Name: Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Scopri la tecnica di trasferimento del colorante fluorescente per misurare la comunicazione intercellulare attraverso le giunzioni comunicanti nelle cellule epiteliali epatiche WB-F344. Questo metodo semplice e rapido valuta gli effetti dei tossici sulla funzione delle giunzioni comunicanti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Supportato dalle sovvenzioni NIEHS #R01 ES013268-01A2, e i contenuti sono di esclusiva responsabilità dell'autore e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali del NIEHS, e supportati dal progetto CETOCOEN UPgrade No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

Il protocollo per questo studio è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo dei National Institutes of Health Sciences del Giappone, che è dove in vivo esperimenti sono stati fatti, per assicurare che i ratti sono stati trattati umanamente e con riguardo per alleviare le sofferenze. 1. SL-DT Bioassay <ol><li> Seed 3 x 10 5 WB-F344 cellule epiteliali di fegato di ratto Onto 35 piastre di coltura mm di diametro contenenti Eagles modificati medie più il 5% di siero fetale bovino, e cultura le cellule in un incubatore a 37 ° C, 100% di umidità relativa (RH), 5% CO 2. </li><li> Culture cellule fino a raggiungere il 100% di confluenza (tipicamente, 2 giorni) e condurre il trattamento sperimentale desiderata delle cellule come descritto di seguito. <ol><li> Condurre esperimenti Dose Response <ol><li> Aggiungere 10 ml e 20 ml di una mM soluzione madre di fenantrene 2 in 100% acetonitrile e 4 ml, 6 ml e 8 ml di una soluzione di 20 mM magazzino di phenanthrene in 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per ogni volume aggiunto di soluzione madre. </li><li> Aggiungere 4 ml, 6 microlitri, 8 microlitri, 10 microlitri, e 20 pl di una soluzione 100% di acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per ogni volume aggiunto di soluzione di acetonitrile per servire come controllo del veicolo. </li><li> Incubare le piastre per 15 minuti in un incubatore a 37 ° C, 100% UR e 5% CO 2. </li><li> Passare al punto 1.3. </li></ol></li><li> Comportamento Tempo Esperimenti di risposta <ol><li> Aggiungere 7 ml di una soluzione madre mM di fenantrene in 100% acetonitrile 20 a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita per ciascun punto di tempo (cioè, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min). </li><li> Aggiungere 7 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita per ciascun punto di tempo per servire come controllo del veicolo. </li><li> Incubare le piastre per ogni tempo designato pmista in un incubatore a 37 ° C, 100% UR e 5% CO 2. </li><li> Passare al punto 1.3. </li></ol></li><li> Condurre esperimenti tempi di recupero <ol><li> Aggiungere 7 ml di una soluzione madre mM di fenantrene in 100% acetonitrile 20 a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per 15 min. </li><li> Aggiungere 7 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per 15 min per servire come controllo del veicolo. </li><li> Decantare il mezzo contenente sia il fenantrene o acetonitrile e risciacquare 3x ciascuno con 3 ml di tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco per ciascuna piastra e incubare per i tempi di recupero desiderati (cioè, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) in un incubatore a 37 ° C, 100 % UR e 5% di CO 2. </li><li> Passare al punto 1.3. </li></ol></li><li> Condurre esperimenti Meccanismo <ol><li> Aggiungere l'inibitore trasduzione del segnale, vale a dire </li><li> Aggiungere 5 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per 15 min per servire come controllo del veicolo. </li><li> Aggiungere 7 ml di una soluzione madre mM di fenantrene in 100% acetonitrile 20 a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita più la D609 per altri 15 min. </li><li> Aggiungere 7 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita più l'acetonitrile 100% per altri 15 min per servire come controllo del veicolo. </li><li> Passare al punto 1.3. </li></ol></li></ol></li><li> Eliminare il terreno di coltura da una delicatezza travaso del mezzo o per aspirazione sotto vuoto. Nota: Smaltire terreno di coltura contenente rifiuti pericolosi in modo appropriato. </li><li> Lavare le cellule tre volte ciascuno con 3 ml di PBS e sia decantare o aspirare between risciacqua. </li><li> Pipettare 1 ml di 1 mg / ml Lucifer colorante giallo disciolto in PBS (LY) in ciascuna piastra di cella. </li><li> Precaricare il colorante nelle cellule da dolci un # 20 lama in acciaio chirurgico con un bordo arrotondato attraverso una popolazione di cellule in tre diverse aree della piastra. <ol><li> Iniziare mettendo bisturi perpendicolare (angolo di 90 °) e 5 mm dal bordo della piastra di coltura, e quindi scorrere il bisturi da questo angolo perpendicolare a circa un angolo di 15 ° (vedere Figura 1). Nota: Questo si ottiene pizzicando la bisturi tra il dito indice e il pollice. Utilizzare gravità per consentire il bisturi per andare delicatamente dalle 90 ° a 15 ° posizione (come la lama arrotondata rotola semplicemente sulle celle). Questo movimento lascerà una linea di rientro visivamente evidente. </li></ol></li><li> Incubare le cellule con la soluzione LY per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Decantare o aspirare il LY e sciacquare tre volte con 3 ml di PBS per rimuovere tutti extracellular tingere di eliminare sfondo extracellulare fluorescenza. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di soluzione di formalina tamponata al 10% per fissare le cellule. Nota: Dopo aver fissato in formalina, asciugare le cellule e conservare al buio per un massimo di due anni con photobleaching minima del colorante LY. Quando richiesto, reidratare con formalina al 10% per visualizzare il fronte del colorante fluorescente. </li><li> Mostra le cellule fissate utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di un cubo dicroico per i picchi di eccitazione / emissione di 428/536 nm con un ingrandimento di 200X. Allineare tutte le piastre in modo che la linea di rientro è parallelo al campo visivo orizzontale. Nota: Un cubo FITC dicroico funziona bene. <ol><li> Acquisire l'immagine di una telecamera CCD e il software di supporto. <ol><li> Aprire il software di supporto per la fotocamera CCD e utilizzare le impostazioni per l'esposizione automatica. Utilizzare il pulsante "cattura" per acquisire digitalmente l'immagine. Salvare l'immagine come tif file utilizzando il tasto "Salva". </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Adattamento del SL-DT test di tessuto epatico <ol><li> Rimuovere circa una fetta 2 x 2 cm dal lobo sinistro del fegato da un 5 settimane di età, di sesso maschile Fischer 344 ratti utilizzando forbici dissezione e posizionarlo su una plastica pesare piatto coperto con una garza bagnata 12. </li><li> Pipettare 0,5 ml di una soluzione di PBS contenente 1 mg / ml ciascuna di Lucifero targa gialla e rodamina-destrano (RD) sulla superficie della fetta fegato in plastica peso. Nota: La RD è un colorante che non può attraversare canali giunzione gap e segnerà le cellule che sono state caricate. </li><li> Effettuare tre a cinque incisioni lunghe circa 1 cm sulla superficie della fetta fegato che ha la soluzione colorante nel piatto di pesatura con una lama tagliente e quindi aggiungere ulteriori colorante sufficiente per riempire le incisioni. </li><li> Incubare il tessuto per 3 minuti a temperatura ambiente sulla plastica pesare piatto. </li><li> Risciacquare tre volte con 5 ml di PBS. </li><li> Fissare il tessuto overnight in 30 ml di 10% tampone fosfato di formalina in un tubo da 50 ml conica per centrifuga al buio a temperatura ambiente. </li><li> Il giorno seguente, lavare le fette con l'acqua, tagliare il tessuto intorno al incisione con dissezione forbici in 1 x 1 x 0,5 centimetri 3 strisce e quindi utilizzare le tecniche standard per incorporare le fette in paraffina 13. </li><li> Sezione le fette perpendicolari alla linea di incisione di spessore di 5 micron e conservare i campioni al buio fino al momento di essere ripreso utilizzando tecniche di sezionamento standard con un microtomo 13. </li><li> Utilizzare un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera digitale CCD di visualizzare e catturare le immagini dei fronti colorante fluorescente secondo la sezione 1.10 7. </li></ol> 3. Quantificare GJIC <ol><li> Misurare la diffusione colorante fluorescente utilizzando un pacchetto morfometrica software (ad esempio, ImageJ). <ol><li> Fare clic sulla scheda "File" e poi su "Apri" per aprire laimmagine salvata. </li><li> Clicca su "strumento Free Hand" nella barra degli strumenti Tab per tracciare il contorno del fronte del colorante. </li><li> Fare clic sulla scheda "Analizza" e quindi su "Misura". Nota: Questo genererà un valore di area in un foglio di calcolo, che può essere copiato in altri programmi di foglio elettronico se lo si desidera. </li></ol></li><li> Utilizzando un foglio di calcolo, calcolare la frazione del controllo (FOC) dividendo l'area di diffusione colorante nel piatto sperimentale per la superficie colorante viaggiato nella piastra di controllo utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54281/54281equation1.jpg"> A = area e della diffusione di colorante in cellule esposte ad una variabile sperimentale, come le cellule trattate con una sostanza chimica in una dose o tempo specifico A c = area della diffusione colorante nel controllo, che sono cellule trattate con il veicolo usato per sciogliere la sostanza chimica di interesse Nota: Per determinare l'effetto del veicolo,A e sarebbe l'area di diffusione colorante nelle cellule trattate con il veicolo e A c sarebbe l'area di diffusione colorante in cellule non trattate con il veicolo. L'effetto del veicolo dovrebbe essere preferibilmente inferiore al 10%. </li></ol>

<ol><li>Rotroff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+endocrine+testing+in+the+21st+century+using+in+vitro+assays+of+estrogen+receptor+signaling+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Sci.Technol%22%5BJournal%5D)">Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses.</a> Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).</li>
<li>Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+the+complexity+of+communication%3A+regulation+of+gap+junctions+by+post-translational+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification.</a> Front Pharmacol. 4, 130(2013).</li>
<li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Compr.Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Sovadinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+specific+PLC-induced+dysregulation+of+gap+junctions%2C+a+robust+cellular+response+to+environmental+toxicants%2C+and+prevention+by+resveratrol+in+a+rat+liver+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model.</a> PLoS.One. 10 (5), e0124454(2015).</li>
<li>Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrosko%2C+JE+%22Biologically+Based+Methods+for+Cancer+Risk+Assessment%22">Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment</a>. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).</li>
<li>Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrosko%2C+JE+%22Biomarkers+and+occupational+health%3A+progess+and+perspectives%22">Biomarkers and occupational health: progess and perspectives</a>. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).</li>
<li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+integrative+signaling+through+gap+junctions+in+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Protoc.Toxicol%22%5BJournal%5D)">Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology.</a> Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).</li>
<li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Signal%22%5BJournal%5D)">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li>
<li>Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-follicle+cell+gap+junctions+in+Xenopus+laevis+and+the+effects+of+gonadotropin+on+their+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability.</a> Science. 203 (4376), 182-183 (1979).</li>
<li>El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-loading+and+dye+transfer.+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).</li>
<li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+photobleaching+assay+of+gap+junction-mediated+communication+between+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells.</a> Science. 232 (4749), 525-528 (1986).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).</li>
<li>Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , <a target="_blank" href="http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue">http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue</a> (2012).</li>
<li>Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+biological+%26%2334%3BRosetta+stone%26%2334%3B+in+understanding%2C+in+a+systems+biological+manner%2C+stem+cell+behavior%2C+mechanisms+of+epigenetic+toxicology%2C+chemoprevention+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication as a biological &#34;Rosetta stone&#34; in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy.</a> J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).</li>
<li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulated+gap+junctional+intercellular+communication+as+a+biomarker+of+PAH+epigenetic+toxicity%3A+structure-function+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship.</a> Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+promoting+properties+of+a+cigarette+smoke+prevalent+polycyclic+aromatic+hydrocarbon+as+indicated+by+the+inhibition+of+gap+junctional+intercellular+communication+via+phosphatidylcholine-specific+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase.</a> C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).</li>
<li>Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+the+down-regulation+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+green+tea+in+the+liver+of+mice+fed+pentachlorophenol%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol.</a> Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).</li>
<li>Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+is+dependent+on+the+chain+length+of+the+fluorinated+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail.</a> Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).</li>
<li>Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrosko%2C+JE+%22Contrib+Microbiol%22">Contrib Microbiol</a>. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).</li>
<li>Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+as+targets+for+the+aging+and+diseases+of+aging+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes.</a> Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).</li>
<li>JE, T. rosko <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJE%2C+Trosko+%22Stem+Cells+and+Cancer%22">Stem Cells and Cancer</a>. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).</li>
<li>Osgood, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycyclic+aromatic+hydrocarbon-induced+signaling+events+relevant+to+inflammation+and+tumorigenesis+in+lung+cells+are+dependent+on+molecular+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure.</a> PLoS. One. 8 (6), e65150(2014).</li>
<li>Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bay+or+baylike+regions+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+were+potent+inhibitors+of+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication.</a> Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).</li>
<li>Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+metabolic+cooperation+in+Chinese+hamster+cells+by+a+tumor+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter.</a> Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+caged+coumarin+fluorophores+with+extraordinary+uncaging+cross+sections+suitable+for+biological+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).</li>
<li>Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pre-loading+method+of+evaluating+gap+junctional+communication+by+fluorescent+dye+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer.</a> Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).</li>
<li>Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+stretch+enhances+gap+junctional+communication+between+osteoblastic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells.</a> J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio SL-DT è una tecnica semplice e versatile in misura GJIC, ma ci sono diverse preoccupazioni critiche che dovrebbero essere contabilizzati nella progettazione di adeguati protocolli sperimentali. Per misurazioni affidabili di GJIC utilizzando il test SL-DT ci deve essere una buona diffusione tintura della LY attraverso giunzioni delle cellule. Come minimo, un tempo adeguato deve essere scelto per assicurare che il colorante si diffonde attraverso otto o più righe di celle dalle cellule bisturi caricata in entram...

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una tecnica semplice, completo e relativamente poco costoso per valutare i potenziali tossicità di composti. Questo è un approccio in vitro che possono essere utilizzati in molteplici linee cellulari. laboratori di biologia delle cellule standard dotate di microscopi epifluorescenza possono condurre una ricerca utilizzando questo test. La nostra conoscenza di base delle funzioni cellulari è stato fortemente dipendente test biologici in vitro, ed è diventato una componente essenziale nelle valutazioni tossicologiche dei prodotti farmaceutici, inquinanti ambientali e contaminanti alimentari nato. Purtroppo, non esiste un unico sistema in vitro nel saggio biologico che può ampiamente soddisfare le richieste di tutte le valutazioni tossicologiche. Molti test in vitro sono progettati e ottimizzati per valutare e valutare uno specifico endpoint biochimica o molecolare. Questi sono spesso combinati in un flusso elevato impostato per riflettere una perturbazione di uncerto trasduzione del segnale, come ad esempio recettore per gli estrogeni segnalazione 1. Questa strategia ha avuto un discreto successo, ma il vasto numero di vie di trasduzione del segnale coinvolti nella espressione genica rende il compito di scegliere un percorso di segnalazione specifica per valutare abbastanza complessa. Alte protocolli through-put sono attualmente in fase di sviluppo e utilizzati per misurare simultaneamente numerose vie di segnalazione, che è stato uno approccio per superare alcuni dei limiti dei singoli test. Tuttavia, non tutte le vie di segnalazione sono stati inseriti con successo in approcci più completi, oltre a nuove vie di segnalazione sono costantemente scoperto che complica ulteriormente il processo di valutazione. Utilizzando i numeri ampi di approcci in vitro, particolarmente elevato through-put sistemi, per le valutazioni tossicologiche complete sono anche molto costosi e non sono favorevoli alla più unico investigatore condotto progetti di ricerca. GJIC è un processo tightly controllato da variazioni di tensione, concentrazione di calcio, pH, redox equilibrio, regolamentati da importanti vie di trasduzione del segnale intracellulare e le interazioni con la membrana e citoscheletro proteine 2,3. Quindi, l&#39;inibizione della GJIC può riflettere i diversi tipi di stress cellulare, interruzione delle diverse funzioni cellulari, o perturbazioni di diverse vie di trasduzione del segnale. Un altro approccio per superare l&#39;uso di limitate biosaggi trasduzione del segnale è di sfruttare i fenomeni biologici che molti, se non la maggior parte, trasduzione del segnale sono ulteriormente modulati da sistemi di segnalazione intercellulari cooperativi attraverso canali gap junction 4-8. Sebbene i sistemi di segnalazione intercellulari sono anche numerose e sotto controllo percorso multiplo, la segnalazione intercellulare attraverso canali di giunzione gap è in definitiva una funzione dei canali essendo aperto, parzialmente chiusa o completamente chiusa. Questo fornisce un punto finale che può essere facilmente misurata utilizzando diversinei sistemi di saggi biologici in vitro 7. Considerando che il set point di un tessuto omeostatico richiede canali aperti, determinare l&#39;effetto dei composti su spazi di giunzione comunicazione intercellulare (GJIC) è un approccio più completo nel determinare i potenziali effetti tossici dei composti 4,8. In sostanza, questo fenomeno biologico fondamentale che svolge un ruolo centrale nel coordinamento più eventi di trasduzione del segnale che controllano l&#39;espressione genica permette una ampia valutazione degli effetti tossici. Così, test biologici che valutano GJIC sono un ottimo punto di partenza per valutare il potenziale tossicità dei composti. I più estese tecniche utilizzate per valutare GJIC sono basati su precarico cellule con una sonda fluorescente e poi per controllare la migrazione del colorante dalla cella caricato o celle alle celle adiacenti. Tecniche per precaricare il colorante hanno coinvolto microiniezione 9, raschiare carico 10, e metilici esteri delle sonde 11 </sup&gt;. Il bisturi loading fluorescente trasferimento della tintura metodo (SL-DT) è una modifica del carico raschiatura - colorante assay transfer sviluppato da El Fouly 10. Piuttosto che il raschiare più invasivo, il metodo bisturi carico di questo rapporto implica un dolce rotolo di un bisturi con lama circolare attraverso un monostrato di cellule che riducano al minimo i danni invasiva (Figura 1). I vantaggi di questa tecnica sono la valutazione tossicologica di una popolazione di cellule piuttosto che singole cellule del dosaggio microiniezione. Inoltre, la semplicità di questo test consente la rapida rilevazione di più lastre in breve tempo mentre i metodi che utilizzano tecniche di microiniezione e tecniche che utilizzano gli esteri metilici di sonde fluorescenti sono significativamente più tempo e richiedono livello di abilità notevolmente superiore. Anche se non esiste un unico metodo per soddisfare tutte le esigenze di studio GJIC; il saggio SL-DT è un test semplice, piuttosto economico e versatile che puòsoddisfare molte delle esigenze per le valutazioni iniziali di tossicità di vari composti. I principali vantaggi sono: semplicità, senza particolare bisogno di attrezzature o le competenze che sono necessarie per altri metodi come la microiniezione, recupero fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) analisi e attivazione locale di saggi sonda fluorescente molecolare, una valutazione rapida e simultanea di GJIC in una grande numero di cellule, favorisce un alto rendimento set-up con imaging di fluorescenza automatizzata microscopia ed analisi, nonché la sua adattabilità per studi in vivo.

<table><tbody><tr><td>WB-F344 Cellule epiteliali del fegato di ratto</td><td>Dai dottori J. W. Grisham e M. S. Tsao dell'Università della Carolina del Nord (Chapel Hill, NC)</td> <td>Nessuna</td><td>fornita dai dottori J. W. Grisham e M. S. Tsao Università della Carolina del Nord-Chapel Hill-NC</td></tr><tr><td>Piastre di coltura da 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>fiasche di coltura da 25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche da coltura da 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>D-medium, un terreno modificato da Eagles...</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>Formula n. 78-5470EF</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>15050</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>fatta in casa</td><td>vedi sotto per l'ingrediente cat #</td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Panettiere - Mallinckrodt</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3819--01</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>JT Panettiere - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>Lucifero Giallo CH, sale di litio</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>rodamina-destrano</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>1-metilantracene</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fenantrene</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>P11409</td><td></td></tr><tr><td>resveratrolo</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>R5010</td><td></td></tr><tr><td>D609</td><td>Tocris Bioscience&nbsp;</td><td>1437</td><td></td></tr><tr><td>acetonitril</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td></td></tr><tr><td>soluzione al 37% formaldeide</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>#20 lama chirurgica</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>10317-14</td><td></td></tr><tr><td>Provette sterili coniche da 50 ml</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>339652</tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza Nikon&nbsp;</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>Nikon FITC cubo dicroico</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>96107</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon Cool Snap EZ sistema di imaging CCD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon -Mager Scientific Nikon</td><td>NIS-Elements F2.2.</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Istituto Nazionale di Sanità</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Questo protocollo descrive un bisturi loading fluorescente trasferimento della tintura tecnica (SL-DT) che misura la comunicazione intercellulare attraverso canali di giunzione gap, che è un importante processo intercellulare attraverso cui omeostasi tessuto sia conservato. Interruzione di spazi di giunzione comunicazione intercellulare (GJIC) di sostanze tossiche, tossine, farmaci, ecc è stato collegato a numerosi effetti negativi sulla salute. Molte malattie umane genetiche basata sono state legate a mutazioni in geni gap junction. La tecnica SL-DT è un semplice saggio funzionale per la valutazione simultanea GJIC in una grande popolazione di cellule. Il test prevede cellule pre-caricamento con un colorante fluorescente perturbando brevemente la membrana cellulare con una lama di bisturi attraverso una popolazione di cellule. Il colorante fluorescente è quindi consentito di attraversare attraverso canali di giunzione gap celle adiacenti per un tempo designato. Il saggio viene quindi interrotta mediante aggiunta di formalina alle cellule. La diffusione del fluocolorante fluore- attraverso una popolazione di cellule è valutato con un microscopio a epifluorescenza e le immagini vengono analizzate con qualsiasi numero di pacchetti software morfometrici che sono disponibili, tra cui pacchetti di software libero presenti sul dominio pubblico. Questo test è stato adattato per gli studi in vivo utilizzando fette di tessuto da vari organi da animali trattati. In generale, il dosaggio SL-DT può servire una vasta gamma di esigenze farmacologiche e tossicologiche in vitro, e può essere potenzialmente adatto per sistemi set-up high throughput con l&#39;imaging microscopia a fluorescenza automatizzato e analisi di chiarire più campioni in un tempo più breve.

Interruzione di GJIC è stato ampiamente utilizzato come biomarker per l'identificazione di composti tossici a, il livello epigenetico non genotossica di controllo gene che induce effetti negativi sulla salute 14. Ad esempio, idrocarburi aromatici policiclici (PAH) sono contaminanti ubiquitari dell'ambiente ma variano nelle loro tossicità epigenetiche in funzione delle loro strutture molecolari 15. I PAH di peso molecolare inferiore si trovano tipicamente a concentra...

Questo protocollo descrive una tecnica di trasferimento di carico bisturi-colorante fluorescente che misura la comunicazione intercellulare attraverso i canali gap junction. Gap giunzionale comunicazione intercellulare è un importante processo cellulare attraverso il quale l&#39;omeostasi tissutale è mantenuto e la rottura di questa segnalazione cellulare ha effetti negativi sulla salute.

Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

L'obiettivo generale è quello di fornire un semplice test per misurare la comunicazione intercellulare giunzionale gap attraverso una popolazione di cellule di mammifero in grado di soddisfare un'ampia gamma di esigenze farmacologiche e tossicologiche in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tossicologia, come ad esempio se un composto influisce sullo sviluppo o sul mantenimento di un tessuto, disregolando la comunicazione intercellulare giunzionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre una valutazione semplice e rapida della funzione della giunzione gap in un'ampia popolazione di cellule in risposta a sostanze tossiche e tossine.A dimostrare la procedura sarà Ajna Uzuni, un'assistente di ricerca universitaria del mio laboratorio. Per iniziare l'esperimento, seminare tre volte 10 al quinto WB-F344 cellule epiteliali del fegato di ratto su piastre di coltura di 35 millimetri di diametro contenenti il terreno modificato di Eagle più il 5% di siero fetale bovino. Coltivare le cellule in un incubatore fino a raggiungere il 100% di confluenza e continuare con il trattamento sperimentale delle cellule.Per continuare con gli esperimenti dose-risposta, aggiungere 10 microlitri e 20 microlitri di una soluzione madre di fenantrene al 100% in acetonitrile precedentemente preparata e quattro microlitri, sei microlitri e otto microlitri di una soluzione madre da 20 millimolari di fenantrene in acetonitrile al 100% a tre piastre di cellule contenenti due millilitri di terreno di crescita per ogni volume aggiunto di soluzione madre. Quindi, aggiungere quattro microlitri, sei microlitri, otto microlitri, 10 microlitri e 20 microlitri di una soluzione al 100% di acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti due millilitri di terreno di crescita per ogni volume aggiunto di soluzione di acetonitrile che funge da controllo del veicolo. Dopo aver aggiunto l'acetonitrile, incubare le piastre.Per eseguire esperimenti di risposta temporale, aggiungere sette microlitri di una soluzione madre da 20 millimolari di fenantrene in acetonitrile al 100% a tre piastre di cellule, contenenti due millilitri di terreno di crescita per ogni punto temporale. Quindi, aggiungere sette microlitri di acetonitrile al 100% a tre piastre di cellule, contenenti due millilitri di terreno di crescita per ogni punto temporale, per fungere da controllo del veicolo. Incubare le piastre per ogni punto temporale designato.Scartare il terreno di coltura versandolo delicatamente. Sciacquare le cellule con tre millilitri di PBS e decantare o aspirare tra un risciacquo e l'altro. Pipettare un millilitro di un milligrammo per millilitro di colorante giallo lucifero disciolto in PBS in ciascuna piastra cellulare.Precaricare il colorante nelle celle pizzicando il bisturi tra l'indice e il pollice. Posizionare il bisturi perpendicolarmente al bordo della piastra di coltura e a cinque millimetri da esso, quindi utilizzare la gravità per consentire al bisturi di rotolare delicatamente da questo angolo perpendicolare a un angolo di 15 gradi. Fai rotolare la lama attraverso una popolazione di celle in tre diverse aree della piastra totale.Quindi, incubare le cellule con la soluzione LY per tre minuti a temperatura ambiente. Decantare o aspirare il LY e risciacquare le cellule per rimuovere tutto il colorante extracellulare ed eliminare la fluorescenza di fondo cellulare in eccesso. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di una soluzione di formalina tamponata con fosfato al 4% per fissare le cellule.Osserva le cellule fissate utilizzando un microscopio a epifluorescenza con ingrandimento 200x. Allineare tutte le piastre in modo che la linea di indentazione sia parallela al campo visivo orizzontale. Sono state generate una serie di immagini SL-DT di cellule epiteliali epatiche di ratto WB-F344 trattate con dosi crescenti di fenantrene.La diminuzione della migrazione del colorante fluorescente giallo lucifero è causata dall'aumento delle dosi di fenantrene, dimostrando l'aumento dell'inibizione indotta da sostanze tossiche della comunicazione intercellulare giunzionale gap, o GJIC. La frazione del controllo, o valori FOC, ottenuta dalle immagini SL-DT è stata mediata, analizzata statisticamente e quindi rappresentata graficamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i western blot di proteine di trasduzione singola, per rispondere a ulteriori domande.Ad esempio, questi composti attivano gli eventi mitogenici della perforazione cellulare?

gap-junctional-intercellular-communication-functional-biomarker-to

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

Descriviamo qui come eseguire una microiniezione cella singola di Lucifero giallo di visualizzare la comunicazione cellulare attraverso gap giunzioni nelle cellule viventi, e fornire alcuni suggerimenti utili. Ci aspettiamo che questo articolo vi aiuterà a tutti di valutare il grado di accoppiamento cellulare a causa di giunzioni funzionali. Tutto qui descritto potrebbe essere, in linea di principio, atto ad altri coloranti fluorescenti con peso molecolare inferiore a 1000 Daltons.

Microiniezione cella singola per l&#39;analisi cellulare comunicazione

Questa presentazione dimostra un metodo in cui l'elettroporazione di cellule aderenti e coltivate viene utilizzata per lo studio della comunicazione intercellulare e giunzionale, mentre le cellule crescono su un vetrino rivestito con ossido di indio-stagno conduttivo e trasparente.

Un test funzionale per Gap giunzionale esame; Elettroporazione di cellule aderenti su indio-Tin Oxide

I migliori saggi di neurotossicità in vitro aiuterebbero l'identificazione di nuovi composti neuroprotettivi. Viene presentata l'utilità di un analizzatore cellulare basato sull'impedenza in tempo reale per determinare la citotossicità e la citoprotezione nelle linee cellulari neuronali e per delineare il coinvolgimento delle vie del secondo messaggero, acquisendo così informazioni sul meccanismo della neuroprotezione.

Cell Analyzer a base di impedenza in tempo reale come strumento per delineare molecolari meccanismi coinvolti nella neurotossicità e neuroprotezione in una linea cellulare neuronale

I protocolli descrivono due sistemi di test in vitro di tossicità dello sviluppo (UKK e UKN1) a base di cellule staminali embrionali umane e studi trascrittoma. I sistemi di test prevedono pericolo tossicità per lo sviluppo umano, e possono contribuire a ridurre studi sugli animali, i costi e il tempo necessario per le prove della sicurezza chimica.

Umano cellule staminali pluripotenti Basato Tossicità per lo sviluppo saggi per Chemical Screening e Safety Systems Biology generazione dati

L'indagine sulla migrazione precoce delle cellule endoteliali (EEC) è importante per comprendere la fisiopatologia di alcune malattie e per identificare potenzialmente nuove strategie per l'intervento terapeutico. Il seguente protocollo descrive le tecniche per valutare la migrazione cellulare che sono state adattate per lo studio della CEE.

Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche tossiche

Qui, presentiamo un protocollo per un dosaggio di comunicazione intercellulare di romanzo gap junction progettato per lo screening ad alta resa di prodotti chimici di gap junction-modulanti per drug discovery e valutazione tossicologica.

Un saggio di comunicazione intercellulare Junction ioduro-giallo fluorescente proteina-Gap

Qui, presentiamo un protocollo basato sulla meccanica per interrompere la giunzione gap connexin 43 e misurare l'impatto successivo che questo ha sulla biomeccanica endoteliale attraverso l'osservazione di trazioni e sollecitazioni intercellulari.

Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale

Questo protocollo presenta una tecnica automatizzata ad alto rendimento basata su immagini per identificare i composti che modulano l'uccisione delle cellule di cancro al seno mediate da cellule natural killer in presenza di un anticorpo terapeutico anti-HER-2.

Test di screening ad alto contenuto per l'identificazione di composti modificanti la citotossicità cellulare anticorpo-dipendenti

Una tecnica di dissezione per la rimozione del giro dentato da topo adulto allo stereomicroscopio è stata dimostrata in questo video-registrato di protocollo.

Dissezione di giro dentato ippocampale di topo adulto

Scopri la tecnica di trasferimento del colorante fluorescente per misurare la comunicazione intercellulare attraverso le giunzioni comunicanti nelle cellule epiteliali epatiche WB-F344. Questo metodo semplice e rapido valuta gli effetti dei tossici sulla funzione delle giunzioni comunicanti.

Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali (Video) | JoVE Journal

Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

Esplora altri video