Name: Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine 27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri l'interferenza RNA per studiare il ruolo di HSP27 nella guarigione delle ferite epiteliali corneali. Questo metodo consente di valutare la funzione proteica in cellule epiteliali umane.

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Questo studio è stato sostenuto dalla Student Research Grant (13-14) dell&#39;Università di Ulsan College of Medicine, Seoul, Corea e una borsa di studio (2014-464) presso l&#39;Istituto di Scienze della Vita Asan, Seoul, Corea.

1. Cell Line <ol><li> Culture 10 6 umani corneali cellule epiteliali telomerasi-immortalata (HCECs) in un 6-pozzetti (densità: 1039,9 cellule / mm 2) in un incubatore a 37 ° con un&#39;atmosfera 5% di CO 2 con terreno di crescita dell&#39;epitelio bronchiale (BEGM) fino raggiungono il 95% di confluenza. </li></ol> 2. Analisi Western Blot dopo aver creato epiteliali Ferite Scratch <ol><li> Streak uno sterile 200 ml punta della pipetta sulla superficie di un pozzo di confluenti HCECs coltivate quattro volte al piatto in un armadio di sicurezza biologica (Classe II, Tipo A2) e incubare HCECs separatamente in un incubatore a 37 ° con un CO 2 atmosfera 5% per 1, 5, 10, 30, 60 e 120 min. </li><li> Utilizzare una piastra da 6 pozzetti per sei campioni differenti a seconda del tempo di incubazione dopo corneale ferimento epiteliale. </li><li> Lavare feriti monostrati HCEC tre volte con PBS 1x e quindi aggiungere 2,0 ml BEGM in ogni pozzetto. </li><li> Staccare HCECs utilizzando 2ml 0,25% di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) per pozzetto per 5 minuti, centrifugare a 900 xg per 5 minuti in una provetta da 15 ml, e aspirare tripsina-EDTA con una pipetta 1 ml. </li><li> Sospendere HCECs con 1 ml di PBS 1x e trasferirli in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Centrifuga HCECs a 10.000 xg per 15 sec e aspirare 1x PBS utilizzando una pipetta 1 ml. </li><li> Risospendere HCECs in 100 microlitri tampone di lisi ghiacciata (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro [PMSF], inibitori della proteasi [1 micron pepstatina A, 1 pM leupeptina, e 0,1 pM aprotinina] e 0,5% Triton X-100 [pH 7]) e mescolare bene. </li><li> Incubare le cellule per 30 min in ghiaccio per indurre lisi cellulare. </li><li> lisati centrifugare a 4 ° C a 10.000 xg per 15 minuti, e poi il trasferimento a surnatanti freschi provette da 1,5 ml (90 aliquote microlitri) e conservarli a -80 ° C. </li><li> Determinare le concentrazioni di proteine ​​totali di lisati cellulari che utilizzano il pr Bradfordsaggio otein. 9 </li><li> Carico 30 mg proteine ​​cellulari totali in un gel di acrilammide 10% o 12% di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel (SDS-PAGE) e quindi elettroforesi trasferimento separate bande proteiche filtri di nitrocellulosa con una corrente di 200 mA per 1 ora a 4 ° C da utilizzare in saggi di Western blot. </li><li> Blocco di nitrocellulosa membrane filtranti con il 5% di latte scremato in soluzione salina Tris tamponata con Tween 20 (TBST) per 1 ora, aggiungere anticorpi policlonali di coniglio primaria contro i non-fosforilata HSP27 (1: 1.000 diluizione) o primaria anticorpo policlonale di coniglio contro fosforilata HSP27 (1 : 1.000 diluizione) in 5% di albumina di siero bovino (BSA), e incubare le membrane notte a 4 ° C su un agitatore. </li><li> Rileva bande immunoreattive con rafano anticorpi di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi (1: 10.000) diluizione in 5% di BSA dopo il lavaggio per 10 minuti 3 volte con TBST. </li><li> Incubare la membrana nei reagenti luminol Western blotting (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membrane) per 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la membrana dalla soluzione del reagente, rimuovere il liquido in eccesso con un panno assorbente, e posto in un protettore foglio di plastica. </li><li> Lavorare in una stanza buia con una luce di sicurezza, posizionare la membrana ricoperta di una cassetta pellicola con il lato rivolto verso l&#39;alto di proteine. </li><li> Posizionare pellicola a raggi X in cima a membrana ed esporre per 1 min. </li></ol> 3. siRNA Transfection Assay 10 <ol><li> HCECs Culture a 5 × 10 5 cellule / pozzetto in una piastra da 6 pozzetti in un incubatore a 37 ° con un&#39;atmosfera 5% CO 2 utilizzando BEGM fino a raggiungere il 95% di confluenza. </li><li> Diluire il reagente di trasfezione (2.5 o 7.5 ml) con 100 ml riduzione media siero per trasfezione (il fattore di diluizione è 41 o 14.3) e sciogliere il HSP27-specifica e strapazzate controllo siRNA in 100 ml di medio siero ridotto per creare 10 o 50 nm di specifici HSP27 e si arrampicò di controllo siRNA. </li><li> Mescolare 100 μ; L soluzione siRNA con 100 microlitri di reagente diluito trasfezione (rapporto 1: 1) e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere i complessi siRNA-lipidi alle cellule. Poi, dopo 4 mezzi di modifica ore per completare BEGM e incubare le cellule per 2 giorni a 37 ° C. </li><li> Analizzare le cellule trasfettate mediante western blotting, come descritto dalle sezioni da 4.1 a 4.7. </li></ol> 4. Western Blot test per celle siRNA-trasfettate 11 <ol><li> Estrarre specifici HSP27 e strapazzate controllo HCECs siRNA-trasfettate in una cappa di sicurezza biologica con 100 microlitri tampone di lisi ghiacciata (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), inibitori della proteasi, e 0,5% Triton X-100, pH 7). </li><li> Incubare le cellule per 30 min in ghiaccio per indurre lisi cellulare. </li><li> lisati pellet a 10.000 xg per 15 minuti e poi trasferire surnatanti di fresco 1,5 ml vascaes (90 microlitri aliquote) e conservarli a -80 ° C. </li><li> Determinare le concentrazioni di proteine dei lisati cellulari che utilizzano il Metodo di Bradford. 9 </li><li> Caricare i campioni con la stessa quantità di proteine ​​cellulari totali su un gel di acrilammide 10% o 12%, sottopongono il gel di SDS-PAGE, e trasferire elettroforeticamente le bande proteiche separate su filtri di nitrocellulosa con una corrente di 200 mA per 1 ora a 4 ° C a utilizzare nei test Western blot. </li><li> Blocco membrane filtranti di nitrocellulosa con 5% di latte scremato in soluzione salina Tris tamponata con Tween 20 (TBST) per 1 ora, aggiungere anticorpi primari contro fosforilata e non fosforilata HSP27 (1: 1000 diluizione), fosforilata Akt (1: 1000 diluizione), non fosforilata Akt (1: 1000 diluizione, usato come marcatore sopravvivenza cellulare), Bcl-2 associata X proteina (1: 1000 diluizione, usato come una proteina pro-apoptotica) e gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 1 : 200 diluizione, usato come controllo di carico) in 5% di albumina di siero bovino (BSA), eincubare le membrane notte a 4 ° C su un agitatore. </li><li> Rileva bande immunoreattive con rafano anticorpi di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi (1: 10.000) diluizione in 5% di BSA dopo il lavaggio 3 volte con TBST, 10 minuti ogni lavaggio. </li><li> Incubare la membrana nei reagenti luminol Western blotting (6-7 ml per 10 cm cm x 5 cm membrane) per 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la membrana dalla soluzione del reagente, rimuovere il liquido in eccesso con un panno assorbente, e posto in un protettore foglio di plastica. </li><li> Lavorando in una stanza buia con una luce di sicurezza, posizionare la membrana coperto in una cassetta pellicola con il lato rivolto verso l&#39;alto proteine. </li><li> Posizionare pellicola per raggi X sulla parte superiore della membrana ed esporre per 1 min. </li></ol> 5. Scratch-indotta direzionale Ferimento test di valutazione della migrazione delle cellule 12 <ol><li> In una cappa di sicurezza biologica, fare una ferita trascinando una punta di pipetta sterile attraverso la superficie di un pozzo di culture confluenti dispecifici HSP27 siRNA-trasfettate o HCECs siRNA-trasfettate controllo strapazzate. </li><li> Subito dopo il ferimento, lavare le cellule due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS) e mantenerli nelle culture BEGM in un incubatore a 37 ° con un CO 2 atmosfera 5% per 24 ore dopo il ferimento. </li><li> Fotografare immagini HCEC utilizzando un microscopio in posizione verticale a ingrandimento 100X 24 ore dopo il ferimento ed eseguire sfondo appiattimento utilizzando il filtro comando nel software di analisi delle immagini. </li><li> Utilizzando il comando SELECT Misure, definire l&#39;area di interesse (AOI), con la stessa forma poligonale dimensioni che possono coprire perpendicolarmente da un capo all&#39;altro della ferita iniziale, e determinare tre diversi AOI nella zona ferita di ciascun campione. </li><li> contare automaticamente il numero di cellule in ogni campo usando il conteggio / Dimensioni opzioni di menu Misura. </li></ol> 6. flusso Analisi Citometria di Apoptosis <ol><li> Cultura HSP27-specifici siRNA-trasfettate e controllo sHCECs contenenti ciascuna 10 nM siRNA iRNA-trasfettate ad una concentrazione di 5 x 10 5 cellule / pozzetto in piastre da 6 pozzetti fino a quando le cellule raggiungono il 95% di confluenza in un incubatore a 37 ° con CO 2 atmosphere 5% in BEGM. </li><li> Sfilare HCECs utilizzando 2 ml 0,25% tripsina-EDTA per pozzetto per 5 minuti, centrifugare a 900 xg per 5 minuti in una provetta da 15 ml, e aspirare tripsina-EDTA con una pipetta 1 ml. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS freddo e risospendere le cellule in 1x tampone (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1.4 M NaCl, e 25 mM CaCl 2) rilegatura ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml. </li><li> Trasferire 100 microlitri sospensione cellulare (1 x 10 5 cellule) in una provetta 5 ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di fluoresceina isotiocianato coniugato annessina V e 5 ml ioduro di propidio. </li><li> Delicatamente vortice le cellule e incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio. </li><li> Aggiungere 200 ml di 1x tampone di legame a ciascuna provetta e analizzare le cellule da un flusso cytometer entro 1 ora. </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
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<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
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<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari o esclusive in qualunque materiale o metodi citati in questo studio.

In questo studio, abbiamo valutato il potenziale ruolo di HSP27 nel wounding epiteliale corneale utilizzando approcci in vitro . I passaggi critici hanno riguardato la trasfezione di siRNA per il knock-down di HSP27 per osservare la funzione di HSP27 nelle cellule sottoposte a stress. In particolare, un ruolo per HSP27 è stato rivelato da questi esperimenti nella migrazione delle cellule epiteliali e nell'apoptosi durante la guarigione delle ferite epiteliali corneali. A differenza degli studi precedenti10<...

Corneali cellule epiteliali (PEC) sono continuamente capannone in film lacrimale, mentre sono allo stesso tempo sostituite da cellule del limbus e corneali strati basali epiteliali. 1 vari fattori di stress estrinseci possono indurre l&#39;apoptosi e desquamazione della CEC. 2 Le proteine da shock termico (HSP) sono altamente conservati e possono essere suddivisi in due famiglie secondo dimensione molecolare. 3 la più grande famiglia HSP comprende HSP90, HSP70 e HSP60, e la famiglia più piccola comprende HSP27. 4 la fosforilazione di HSP27 è noto a svolgere un ruolo importante nella sopravvivenza cellulare ed è necessario per la migrazione delle cellule a causa del ruolo di questa proteina in actina rimodellamento. 5-7 Pertanto, abbiamo cercato di verificare il ruolo potenziale di HSP27 fosforilazione nella migrazione CEC e l&#39;apoptosi in un modello in vitro di cellule epiteliali guarigione della ferita. RNA interference (RNAi) utilizzando sia piccoli o brevi RNA interferenti (siRNA) ha geinteressi nerated sia in biologia di base e applicata, in quanto consente potenzialmente l&#39;espressione di un gene di interesse da abbattuto. 8 In questo, abbiamo usato specifici siRNA-HSP27 per valutare il contributo di HSP27 a CEC guarigione della ferita e l&#39;apoptosi. i metodi tradizionali per RNAi gene knock-down in cellule utilizzano duplex RNA sintetici, tra cui due non modificati oligonucleotidi 21-mer che possono essere assemblati per creare siRNA. La RNAi siRNA che abbiamo usato in questo studio è un metodo semplice e molto efficace trasfezione le cellule, e questo reagente funziona con varie linee cellulari immortalizzate. In questo studio, abbiamo dimostrato i metodi utilizzati per questa analisi, tra cui un saggio di zero-indotta ferita direzionale, western blotting, saggio di transfezione siRNA, test di immunofluorescenza e citometria a flusso.

<table><tbody><tr><td>Cabina di sicurezza biologica</td><td>CHC LAB Co., Ltd,&nbsp; Daejeon, Repubblica di Corea&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>Classe II, Tipo A2&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>RNAi siRNA; siRNA di controllo criptato e siRNA specifico per HSP27</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>Terreno di crescita dell'epitelio bronchiale</td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>P8340, P7626</td><td>1 &#956; M Pepstatina A, 1 &#956; M Leupeptina, 0,1 &#956; M Saggio</td></tr> delle proteine di Bradford con aprotina<tr><td>&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>#500-0001</td><td>Saggio delle proteine di Bradford&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtri nitrocellulosici&nbsp;</td><td>Amersham, Little Chalfont, Regno Unito</td><td>RPN3032D</td><td>Membrana di blotting</td></tr><tr><td>occidentale HSP27 non fosforilata</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351</td><td>Diluizione 1:1.000 (HSP27 totale)</td></tr><tr><td>HSP27 fosforilata (Ser85)</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594</td><td>Diluizione 1:1.000 HSP27 è stata fosforilata a Ser85</td></tr><tr><td>Lipofectamina&reg; Reagente RNAiMAX&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Akt fosforilato (Ser473)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA</td><td>n. 4060</td><td>Diluizione 1:1.000 Akt è stato fosforilato a Ser473 (marcatore di sopravvivenza cellulare)</td></tr><tr><td>Akt non fosforilato</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>n. 4061</td><td>Diluizione 1:1.000 (Total Akt)</td></tr><tr><td>Proteina X associata a Bcl-2&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>No. 4062</td><td>1:1.000 (marcatore proteico anti-apoptotico)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>No. 4063</td><td>1:1.000 marcatore di controllo del carico (gene housekeeping)</td></tr><tr><td>Anticorpi anti-coniglio di capra coniugati con perossidasi di rafano</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>31985</td><td>terreno sierico ridotto per trasfezione</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Olympus, Inc., Tokyo, Giappone</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germania</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a sei pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td> Piastra di coltura a 24 <td>pozzetti di diametro 35,00 mm / pozzetto</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>N-Bioteck, Inc., Seoul, Corea del Sud</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td> Pellicola a raggi X per <td>citometria a flusso</td></tr><tr><td></td><td>Kodak, Rochester, NY</td><td></td><td>Cassetta a raggi X medica con schermo verde 400</td></tr><tr><td>reagente luminol western blotting</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rilevamento dell'apoptosi dell'annessina V FITC I</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

indagine basata rna interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Il piccolo RNA interferente (siRNA) è tra i metodi di interferenza dell'RNA più utilizzati per il silenziamento a breve termine di geni codificanti proteine. siRNA è un duplex di RNA sintetico creato per colpire specificamente un trascritto di mRNA per indurne la degradazione ed è stato utilizzato per identificare nuovi percorsi in vari processi cellulari. Esistono pochi studi sul ruolo della proteina da shock termico fosforilata 27 (HSP27) nella guarigione delle ferite epiteliali corneali. In questo caso, le cellule epiteliali corneali umane in coltura sono state suddivise in un gruppo trasfettato con siRNA di controllo criptato e in un gruppo trasfettato con siRNA specifico per HSP27. Sono stati quindi eseguiti saggi di ferita direzionale indotta da graffio, western blotting e citometria a flusso. Concludiamo che HSP27 ha un ruolo nella guarigione delle ferite epiteliali corneali che può comportare l'apoptosi e la migrazione delle cellule epiteliali. Qui vengono fornite descrizioni dettagliate della preparazione del campione e del protocollo di studio.

L&#39;espressione di HSP27 fosforilata significativamente aumentata a 5, 10, e 30 minuti dopo il ferimento zero confrontato con HCECs illesi 13. Analisi Western Blot ha rivelato che l&#39;espressione di HSP27 fosforilata e fosforilata Akt sono stati entrambi significativamente ridotto, mentre l&#39;espressione di Bax era significativamente aumentata in HCECs siRNA-trasfettate specifici Hsp27 (Figura 1A-E). L&#39;espressione HSP27 fosforilata è stato ridotto de...

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare il piccolo RNA interferente specifico della proteina da shock termico 27 (HSP27) per valutare la funzione di HSP27 durante la guarigione delle ferite epiteliali corneali. L'interferenza dell'RNA è il metodo migliore per abbattere efficacemente l'espressione genica per studiare la funzione delle proteine in vari tipi di cellule.

Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

L'obiettivo generale di questo saggio di trasfezione dell'RNA è utilizzare un RNA interferente specifico per HSP27 per valutare il potenziale ruolo di HSP27 nella riparazione delle ferite dell'epitelio corneale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo alla funzione della proteina da shock termico 27 durante il processo di guarigione delle ferite epiteliali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'RNA interferente è un RNA sensibile al saccarosio progettato specificamente per bersagliare un trascritto di RNA messaggero e indurne la degradazione.È stato utilizzato per identificare nuovi fattori implicati in vari processi cellulari. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sul processo di guarigione della ferita nell'epitelio corneale, potrebbe essere applicata anche a un altro sistema, come la pelle e la mucosa. La procedura sarà dimostrata da Soon-Suk Kang, un tecnico del mio laboratorio.Per iniziare questa procedura, coltivare cellule epiteliali corneali umane in una piastra a sei pozzetti con mezzo di crescita per epitelio bronchiale a 37 gradi Celsius e cinque percento di anidride carbonica fino al raggiungimento di una confluenza del 95 percento. Successivamente, diluire 2,5 microlitri o 7,5 microlitri del reagente di trasfezione con 100 microlitri di mezzo con siero ridotto per la trasfezione. Quindi, sciogliere siRNA specifico per HSP27 e siRNA di controllo randomizzato in 100 microlitri di mezzo con siero ridotto per ottenere rispettivamente 10 nanomolari di siRNA specifico per HSP27 e 15 nanomolari di siRNA di controllo randomizzato.In seguito, mescolare 100 microlitri di soluzione di siRNA con 100 microlitri di reagente di trasfezione diluito e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere i complessi lipidici di siRNA alle cellule. Dopo un'incubazione di quattro ore, sostituire il mezzo con il mezzo completo per la crescita dell'epitelio bronchiale e incubare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius prima dell'analisi mediante western blot.In questo passaggio, estrarre le HCEC trasfettate con siRNA specifico per HSP27 e siRNA di controllo randomizzato in una cappa a sicurezza biologica utilizzando 100 microlitri di tampone di lisi freddo. Successivamente, incubare le cellule per 30 minuti sul ghiaccio per indurre la lisi cellulare. Poi, centrifugare i lisati a 10.000 ×g per 15 minuti.Successivamente, trasferire i soprannatanti in nuove provette da 1,5 millilitri e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Dopodiché, determinare le concentrazioni proteiche dei lisati cellulari utilizzando il saggio proteico di Bradford. Quindi, caricare i campioni con quantità uguali di proteine cellulari totali su un gel di acrilamide al 10 percento o al 12 percento.Sottoporre il gel a elettroforesi SDS-PAGE e trasferire elettroforeticamente le bande proteiche separate sui filtri di nitrocellulosa con una corrente di 200 milliampere per un'ora a quattro gradi Celsius. Successivamente, bloccare le membrane di nitrocellulosa con il cinque percento di latte scremato in TBST per un'ora. Quindi aggiungere gli anticorpi primari e incubare le membrane tutta la notte a quattro gradi Celsius su un agitatore.Il giorno successivo, lavare le membrane tre volte con TBST, consentendo dieci minuti per ogni lavaggio. Quindi rivelare le bande immunoreattive utilizzando anticorpi di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano in BSA al cinque percento. Successivamente, incubare le membrane nei reagenti luminol per il western blotting per un minuto a temperatura ambiente.Rimuovere la membrana dalla soluzione del reagente. Successivamente, asportare il liquido in eccesso con un panno assorbente e posizionarla in una bustina di plastica protettiva. In seguito, inserire la membrana protetta in una cassetta per pellicole con il lato proteico rivolto verso l'alto.Posizionare un film a raggi X sopra le membrane ed esporlo per un minuto. All'interno di una cappa a sicurezza biologica, creare una ferita trascinando una punta di pipetta sterile attraverso colture confluenti di HCEC trasfettate con siRNA specifico per HSP27 o siRNA di controllo randomizzato. Subito dopo la ferita, lavare le cellule due volte con PBS 1X e mantenerle in mezzo di crescita per epitelio bronchiale a 37 gradi Celsius e cinque percento di anidride carbonica per 24 ore.24 ore dopo la ferita, acquisire l'immagine delle HCEC utilizzando un microscopio verticale a 100x ed eseguire l'appiattimento dello sfondo mediante il comando filtro nel software di analisi delle immagini. Utilizzando il comando seleziona misurazioni, definire l'area di interesse con una forma poligonale delle stesse dimensioni, in grado di coprire perpendicolarmente la ferita iniziale da un'estremità all'altra. Successivamente, determinare tre diverse aree di interesse nella zona ferita di ciascun campione.Contare automaticamente il numero di cellule in ogni campo utilizzando l'opzione del menu misura dimensione conteggio. L'analisi di Western blot mostrata qui ha rivelato che l'espressione di HSP27 fosforilata e di Akt fosforilata era significativamente ridotta. Mentre l'espressione di backs era significativamente aumentata nelle HCEC trasfettate con siRNA specifico per HSP27.L'espressione di HSP27 fosforilata è stata ridotta del 30 percento e del 40 percento rispettivamente in cellule trasfettate con siRNA specifico per HSP27 a 10 nanomolar e 15 nanomolar, rispetto alle cellule trasfettate con siRNA di controllo. Inoltre, l'espressione di HSP27 non fosforilata è stata ridotta del 20 percento e del 30 percento rispettivamente in cellule trasfettate con siRNA specifico per HSP27 a dieci nanomolar e 15 nanomolar. Il saggio del ferita direzionale indotto da graffio ha indicato che 24 ore dopo la ferita, le cellule trasfettate con siRNA specifico per HSP27 a 10 e 15 nanomolar hanno mostrato una migrazione ridotta.Inoltre, le HCEC trasfettate con siRNA specifico per HSP27 hanno subito una maggiore morte cellulare apoptotica e necrotica rispetto alle cellule trasfettate con siRNA di controllo scrambled, come mostrato dalla citometria a flusso. Una volta padroneggiata, la tecnica di trasfezione dell'RNA può essere eseguita in 24 ore se effettuata correttamente. Seguendo queste procedure, è possibile indurre un episodio simile al blocco della bocca al fine di rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio la funzione iniziale della Heat Shock Protein 27 nella riparazione delle ferite dell'epitelio corneale.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un RNA interferente specifico per la Heat Shock Protein 27 per valutare il potenziale ruolo della Heat Shock Protein 27 nella guarigione delle ferite epiteliali della cornea. Non dimenticare che lavorare con RNA interferenti e reagenti può essere pericoloso e che dispositivi di protezione come una cappa a sicurezza biologica e una maschera protettiva devono essere sempre utilizzati durante l'esecuzione di queste procedure.

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Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

Screening RNA inibitorio piccolo su vasta scala è uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida dei modelli di esposizione e dei metodi per lo screening di elevato throughput di indotta da acido fluoridrico e cloropicrina lesioni epiteliali cornea.

High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico

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Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

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Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale (Video) | JoVE Journal

Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

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