Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

L'obiettivo generale di questo test di trasfezione dell'RNA è quello di utilizzare l'RNA interferente specifico per HSP27 per valutare il potenziale ruolo di HSP27 nella guarigione delle ferite epiteliali corneali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la funzione della proteina da shock termico 27 durante il processo di guarigione delle ferite epiteliali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il piccolo RNA interferente è un RNA sensibile al saccarosio creato per colpire specificamente un trascritto di RNA messaggero per indurne la degradazione.

È stato utilizzato per identificare nuovi processi cellulari dello spazio dei parassiti. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sulla guarigione della ferita epiteliale corneale, può essere applicata anche a un altro sistema come la pelle e le mucose. A dimostrare la procedura sarà Soon-Suk Kang, un tecnico del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, coltivare cellule epiteliali corneali umane in una piastra a sei pozzetti con terreno di crescita dell'epitelio bronchiale a 37 gradi Celsius e il cinque percento di anidride carbonica fino alla confluenza del 95 percento. Successivamente, diluire 2,5 microlitri o 7,5 microlitri di reagente di trasfezione con 100 microlitri di terreno di siero ridotto per la trasfezione. Quindi, sciogliere il siRNA specifico di HSP27 e il siRNA controllato criptato in 100 microlitri o terreno sierico ridotto per creare rispettivamente 10 nanomolari di siRNA specifico per HSP27 e 15 nanomolari di siRNA di controllo criptato.

Successivamente, mescolare 100 microlitri di soluzione di siRNA con 100 microlitri di reagente di trasfezione diluito e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere complessi lipidici siRNA alle cellule. Dopo un'incubazione di quattro ore, cambiare il terreno con il mezzo di crescita completo dell'epitelio bronchiale e incubare le cellule due giorni a 37 gradi Celsius prima dell'analisi del western blot.

In questa fase, estrarre gli HCEC specifici per HSP27 e trasfettati con siRNA di controllo criptato in una cabina di sicurezza biologica utilizzando 100 microlitri di tampone di lisi ghiacciata. Quindi incubare le cellule per 30 minuti su ghiaccio per indurre la lisi cellulare. Quindi, centrifugare i lisati a 10.000 volte G per 15 minuti.

Successivamente, trasferire i surnatanti in provette fresche da 1,5 millilitri e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Successivamente, determinare le concentrazioni proteiche dei litati cellulari utilizzando il saggio delle proteine di Bradford. Quindi caricare i campioni con quantità uguali di proteine cellulari totali su un gel di acrilammide al 10% o al 12%.

Sottoporre il gel alla pagina SDS e trasferire elettroforeticamente le bande proteiche separate ai filtri di nitrocellulosa con 200 milliampere di corrente per un'ora e quattro gradi Celsius. Quindi, bloccare le membrane del filtro in nitrocellulosa con il cinque percento di latte scremato in TBST per un'ora. Quindi aggiungere gli anticorpi primari e incubare le membrane per una notte a quattro gradi Celsius su uno shaker.

Il giorno successivo, lavare le membrane tre volte con TBST lasciando dieci minuti per ogni lavaggio. Quindi rilevare le bande immunolreattive utilizzando anticorpi anti-coniglio di capra coniugati con perossidasi di rafano nel cinque percento di BSA. Successivamente, incubare le membrane nei reagenti di luminol western blotting per un minuto a temperatura ambiente.

Rimuovere la membrana dalla soluzione reagente. Quindi, rimuovere il liquido in eccesso con un asciugamano assorbente e metterli in un foglio di plastica. Successivamente, posizionare la membrana coperta in una cassetta di pellicola con il lato proteico rivolto verso l'alto.

Posizionare una pellicola radiografica sopra le membrane ed esporla per un minuto. In una cappa di sicurezza biologica, praticare una ferita trascinando un puntale di pipetta sterile attraverso le colture confluenti di HCEC trasfettati con siRNA di controllo specifico per HSP27 o criptato. Immediatamente dopo la ferita, lavare le cellule due volte con 1XPBS e mantenerle nel terreno di crescita dell'epitelio bronchiale a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per 24 ore.

24 ore dopo la ferita, scattare l'immagine degli HCEC utilizzando un microscopio verticale a 100x ed eseguire l'appiattimento dello sfondo utilizzando il comando filtro nel software di analisi delle immagini. Utilizzando il comando di selezione delle misure, definire l'area di interesse con la stessa dimensione di forma poligonale che può coprire la ferita iniziale perpendicolarmente da un'estremità all'altra. Quindi, determina tre diverse aree di interesse nell'area ferita di ciascun campione.

Conta automaticamente il numero di cella in ogni campo utilizzando l'opzione di menu di misurazione della dimensione del conteggio. L'analisi del western blot mostrata qui, ha rivelato che l'espressione di HSP27 fosforilata e Akt fosforilata era entrambe significativamente ridotta. Mentre l'espressione dei dorsi era significativamente aumentata negli HCEC trasfettati specifici per siRNA HSP27.

L'espressione fosforilata di HSP27 è stata ridotta del 30% e del 40% rispettivamente in 10 nanomolari e 15 nanomolari di cellule trasfettate con siRNA specifiche per HSP27, rispetto alle cellule trasfettate con siRNA di controllo. Inoltre, l'espressione di HSP27 non fosforilata è stata ridotta del 20% e del 30% rispettivamente in dieci nanomolari e 15 nanomolari di cellule trasfettate siRNA specifiche per HSP27. Il test della ferita direzionale indotta dal graffio ha indicato che 24 ore dopo la ferita, le cellule trasfettate siRNA specifiche per HSP27 a 10 e 15 nanomolari esibite hanno ridotto la migrazione.

Inoltre, gli HCEC trasfettati con siRNA specifici per HSP27 hanno subito una maggiore morte cellulare apoptotica e necrotica rispetto alle cellule trasfettate con siRNA di controllo criptato mostrate dalla citometria a flusso. Una volta padroneggiata, la tecnica di trasfezione dell'RNA può essere eseguita in 24 ore se eseguita correttamente. A seguito di queste procedure, può essere generato un episodio come la bocca chiusa per rispondere a ulteriori domande come la funzione iniziale della proteina da shock termico 27 nella guarigione delle ferite epiteliali della cornea.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'RNA interferente specifico della proteina da shock termico 27 per valutare il potenziale ruolo della proteina da shock termico 27 nella guarigione delle ferite epiteliali della cornea. Non dimenticare che lavorare con piccoli RNA e reagenti interferenti può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di queste procedure è necessario utilizzare sempre precursori come un armadio di sicurezza biologica e una maschera protettiva.