L'isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

L'obiettivo generale di questo metodo FINA, acronimo di Filtration Isolation, of nucleic acid, è quello di isolare il DNA genomico per l'amplificazione PCR da campioni complessi in modo rapido e semplice, senza l'uso di strumentazione di laboratorio come una centrifuga. Questo metodo di estrazione rapida del DNA virale dell'HIV pro carta è stato sviluppato per essere incorporato in un dispositivo diagnostico PCR quantitativo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i moduli di preparazione dei campioni e le provette per PCR possono essere preparati in anticipo, quindi l'estrazione del DNA richiede meno di due minuti.

Per prima cosa abbiamo sviluppato questo metodo da incorporare in un campione per rispondere al test diagnostico precoce del bambino per l'HIV-1 dal sangue del tallone. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché la rimozione del supporto del nastro biadesivo che tiene la membrana di cattura cellulare sul lato della provetta PCR richiede pratica. A dimostrare la procedura sarà Jen Reed, un tecnico senior del mio laboratorio.

Iniziare questa procedura preparando i materiali necessari per l'assemblaggio del modulo di preparazione del campione FINA. Preparare il tampone assorbente tagliando un quadrato di 35 x 35 millimetri di un batuffolo di cotone 100% spesso 2,6 millimetri. Preparare un film di paraffina di plastica con un nastro di carta.

Tagliare un pezzo di pellicola di paraffina di 25 x 50 mm e poi utilizzare un martello per praticare un foro di 7,14 mm di diametro al centro del nastro. Preparare una membrana di separazione del sangue in vetro legato o un disco di cattura utilizzando un martello per perforare un cerchio di 8,35 mm di diametro. Per assemblare il modulo di preparazione del campione FINA, utilizzare una pinza per posizionare il disco di acquisizione al centro del tampone assorbente.

Rimuovere il supporto del nastro di paraffina e posizionarlo sopra il disco di acquisizione in modo che l'intero nastro di paraffina lasci esposto il centro del disco di acquisizione. Garantire il massimo contatto tra il disco e il tampone assorbente allungando leggermente il nastro di paraffina per coprire il tampone assorbente e premendo saldamente il nastro di paraffina per incollarlo al tampone assorbente attorno a tutti i bordi del disco. È necessario un disco a nastro da 5,1 mm per ancorare la membrana di cattura al lato della provetta qPCR per evitare che la membrana blocchi il rilevamento della fluorescenza dello strumento PCR in tempo reale.

Preparare questo disco a nastro utilizzando un martello per perforare un cerchio di nastro diagnostico in poliestere a doppio rivestimento da un foglio di nastro. Usando una pinza, rimuovi un lato del rivestimento dell'adesivo del nastro. Metti il nastro in una provetta PCR da 200 microlitri, incollandola su un lato e verso il fondo della provetta.

Rimuovere il secondo rivestimento adesivo. Il tubo è ora pronto per ricevere il disco preparato. In questo video verrà dimostrata la rilevazione del DNA provirale da sangue intero addizionato con cellule LAV 8e5.

Scongelare i pellet di cella 8e5 LAV precedentemente congelati con ghiaccio. Preparare una diluizione seriale delle cellule in mezzo di congelamento con concentrazioni comprese tra 1 e 400 cellule per microlitro. Pipettare 10 microlitri di cellule da ciascuna delle diluizioni in una provetta per microcentrifuga.

Aggiungere 100 microlitri di campione di sangue intero fresco trattato con eDTA HIV-1 negativo a ciascuna provetta per creare una curva standard. Mescolare muovendo delicatamente il fondo del tubo cinque volte. Per iniziare la procedura di estrazione del DNA, lisare le cellule del sangue aggiungendo tritone X-100 a una concentrazione finale dell'uno percento.

Mescolare muovendo delicatamente il fondo del tubo cinque volte. Il sangue dovrebbe diventare di un rosso traslucido. Pipettare l'intero campione di sangue sul disco di cattura.

Una tenuta stagna tra il nastro di paraffina e la membrana di cattura assicura che il sangue scorra attraverso la membrana. Inoltre, il buon contatto tra la membrana di contatto e il gruppo tampone assorbente garantisce una rapida evacuazione del campione. Lasciare che il campione penetri attraverso il filtro.

Il lisato del sangue si è impregnato nel disco di cattura e il disco appare opaco. Aggiungere da 600 a 1.000 microlitri di idrossido di sodio da 10 mmol goccia a goccia sul disco di cattura. Il filtro cambierà da rosso a bianco, indicando la clearance dell'emoglobina.

Quindi separare il disco dal tampone assorbente e applicare il disco al nastro nella provetta PCR preparata. Dopo che il filtro è stato posizionato nella provetta per PCR, analizzare immediatamente il campione. Preparare la miscela master qPCR come descritto nel testo del protocollo e assicurarsi che il filtro sia completamente coperto con la miscela master e rimanga fissato al lato della provetta per tutta la durata della reazione.

Eseguire l'amplificazione utilizzando un dispositivo PCR in tempo reale come descritto nel testo del protocollo. In alternativa, se non è possibile eseguire la qPCR, asciugare immediatamente il filtro durante la notte in una scatola contenente essiccante al solfato di calcio. Il giorno seguente, tappare e posizionare la provetta per PCR in una busta laminata con essiccante di silice e conservarla a temperatura ambiente fino al momento dell'analisi.

Questo metodo consente un'efficiente amplificazione del provirus HIV-1 da cellule LAV 8e5 a diversi numeri di copie. Le linee continue sono grafici di amplificazione ottenuti da quattro repliche di sangue intero HIV-1 negativo con 4.000, 400, 40 e 10 cellule LAV 8e5 con 500 copie per reazione del controllo interno. La linea tratteggiata indica la soglia.

Il grafico seguente mostra le curve standard dei valori del ciclo di quantificazione calcolati dal grafico di amplificazione vs. log numero di copie di 8e5 cellule LAV per 100 microlitri di sangue intero. L'efficienza PCR calcolata è stata del 103%Le repliche della curva standard del DNA provirale dell'HIV hanno anche un'amplificazione altamente riproducibile.

Inoltre, la presenza di un controllo interno di 500 copie di idrossipiruvato reduttasi mostra che non vi è inibizione della PCR derivante dall'estrazione del sangue con questo metodo, indipendentemente dal numero di copie del provirus HIV-1 presenti. Le linee continue rappresentano i grafici di amplificazione e la linea tratteggiata rappresenta la soglia. Seguendo questa procedura, i bersagli della PCR possono essere amplificati da vari tipi di campioni per rilevare il gene di interesse.

Ad esempio tamponi guanciali per lo screening farmacogenetico o sangue per la genotipizzazione rapida di modelli animali. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni trasmessi dal sangue può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni universali durante l'esecuzione di questa procedura.