Name: Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Impara a eseguire imaging volumetrico di cuori intatti a risoluzione di singola cella utilizzando tecniche di tissue clearing e marcatura fluorescente. Questo metodo semplice ed economico consente di studiare la funzione genica durante lo sviluppo cardiaco.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo i membri del laboratorio M.W. per la discussione scientifica. Questo lavoro è supportato dall'AHA [13SDG16920099] a M.W. e dalle sovvenzioni del National Heart, Lung, and Blood Institute [R01HL121700] a M.W. Le immagini sono state catturate nell'Imaging Core Facility dell'Albany Medical College.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali (IACUC) a Albany Medical College ed eseguite secondo la guida NIH per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Preparazione della soluzione NOTA: Il Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linee di topo sono state acquistate sul mercato cTnT-Cre 18 è stato un dono dal Dott Jiao presso l&#39;Università di Alabama NFATc1-Cre.. era un dono di Dr. Bin Zhou all&#39;Albert Einstein college of Medicine 19. I topi sono stati sacrificati per inalazione di anidride carbonica in un locale chiuso per almeno 60 secondi seguiti da mezzi fisici di verifica morte per toracotomia bilaterale, decapitazione o dislocazione cervicale. <ol><li> Preparare Tamoxifen. Sciogliere 10 mg di tamoxifene in 10 ml di oi semi di girasolel. Una volta che si è completamente sciolto, aliquotare e conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Sciogliere Na 2 HPO 4 (1,41,96 mila g), KH 2 PO 4 (0,24,496 mila g), NaCl (8,0669 g) e KCl (0,20,129 mila g) in 1 L di acqua distillata e regolare il pH a 7,4. </li><li> Preparare PBST: 0.1% Tween-20 soluzione in PBS sciogliendo 100 ml di Tween-20 in 100 ml di PBS. </li><li> Preparare tampone di bloccaggio. Rendere 3% di siero albumina bovina (BSA) soluzione bloccante sciogliendo 3 g di BSA in 100 ml di PBST contenente 0,2% Tween-20. </li><li> Preparare CUBIC-1 (reattivo 1). Mescolare 25% in peso di urea, 25% in peso di N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis etilendiammina (2-idrossipropil) e il 15% in peso di Triton X-100 in dH 2 O. </li><li> Preparare CUBIC-2 (reattivo 2). Mescolare 50 wt% di saccarosio, 25% in peso di urea, 10% in peso di 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotrietanolo e lo 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH 2 O. </li><li> Preparare Sca le A2: 4 M urea, 10% w / v di glicerolo e 0,1% w / v Triton X-100 in DH 2 O. Regolare il pH a 7,7. </li><li> Preparare Sca le B4: 8 M urea e 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Regolare il pH a 8,7. </li><li> Preparare Sca le 70: 4 M urea, 70% w / v di glicerolo e 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. </li></ol> 2. Tamoxifen Induzione, isolamento degli embrioni e la fissazione <ol><li> Tamoxifene Induzione e isolamento Embryo <ol><li> Utilizzando un protocollo sondino ricurvo approvato (ACUP 13-12.007), sonda gastrica i topi di sesso femminile R26Cre ERT2 Confetti (collegato da R26Cre ERT2 topi maschi) con 10 mg / g di Tamoxifen al giorno embrionale di sviluppo E7.75 33. Al giorno embrionale 9,5 (E9.5) o E10.5, eutanasia i topi femmina con CO 2 e dislocazione cervicale. </li><li> Dopo la verifica della morte del mouse (vedi Sezione 1 Nota), aprire il mouse cavità addominale con le forbici e sezionare il corno uterino, rimuovere gli strati di tubo uterino con l&#39;aiuto di forbici e pinzette, e reaffittare gli embrioni dal 23,24 tuba uterina. <ol><li> Trasferire gli embrioni di una capsula di Petri contenente PBS (pH 7,4). Sotto il microscopio da dissezione, rimuovere gli strati non-embrionali (chorion, sacco vitellino e amnion) con l&#39;aiuto di una pinzetta. </li></ol></li><li> Utilizzando le pinzette e forbici, raccogliere i campioni femminili del mouse e della coda degli embrioni per la genotipizzazione come riportato in precedenza 22. Usando una pipetta di plastica, trasferire ogni embrione in un pozzetto di una piastra ben 48 contenente 1 ml di PBS 1x. </li><li> Sotto un microscopio a fluorescenza, identificare le GFP / RFP / CFP embrioni positivi tramite un microscopio invertito con una macchina fotografica. Sbucciare via il pericardio con una pinzetta e ruotare il cuore / embrione con l&#39;aiuto di pinzette ricurve per determinare il numero di cloni fluorescenti su entrambi i lati del cuore con i filtri GFP / RFP / CFP. Non sono necessari tagli. </li></ol></li><li> Dopo aver identificato GFP / RFP / CFP embrioni positivi, lavare rapidamente gli embrioni per due volte (2 min ciascuna) con PBS 1x in the 48 ben piastra su un agitatore a temperatura ambiente (RT). Questo rimuoverà il sangue in eccesso. </li><li> Fissare l&#39;embrione / cuore embrionale utilizzando 4% paraformaldeide (PFA) a temperatura ambiente. Il tempo di fissazione dipende dall&#39;età e del tessuto dimensioni embrionale. Per E9.5 fissare l&#39;embrione per 2 ore a temperatura ambiente. Gli embrioni fase embrionale fine richiedono un tempo più lungo di fissazione, che può anche essere prolungata fino a 24 ore per il cuore postnatale. ATTENZIONE: Paraformaldeide è tossico, evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. </li><li> Dopo la fissazione, lavare l&#39;embrione / cuore nel 48 ben piatto due volte (10 minuti ciascuno) con 1x PBS su un agitatore a temperatura ambiente. Questo rimuove l&#39;eccesso di PFA dall&#39;embrione / cuore. Gli embrioni vengono poi ulteriormente trattati per tutto il monte di colorazione e di compensazione dei tessuti. </li></ol> 3. monte intero colorazione NOTA: Dopo PFA fissaggio l&#39;embrione / cuore è sottoposto a tutto il monte colorazione come segue. <ol><li> Permeabilize l&#39;embrione / cuore in un 48 ben piastra con 1 ml di 0,1% PBST per 2 ore su piastra agitatore a RT. </li><li> A seguito di permeabilizzazione, immergere l&#39;embrione / cuore in 1 ml di tampone di bloccaggio, per 2 ore o durante la notte su un agitatore a 4 ° C. </li><li> Immergere l&#39;embrione / cuore al endoteliali cellule-specifiche anticorpi PECAM (CD31), diluito (1: 100) in 0,3 ml di tampone di bloccaggio per 48 ore su piastra agitatore a 4 ° C. </li><li> Lavare l&#39;embrione / cuore con PBST 5 volte, 30 min ciascuno a temperatura ambiente sulla piastra shaker. Ciò elimina la non-specifico anticorpo primario legato in eccesso dal tessuto. </li><li> Immergere l&#39;embrione / cuore in Alexa Fluor 647 capra anticorpo secondario anti-topo, diluito (1: 1.000) in 1 ml di tampone di bloccaggio per 48 ore su piastra agitatore a 4 ° C. </li><li> Ripetere il passaggio 3.4 per lavare l&#39;anticorpo secondario. </li><li> Post-fix l&#39;embrione / cuore con 4% PFA per 1 ora a temperatura ambiente sulla piastra shaker e lavare due volte con PBS 5 minuti ciascuno. </li><li> Colorare l&#39;embrione / cuore con la macchia nucleare di 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (diluito in PBST a concentrazione di 0,01 mg / ml) per 10 min a tavola oscillante a RT. Seguire con due lavaggi PBS su 5 minuti ciascuno. </li></ol> 4. Embrione / Clearing cuore con Sca l e o metodo CUBIC NOTA: dopo tutto il monte colorazione, l&#39;embrione / cuore è sottoposto sia alla Sca le o il metodo del tessuto compensazione cubi. La scelta del metodo dipende dalle dimensioni del tessuto ed età embrionale. Per E11.5 o embrioni età precedenti, l&#39;uso Sca l e metodo tessuto compensazione, mentre per gli embrioni di età superiore o cuori postnatali il metodo tessuto compensazione CUBIC è preferito. <ol><li> Scala del tessuto Metodo Clearing <ol><li> Incubare l&#39;embrione / cuore con 1 ml di Sca l soluzione e A2 in un flaconcino scintillazione (avvolti in carta stagnola) con occasionali agitando delicatamente (a mano) per 48 ore a 4 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione Sca l e A2, incubare l&#39;embrione / cuore con 1 ml di Sca l soluzione e B4 a 4 ° C nella stessa fiala con occasionali agitando delicatamente per anotil suo 48 hr. </li><li> Incubare l&#39;embrione / cuore per un altro 48 ore con 1 ml Sca l e 70 a 4 ° C con occasionale agitazione delicata. Monte embrione utilizzando il 90% di glicerolo (vedere paragrafo 5.1). </li></ol></li><li> CUBIC tessuto Metodo Clearing <ol><li> Per tutta la dell&#39;embrione / cuore compensazione cubo, immergere ogni embrione / cuore in 1 ml di Cubic-1 con occasionali delicata agitazione per 48 ore a 37 ° C 7. Dopo 48 ore, sostituire la soluzione con lo stesso volume di reagente CUBIC fresco 1, e incubare il campione per ulteriori 48 ore a 37 ° C, con occasionale agitazione con mano. </li><li> Lavare il CUBIC-1 trattati cuore / embrione con PBS 1X diverse volte a temperatura ambiente agitando delicatamente con la mano. Questo rimuove l&#39;eccesso di soluzione CUBIC-1. </li><li> Dopo aver lavato i cubico-1 con PBS, immergere gli embrioni / cuori in CUBIC-2 soluzione (1 g per dell&#39;embrione / cuore) per 48 ore a 37 ° C con occasionali agitando delicatamente con la mano. Questo segue dell&#39;embrione / montaggio con glicerolo cuore (vedi sezione 5.2). </li></ol></li></ol> 5. Montaggio del campione e Imaging NOTA: Gli embrioni o organi eliminato in Sca l e 70 o cubica-2 soluzione possono essere esposte direttamente con scala 70 e Cubic-2 soluzione come il mezzo di imaging, rispettivamente. Tuttavia, considerando la vulnerabilità dei campioni embrionali ai reagenti di compensazione, se i campioni non sono essere ripreso immediatamente, ma conservati a lungo termine, conservare i campioni a 90% glicerolo seguendo il protocollo di seguito. <ol><li> Direttamente immergere la Sca Le cancellata campione in 1 ml di 90% glicerolo e conservare a 4 ° C fino imaging. </li><li> Lavare il campione trattato cubica con PBS 1x due volte, 5 min ciascuna e sequenzialmente incubare il campione con 1 ml di 30%, 50%, 70% e soluzione di glicerolo 90% ciascuno per 30 min. </li><li> Per l&#39;imaging, trasferire il campione a fondo piatto di vetro Petri con una quantità minima di 90% glicerolo e illustrati cloni con un microscopio confocale equipaggiato con due funzionalità fotoni. </li><li> Immagine cuore o embrione in glicerolo con un / 0.3 NA 10X, 25X un / 0.8 NA immersione, o di una lente obiettivo correttiva 40X / 1.2 NA acqua. Immagine DAPI utilizzando 2-fotoni da un titanio coerente: zaffiro laser camaleonte. La scelta del microscopio e lente obiettivo dipenderà dallo scopo degli esperimenti, ad esempio per super-risoluzione, un microscopio a fluorescenza foglio leggero potrebbe essere utilizzato. </li></ol>

<ol><li>Vincent, S. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+heart%3A+the+origin+and+regulation+of+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells.</a> Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+discoveries+in+cardiac+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A decade of discoveries in cardiac biology.</a> Nat Med. 10, 467-474 (2004).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+in+the+evolution+and+development+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart.</a> Science. 313, 1922-1927 (2006).</li>
<li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+high-resolution+episcopic+microscopy+%28HREM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).</li>
<li>Soufan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+gene+expression+patterns+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development.</a> Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916(2012).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+genetic%2Fpharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Agah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+recombination+in+postmitotic+cells.+Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+cardiac-restricted%2C+site-specific+rearrangement+in+adult+ventricular+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo.</a> J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).</li>
<li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151, 1083-1096 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+spindle+orientation+controls+cell+entry+into+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium.</a> Dev Cell. 19, 114-125 (2010).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+family+proteins+are+essential+for+cardiac+morphogenesis+and+progenitor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation.</a> Development. 141, 281-295 (2014).</li>
<li>Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li>
<li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterior+heart-forming+field%3A+voyage+to+the+arterial+pole+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart.</a> Trends Genet. 18, 210-216 (2002).</li>
<li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle%2C+outflow+tract%2C+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary%2Fanterior+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Dev Biol. 287, 134-145 (2005).</li>
<li>Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+secondary+heart+field+leads+to+tetralogy+of+Fallot+and+pulmonary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia.</a> Dev Biol. 284, 72-83 (2005).</li>
<li>Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-acting+regulatory+sequences+governing+Wnt-1+expression+in+the+developing+mouse+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS.</a> Development. 120, 2213-2224 (1994).</li>
<li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural%5BTitle%5D)+AND+%22Developement%22%5BJournal%5D)">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Developement. 127, 1607-1616 (2000).</li>
<li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat Rec. 201, 157-168 (1981).</li>
<li>Wu, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+family+proteins%3A+novel+players+in+cardiac+morphogenesis+and+cardiac+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+concepts%22%5BJournal%5D)">Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation.</a> Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Lineage+Tracing+Reveals+that+Oriented+Cell+Division+Contributes+to+Trabecular+Morphogenesis+and+Regional+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification.</a> Cell reports. 15, 158-170 (2016).</li>
<li>Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+thermal-+and+chemical-induced+denaturation+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).</li>
<li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. , (2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L&#39;isolamento embrione è un passo molto importante. embrioni E9.5 sono molto fragili e di piccole dimensioni, in modo da la cura dovrebbe essere presa per non danneggiare le strutture dell&#39;embrione / cardiaci durante l&#39;isolamento. Gli strati aggiuntivi non embrionali che avvolgono l&#39;embrione / cuore devono essere rimossi con attenzione soprattutto quando l&#39;imaging tutta dell&#39;embrione. Questo permette la penetrazione di anticorpi e di compensazione miscela in profondità all&#39;interno dei tessuti ...

Morfogenesi cardiaca è un evento sequenziale che richiede l&#39;organizzazione spaziotemporale di quattro diversi tipi di cellule progenitrici cardiache in settori distinti del cuore, e richiede anche più reti di regolazione genetica di orchestrare questo processo per formare il 1,2 cardiaca funzionale. Cardiac specificazione, differenziazione, patterning, e la maturazione della camera sono regolati da fattori di trascrizione cardiogeno 3. Mutazione genetica o aberrazione posttranscriptional di questi fattori nelle cellule progenitrici cardiache possono provocare sia letalità embrionale o difetti cardiaci congeniti (CHD) 4. Lo studio della morfogenesi cardiaca richiede una comprensione dei dettagli inerenti strutturali in tre dimensioni (3D) e singola etichetta lignaggio cellule progenitrici cardiache tracciamento durante lo sviluppo cardiaco promuoverà la comprensione della morfogenesi cardiaca. Un certo numero di sezione metodi basati tomografia ad alta risoluzione sono stati sviluppati in the negli ultimi decenni a immagine Struttura organo 5,6; tuttavia, questi metodi richiedono costosi, strumenti specializzati, il lavoro esteso, e la mancanza di organizzazione strutturale dettagliata alla risoluzione di singola cellula nel volumetrico finale ricostruita immagine 7,8. L&#39;imaging volumetrico 3D a livello di singola cellula fornisce un mezzo per studiare la differenziazione delle cellule progenitrici e comportamento cellulare in vivo 7. Tuttavia, la luce tessuto dispersione rimane l&#39;ostacolo principale per l&#39;imaging cellule e strutture in 3D in profondità all&#39;interno del cuore intatto. I lipidi sono una fonte importante di diffusione della luce, e la rimozione dei lipidi e / o regolazione della differenza di indice di rifrazione tra i lipidi e le aree circostanti sono potenziali approcci per aumentare la trasparenza del tessuto 8. Negli ultimi anni, un certo numero di metodi di compensazione del tessuto sono stati sviluppati, che riducono l&#39;opacità dei tessuti e diffusione della luce, come BABB (alcool benzilico e benzile benzoate miscela) e DBE (tetraidrofurano e dibenzylether); ma in questi metodi, fluorescenza quenching rimane un problema 8-10. Il solvente basa metodi idrofili, come SeeDB (fruttosio / thioglycerol) e 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), conserva segnali fluorescenti, ma non rende l&#39;intero organo trasparente 7,8,11. In confronto, il metodo tessuto-clearing CLARITY rende l&#39;organo trasparente, ma richiede un dispositivo per elettroforesi specializzata per rimuovere i lipidi 8,12, come fa PACT (tecnica passiva chiarezza), che richiede anche idrogel incorporamento 7,13. Per informazioni dettagliate su tutti i metodi di tessuto-compensazione disponibili, fare riferimento alla Tabella 1 a Richardson e Lichtman, et al. 7. Nel 2011, Hama et al. Casualmente scoperto una miscela idrofila &#39;Sca Le&#39; (urea, glicerolo e Triton X-100 miscela) che rende il cervello di topo ed embrione traspaent mentre completamente preservando segnali fluorescenti da cloni etichettati 14. Questo permette l&#39;imaging del cervello intatto ad una profondità di diversi millimetri e ricostruzione su larga scala di popolazioni neuronali e proiezioni a una risoluzione subcellulare. Susaki et al. ulteriormente migliorata Sca Le aggiungendo amminoalcoli e sviluppato il &#39;cubica (chiare, senza ostacoli cocktail di brain imaging e analisi computazionale) Metodo tessuto compensazione, che ha aumentato la solubilizzazione fosfolipide, riduzione dei tempi di compensazione, e ha permesso per l&#39;imaging a fluorescenza multicolore 8. Nel presente studio, approfittando della Sca Le e Cubic tecniche del tessuto di compensazione e alta risoluzione sezionamento ottico 3D, i singoli cloni all&#39;interno del cuore durante cardiogenesis sono stati rintracciati utilizzando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong&gt; NFATc1-Cre 19, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linee di mouse. La combinazione del metodo tutto il monte colorazione (WMS) sviluppato in precedenza 21,22 con metodi di compensazione tessuto ulteriormente consentiti per la colorazione di altre proteine in cloni etichettati e per lo studio del loro comportamento in un contesto volumetrica 3D. La combinazione di compensazione tessuti e WMS permette una migliore comprensione dei ruoli dei diversi geni e proteine ​​durante lo sviluppo cardiaco, e l&#39;eziologia di difetti cardiaci congeniti. Questo protocollo può essere applicato per studiare altre differenziazione di cellule progenitrici, comportamento cellulare, ed eventi morfogenesi organo durante lo sviluppo.

<table><tbody><tr><td>2,2&primo;,2&primo; '-nitrilotritetanolo&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide in PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP16000</tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrakis(2-idrossipropil) etilendiammina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich 122262</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato soluzione salina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Olio di semi di girasole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>550274</tr><tr><td>Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI colorazione nucleare</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37oC Incubatore</td><td>Thermoscientific Fischer</td><td>Heratherm, incubatori microbiologici compatti piastre a</td><td></td></tr><tr><td>48 pozzetti</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>bilancia analitica</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 microscopio confocale</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio sezionatore</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Sterilizzatore di perline di vetro</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Coppia di forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 60 mm x15 mm&nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Rocker II&nbsp; Piattaforma a bilanciere</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Tubi scintillanti</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging azzerato embrionale e postnatale cuori a risoluzione di una singola cella

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Singolo tracing clonale e analisi a livello intero cuore può determinare il comportamento delle cellule progenitrici cardiache e differenziazione durante lo sviluppo cardiaco, e consentire lo studio delle basi cellulari e molecolari della morfogenesi cardiaca normale e anormale. Recenti tecnologie emergenti di retrospettive singole analisi clonali rendono lo studio della morfogenesi cardiaca a risoluzione singola cella fattibile. Tuttavia, l&#39;opacità dei tessuti e la dispersione della luce del cuore come la profondità delle immagini è aumentata Hinder di imaging intero-cuore con una risoluzione di singola cellula. Per superare questi ostacoli, un sistema di compensazione intero embrione che può rendere il cuore altamente trasparente sia per l&#39;illuminazione e la rilevazione devono essere sviluppati. Fortunatamente, negli ultimi anni, sono stati segnalati molti metodologie per sistemi di compensazione intero organismo, come la chiarezza, la Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cubi, DBE, BABB e PACT. Questo laboratorio è interessato ai meccanismi cellulari e molecolari della cartaIAC morfogenesi. Recentemente, abbiamo stabilito singola linea cellulare tracciare tramite il ROSA26-Cre ERT2; sistema ROSA26-Confetti alle cellule di etichette scarsamente durante lo sviluppo cardiaco. Abbiamo adattato diverse metodologie embrio-clearing interi compresi Sca le e cubi (chiare, senza ostacoli cocktail di imaging cerebrale e analisi computazionale) per cancellare l&#39;embrione in combinazione con tutto il monte colorazione di immagine singoli cloni all&#39;interno del cuore. Il cuore è stato ripreso con successo ad una risoluzione di singola cellula. Abbiamo trovato che le Sca può cancellare il cuore embrionale, ma non può efficacemente eliminare cuore postnatale, mentre CUBIC può cancellare cuore postnatale, ma danneggia il cuore embrionale sciogliendo il tessuto. I metodi qui descritti permetteranno lo studio della funzione genica in una sola risoluzione clone durante morfogenesi cardiaca, che, a sua volta, può rivelare basi cellulari e molecolari dei difetti cardiaci congeniti.

Imaging del cuore embrionale eliminato Formazione del cuore dei vertebrati è un processo morphogenic spatiotemporally regolata e dipende dall&#39;organizzazione e la differenziazione delle cellule progenitrici da quattro diverse fonti 1. Le cellule del primo campo cuore della mezzaluna cardiaca si piega verso la linea mediana ventrale per formare un tubo lineari cuore. Le cellule dal secondo campo cuore, inizialment...

Descriviamo un protocollo per visualizzare volumetricamente cellule marcate con proteine fluorescenti in profondità all'interno di cuori embrionali e postnatali intatti. Utilizzando metodi di pulizia dei tessuti in combinazione con la colorazione dell'intera montatura, è possibile visualizzare in modo chiaro e accurato singole cellule marcate con proteine fluorescenti all'interno di un cuore embrionale o postnatale.

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini volumetriche di cellule marcate con proteine fluorescenti all'interno di cuori integri, al fine di studiare la funzione genica a risoluzione singola cellula durante lo sviluppo cardiaco e nei cuori postnatali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali durante lo sviluppo cardiaco, come lo studio delle funzioni geniche e l'acquisizione di immagini a risoluzione singola cellula durante lo sviluppo cardiaco e negli artefatti animali. Il principale vantaggio di questo metodo è che è relativamente semplice, economico e vantaggioso perché consente un'analisi temporale specifica delle funzioni geniche e proteiche a risoluzione singola cellula in embrioni o cuori integri.Sebbene utilizziamo questo sistema per studiare lo sviluppo del cuore nei topi, è possibile utilizzarlo anche per studiare altri apparati organici, come muscoli, cervello e polmoni, nonché in altri organismi modello. In questo caso si utilizzano embrioni positivi per la proteina fluorescente provenienti da femmine R-26 Cre-RET2 confetti trattate con Tamoxifene. Iniziare la colorazione immergendo ciascun embrione fissato con paraformaldeide

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Le mutazioni che portano a difetti cardiaci congeniti beneficiano dell'indagine in vivo della struttura cardiaca durante lo sviluppo, ma gli studi strutturali ad alta risoluzione nel cuore embrionale di topo sono tecnicamente impegnativi. Qui presentiamo un robusto metodo di immunofluorescenza e analisi delle immagini per valutare le strutture specifiche dei cardiomiociti nel cuore del topo in via di sviluppo.

Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

Vi presentiamo un protocollo per l'analisi dei vasi coronarici, in tutto cuori murini embrionali fino a E15.5, usando metodi di colorazione immunologici standard, seguiti da gioco ottica e la microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione dei vasi sanguigni durante tutto cuore senza la necessità di analizzare tempo di sezioni seriali.

Analisi dei vasi coronarici in sgomberati cuori embrionali

Per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare nei cardiomiociti, presentiamo protocolli che utilizzano due linee di topi transgenici: Myh6-H2B-mCh topi transgenici, per l'identificazione inequivocabile dei nuclei dei cardiomiociti, e topi CAG-eGFP-anillina, per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare.

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Qui, descriviamo un protocollo per immunofluorescenza intero supporto e basate su immagine quantitativa analisi volumetrica degli embrioni del mouse in fase precoce. Presentiamo questa tecnica come un potente approccio qualitativamente e quantitativamente valutare strutture cardiache durante lo sviluppo e proponiamo che possa essere ampiamente adattabile ad altri sistemi dell'organo.

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

Questo studio utilizza una tecnica di microscopia (LSFM) foglio di luce di fluorescenza-retro illuminazione combinata con compensazione ottica per studiare il cuore murino.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino

La proliferazione cardiomiocite a seguito di lesioni è un processo dinamico che richiede una sinfonia di segnali extracellulari da popolazioni di cellule non miociti. Utilizzando il tracciamento del lignaggio, il CLARITY passivo e le tecniche di microscopia confocale a cavalcatura integrale tridimensionale, possiamo analizzare l'influenza di una varietà di tipi di cellule sulla riparazione e rigenerazione cardiaca.

Catturare la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite l'imaging tridimensionale del cuore autorizzato

Riportiamo un metodo per la ricostruzione mesoscopica dell'intero cuore del topo combinando nuovi progressi nella trasformazione e colorazione dei tessuti con lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce a scansione assiale.

Imaging ottico mesoscopico dell'intero cuore del topo

Presentiamo un protocollo dettagliato per la coltura e l'imaging di embrioni di topo che consente l'imaging 3D + tempo delle cellule progenitrici cardiache. Questo video-toolkit affronta le competenze chiave necessarie per immagini live di successo altrimenti difficili da acquisire da pubblicazioni di solo testo.

Imaging dal vivo dei primi progenitori cardiaci nell'embrione di topo

Il protocollo utilizza la microscopia avanzata a foglio di luce insieme a metodi di pulizia dei tessuti adattati per studiare strutture cardiache complesse nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.

Imaging a foglio luminoso per rivelare la struttura cardiaca nei cuori dei roditori

Questo protocollo introduce un metodo rapido per l'imaging vascolare tridimensionale quantitativo a montaggio intero utilizzando la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso. L'efficacia del metodo è dimostrata utilizzando il sistema arterioso dell'arco faringeo del modello di embrione di pollo, con forze emodinamiche quantificate tramite fluidodinamica computazionale.

Imaging rapido ad alta risoluzione a montaggio intero della vascolarizzazione di piccoli animali per studi quantitativi

Impara a eseguire imaging volumetrico di cuori intatti a risoluzione di singola cella utilizzando tecniche di tissue clearing e marcatura fluorescente. Questo metodo semplice ed economico consente di studiare la funzione genica durante lo sviluppo cardiaco.

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

Esplora altri video