Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

L'obiettivo generale è quello di fornire un semplice test per misurare la comunicazione intercellulare giunzionale gap attraverso una popolazione di cellule di mammifero in grado di soddisfare un'ampia gamma di esigenze farmacologiche e tossicologiche in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tossicologia, come ad esempio se un composto influisce sullo sviluppo o sul mantenimento di un tessuto, disregolando la comunicazione intercellulare giunzionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre una valutazione semplice e rapida della funzione della giunzione gap in un'ampia popolazione di cellule in risposta a sostanze tossiche e tossine.

A dimostrare la procedura sarà Ajna Uzuni, un'assistente di ricerca universitaria del mio laboratorio. Per iniziare l'esperimento, seminare tre volte 10 al quinto WB-F344 cellule epiteliali del fegato di ratto su piastre di coltura di 35 millimetri di diametro contenenti il terreno modificato di Eagle più il 5% di siero fetale bovino. Coltivare le cellule in un incubatore fino a raggiungere il 100% di confluenza e continuare con il trattamento sperimentale delle cellule.

Per continuare con gli esperimenti dose-risposta, aggiungere 10 microlitri e 20 microlitri di una soluzione madre di fenantrene al 100% in acetonitrile precedentemente preparata e quattro microlitri, sei microlitri e otto microlitri di una soluzione madre da 20 millimolari di fenantrene in acetonitrile al 100% a tre piastre di cellule contenenti due millilitri di terreno di crescita per ogni volume aggiunto di soluzione madre. Quindi, aggiungere quattro microlitri, sei microlitri, otto microlitri, 10 microlitri e 20 microlitri di una soluzione al 100% di acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti due millilitri di terreno di crescita per ogni volume aggiunto di soluzione di acetonitrile che funge da controllo del veicolo. Dopo aver aggiunto l'acetonitrile, incubare le piastre.

Per eseguire esperimenti di risposta temporale, aggiungere sette microlitri di una soluzione madre da 20 millimolari di fenantrene in acetonitrile al 100% a tre piastre di cellule, contenenti due millilitri di terreno di crescita per ogni punto temporale. Quindi, aggiungere sette microlitri di acetonitrile al 100% a tre piastre di cellule, contenenti due millilitri di terreno di crescita per ogni punto temporale, per fungere da controllo del veicolo. Incubare le piastre per ogni punto temporale designato.

Scartare il terreno di coltura versandolo delicatamente. Sciacquare le cellule con tre millilitri di PBS e decantare o aspirare tra un risciacquo e l'altro. Pipettare un millilitro di un milligrammo per millilitro di colorante giallo lucifero disciolto in PBS in ciascuna piastra cellulare.

Precaricare il colorante nelle celle pizzicando il bisturi tra l'indice e il pollice. Posizionare il bisturi perpendicolarmente al bordo della piastra di coltura e a cinque millimetri da esso, quindi utilizzare la gravità per consentire al bisturi di rotolare delicatamente da questo angolo perpendicolare a un angolo di 15 gradi. Fai rotolare la lama attraverso una popolazione di celle in tre diverse aree della piastra totale.

Quindi, incubare le cellule con la soluzione LY per tre minuti a temperatura ambiente. Decantare o aspirare il LY e risciacquare le cellule per rimuovere tutto il colorante extracellulare ed eliminare la fluorescenza di fondo cellulare in eccesso. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di una soluzione di formalina tamponata con fosfato al 4% per fissare le cellule.

Osserva le cellule fissate utilizzando un microscopio a epifluorescenza con ingrandimento 200x. Allineare tutte le piastre in modo che la linea di indentazione sia parallela al campo visivo orizzontale. Sono state generate una serie di immagini SL-DT di cellule epiteliali epatiche di ratto WB-F344 trattate con dosi crescenti di fenantrene.

La diminuzione della migrazione del colorante fluorescente giallo lucifero è causata dall'aumento delle dosi di fenantrene, dimostrando l'aumento dell'inibizione indotta da sostanze tossiche della comunicazione intercellulare giunzionale gap, o GJIC. La frazione del controllo, o valori FOC, ottenuta dalle immagini SL-DT è stata mediata, analizzata statisticamente e quindi rappresentata graficamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i western blot di proteine di trasduzione singola, per rispondere a ulteriori domande.

Ad esempio, questi composti attivano gli eventi mitogenici della perforazione cellulare?