specifico per HSP27.

L'espressione di HSP27 fosforilata è stata ridotta del 30 percento e del 40 percento rispettivamente in cellule trasfettate con siRNA specifico per HSP27 a 10 nanomolar e 15 nanomolar, rispetto alle cellule trasfettate con siRNA di controllo. Inoltre, l'espressione di HSP27 non fosforilata è stata ridotta del 20 percento e del 30 percento rispettivamente in cellule trasfettate con siRNA specifico per HSP27 a dieci nanomolar e 15 nanomolar. Il saggio del ferita direzionale indotto da graffio ha indicato che 24 ore dopo la ferita, le cellule trasfettate con siRNA specifico per HSP27 a 10 e 15 nanomolar hanno mostrato una migrazione ridotta.

Inoltre, le HCEC trasfettate con siRNA specifico per HSP27 hanno subito una maggiore morte cellulare apoptotica e necrotica rispetto alle cellule trasfettate con siRNA di controllo scrambled, come mostrato dalla citometria a flusso. Una volta padroneggiata, la tecnica di trasfezione dell'RNA può essere eseguita in 24 ore se effettuata correttamente. Seguendo queste procedure, è possibile indurre un episodio simile al blocco della bocca al fine di rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio la funzione iniziale della Heat Shock Protein 27 nella riparazione delle ferite dell'epitelio corneale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un RNA interferente specifico per la Heat Shock Protein 27 per valutare il potenziale ruolo della Heat Shock Protein 27 nella guarigione delle ferite epiteliali della cornea. Non dimenticare che lavorare con RNA interferenti e reagenti può essere pericoloso e che dispositivi di protezione come una cappa a sicurezza biologica e una maschera protettiva devono essere sempre utilizzati durante l'esecuzione di queste procedure.