Imaging fluorescente combinata vicino infrarosso e la tomografia micro-computerizzata per Direttamente Visualizzazione cerebrale tromboembolie

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging diretto del trombo è quello di visualizzare in modo quantitativo tromboemboli cerebrali marcati con fluorocromi in vivo e ex vivo, utilizzando nanoparticelle d'oro, tomografia computerizzata e imaging fluorescente nell'infrarosso vicino. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'emostasi e della trombosi, come la risposta ortopedica grave e dipendente dal tempo o dalla dose dei tromboemboli cerebrali all'attivatore del plasminogeno tissutale o ad altri nuovi agenti trombolitici in fase di studio. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che, dopo l'iniezione endovenosa di nanoparticelle d'oro, la micro-TC ad alta risoluzione permette di catturare l'evoluzione dinamica dei tromboemboli cerebrali visualizzandone posizione e carico in modo quantitativo in vivo, confermato successivamente da imaging fluorescente del trombo ex vivo.

La procedura sarà dimostrata da Jeong-Yeon Kim, un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio. Dopo aver raccolto da 300 a 1.000 microlitri di sangue arterioso mediante puntura cardiaca, aggiungere 70 microlitri del campione a 30 microlitri del fattore di coagulazione attivato appropriato, 13 mediato sonda fluorescente sensibile all'attività di cross-linking del fibrinogeno, quindi caricare una siringa da tre millilitri, dotata di un ago da 23 gauge, con la miscela ottenuta. Successivamente, iniettare il sangue etichettato in un tubo di polietilene lungo 20 centimetri e lasciare che il sangue coaguli a temperatura ambiente.

Dopo due ore, trasferire il tubo a quattro gradi Celsius per 22 ore, quindi tagliare il tubo in pezzi da 1,5 centimetri. Utilizzando una siringa da tre millilitri riempita con PBS, espellere il trombo da ciascun pezzo di tubo in singole pozzette di una piastra a sei pozzette contenente PBS. Lavare i trombi tre volte con PBS, quindi inserire una siringa da un millilitro riempita di soluzione salina e dotata di un ago da 30 gauge in un'estremità di un tubo PE10 da 15 centimetri e aspirare con attenzione un singolo trombo lavato nell'estremità opposta del tubo.

Quindi, collegare il tubo PE10 caricato con trombo a un tubo PE50 lungo tre centimetri con estremità conica dal diametro di 200 micron. Dopo aver confermato l'anestesia mediante l'assenza di risposta alla compressione delle dita dei piedi, disinfettare l'area chirurgica con Betadine e alcol al 70% ed utilizzare un bisturi per effettuare un'incisione verticale di un centimetro tra l'orecchio sinistro e l'occhio. Incollare l'estremità distale della fibra ottica di un flussimetro Doppler sulla superficie esposta dell'osso temporale sinistro, un millimetro a sinistra e quattro millimetri sotto il bregma, e iniziare il monitoraggio Doppler.

Quindi effettuare un'incisione mediana verticale di tre centimetri attraverso i tessuti molli perivascolari per esporre l'area del bulbo carotideo sinistro. Utilizzando un filo di seta nero sterile 6-0, legare l'arteria carotide comune prossimale sinistra, seguita dalla legatura dell'arteria carotide interna sinistra e dell'arteria pterigopalatina sinistra con fili di seta neri sterili 7-0. Mediante una cauterizzazione elettrica monopolare, cauterizzare l'arteria tiroidea superiore sinistra, quindi utilizzare fili di seta neri sterili 7-0 per legare in modo lento l'arteria carotide esterna prossimale sinistra e in modo stretto l'estremità distale del vaso.

Utilizzare forbici microchirurgiche per praticare un foro di 0,2-0,25 micron tra i siti legati dell'arteria carotide esterna e inserire il catetere contenente il trombo nel foro, allentando al contempo la legatura prossimale dell'arteria carotide esterna. Avanzare il catetere all'interno dell'arteria carotide comune per fissarlo in posizione e stringere nuovamente la legatura prossimale dell'arteria carotide esterna. Recidere l'estremità distale dell'arteria carotide esterna mediante cauterizzazione e ruotare l'estremità prossimale libera dell'arteria carotide esterna in senso orario per allineare il vaso con l'arteria carotide interna, ritirando contemporaneamente il catetere.

Quindi, allentare la legatura dell'arteria carotide interna e avanzare immediatamente il catetere di circa nove millimetri fino alla biforcazione tra l'arteria cerebrale media e l'arteria cerebrale anteriore. A questo punto, stringere nuovamente il punto di sutura dell'arteria carotide interna intorno al catetere e premere delicatamente sulla siringa per iniettare il trombo nella zona della biforcazione. Se sul Doppler si osserva un flusso ematico inferiore o uguale al 30% rispetto al valore basale, rimuovere il catetere e legare immediatamente l'estremità prossimale dell'arteria carotide esterna.

Per eseguire l'imaging del trombo mediante tomografia computerizzata microscopica al punto temporale sperimentale appropriato, diluire i nanoparticelli d'oro specifici per la fibrina fino a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro in PBS 10 millimolare e sottoporre l'agente di imaging per trombi a sonificazione per 30 minuti per garantire una sospensione omogenea dei nanoparticelli. Successivamente, iniettare 300 microlitri dei nanoparticelli specifici per la fibrina nella vena peniena dell'animale sperimentale. Trasferire l'animale sul lettino dell'apparecchio di micro-TC e utilizzare un filo fissato a un perno per tirare delicatamente i denti anteriori superiori, in modo da distendere il collo.

Cinque minuti dopo l'iniezione delle nanoparticelle d'oro, iniziare l'acquisizione delle immagini. Per visualizzare il trombo mediante imaging ex vivo nell'infrarosso vicino, posizionare il tessuto cerebrale asportato nell'apparecchio di imaging con la base rivolta verso l'alto. Acquisire immagini dei tromboemboli marcati con fluoroforo nelle arterie del poligono di Willis.

Quindi, posizionare il tessuto con il vertice rivolto verso l'alto e acquisire immagini dei tromboemboli corticali. Idratare il tessuto con alcune gocce di soluzione salina, quindi, utilizzando il dispositivo per matrice cerebrale seguendo le istruzioni del produttore, ottenere rapidamente sei sezioni cerebrali coronali spesse due millimetri. Mantenendo le sezioni idratate con soluzione salina, acquisire ulteriori immagini nell'infrarosso vicino di entrambe le superfici anteriore e posteriore delle sezioni.

Per quantificare l'area del trombo dopo l'acquisizione con micro-TC, aprire i file della sequenza di immagini e selezionare Image, quindi Type, quindi 8-bit per convertire le immagini in scala di grigi a 8 bit. Quando un pixel dei file di immagine TC corrisponde a 0,053 millimetri, utilizzare Analyze Set Scale per inserire uno, 0,053 e millimetri rispettivamente nei campi Distanza in pixel, Distanza nota e Unità di lunghezza. Successivamente, sotto Edit, scegliere Selection, quindi Specify, per posizionare un'area di interesse su una regione del parenchima cerebrale priva di trombo o di aree iperdense correlate a tessuto osseo.

Poiché la regione di interesse specificata si applica a ogni sezione della serie, verificare che la regione non si sovrapponga a una zona iperdensa in nessuna delle sezioni. Quindi, sotto Plugin, selezionare Region of Interest e Sottrazione dello Sfondo dalla Region of Interest e inserire due per il Numero di deviazioni standard rispetto alla media. Individuare lesioni iperdense correlate a tromboemboli e ingrandire l'area lesionale.

Ora, selezionare Immagine, quindi scegliere Regola e Soglia, inserendo un valore di soglia inferiore pari a 22 e un valore di soglia superiore pari a 255. Selezionare Sotto/Sopra per visualizzare i pixel al di sotto del valore di soglia inferiore in blu, i pixel compresi nella soglia in scala di grigi e i pixel al di sopra del valore di soglia superiore in verde. Successivamente, utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per delimitare aree di interesse che circondino le lesioni iperdense correlate ai tromboemboli, evitando qualsiasi zona ossea.

Utilizzare Analizza, Imposta misurazioni per selezionare Area, Valore medio di grigio e Densità integrata (area per media). Selezionare le seguenti opzioni: Limita alla soglia e Mostra etichetta. Utilizzare Analizza Misura per ottenere i dati quantificati, quindi salvare i risultati.

Queste immagini di micro-TC di base sono state ottenute in vivo cinque minuti dopo l'iniezione di nanoparticelle d'oro rivestite con fibrina, un'ora dopo un ictus embolico nei topi. Il trombo cerebrale può essere chiaramente visualizzato nell'area della biforcazione tra l'arteria cerebrale media e l'arteria cerebrale anteriore a livello della porzione distale dell'arteria carotide interna. Le immagini di micro-TC di follow-up mostrano assenza di modifiche del trombo nel circolo di Willis negli animali trattati con soluzione fisiologica; tuttavia, negli animali trattati con attivatore del plasminogeno tissutale, si osserva una progressiva dissoluzione del trombo nel circolo di Willis nel tempo, indicata dalle frecce blu.

Esiste una forte correlazione tra la densità riscontrata con la tomografia computerizzata in vivo e l'imaging nel vicino infrarosso ex vivo per i tromboemboli residui a 24 ore. Ad esempio, in queste immagini le aree iperdense alla micro-TC, visualizzate mediante particelle d'oro che bersagliano il fibrinogeno, corrispondono direttamente alle aree di segnale nel vicino infrarosso identificate da una sonda fluorescente sensibile all'attività di legame incrociato del fattore XIII della coagulazione, che si lega al trombo durante il processo di maturazione del coagulo preformato. Inoltre, come mostrato in queste immagini, la colorazione con TTC può essere utilizzata per valutare gli effetti della trombolisi nel danno cerebrale ischemico in animali trattati con soluzione salina di controllo rispetto a quelli trattati con attivatore del plasminogeno tissutale.

Una volta padroneggiata, questa tecnica di imaging micro-CT in vivo e di imaging fluorescente nel vicino infrarosso ex vivo dei trombi può essere eseguita in circa un'ora, se effettuata correttamente e quando le sonde di imaging sono disponibili. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di utilizzare nanoparticelle d'oro non aggregate e specifiche per la fibrina per l'imaging diretto dei trombi cerebrali basato su micro-CT. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la microscopia elettronica o la spettrometria di massa con plasma accoppiato induttivamente (ICPMS), al fine di rispondere ad ulteriori domande riguardanti la distribuzione tissutale e la cinetica ematica delle nanoparticelle d'oro.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ictus o della ricerca cardiovascolare per esplorare il tromboembolismo in modelli animali predisposti alla trombosi coronarica o all'infarto cerebrale embolico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare coaguli marcati con fluorocromi per lo studio dell'ictus tromboembolico nei topi ed eseguire imaging seriale e quantificazione dei tromboemboli cerebrali in vivo e successivamente ex vivo, monitorando così l'evoluzione del trombo.