Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella
7 ottobre 2016
Descriviamo un protocollo per visualizzare volumetricamente cellule marcate con proteine fluorescenti in profondità all'interno di cuori embrionali e postnatali intatti. Utilizzando metodi di pulizia dei tessuti in combinazione con la colorazione dell'intera montatura, è possibile visualizzare in modo chiaro e accurato singole cellule marcate con proteine fluorescenti all'interno di un cuore embrionale o postnatale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare volumetricamente cellule marcate con proteine fluorescenti in profondità all'interno di cuori intatti, per studiare la funzione genica alla risoluzione di singole cellule durante lo sviluppo cardiaco e nei cuori postnatali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave durante lo sviluppo cardiaco, come lo studio delle funzioni geniche e l'analisi dell'immagine alla risoluzione di una singola cellula durante lo sviluppo cardiaco e gli artefatti animidali. Il vantaggio principale di questo metodo è che è relativamente semplice, poco costoso e professionale in quanto speciale analisi temporale delle funzioni geniche e proteiche alla risoluzione di una singola cellula in embrione o cuore intatti.
Sebbene utilizziamo questo sistema per studiare lo sviluppo del cuore nei topi, puoi anche usarlo per studiare altri sistemi di organi, come muscoli, cervello e polmoni e anche in altri organismi modello. Qui vengono utilizzati embrioni positivi alle proteine fluorescenti provenienti da madri di coriandoli R-26 Cre-RET2 trattate con Tamoxifren. Iniziare la colorazione immergendo ogni embrione fissato con paraformaldeide in un millilitro di PBST allo 0,1% nei pozzetti di una piastra a 48 pozzetti.
Incubare per due ore su un agitatore per piastre a temperatura ambiente per permeabilizzare il tessuto. Quindi, sostituire la soluzione di permeabilizzazione con un mL di tampone bloccante e incubare, agitando, per due ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, preparare una diluizione da uno a 100 dell'anticorpo specifico per le cellule endoteliali, PECAM, in 0,3 millilitri di tampone bloccante per ogni pozzetto e aggiungerlo ai pozzetti contenenti gli embrioni.
Incubare per 48 ore agitando a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare gli embrioni cinque volte con PBST per 30 minuti ogni volta per rimuovere l'eccesso di anticorpi primari dal tessuto. Successivamente, immergere gli embrioni nella soluzione di anticorpi secondari antivaschetta di capra Alexa Fluor 647 e incubare agitando per 48 ore a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce.
48 ore dopo, dopo il lavaggio precedente, post-fissare gli embrioni con il 4% di PFA per un'ora a temperatura ambiente con agitazione. Quindi, dopo aver lavato due volte con PBS per cinque minuti ogni volta, incubare gli embrioni con la colorazione nucleare DAPI per dieci minuti. Seguire con due lavaggi PBS di cinque minuti ciascuno, quindi procedere alla pulizia dei tessuti.
La pulizia dei tessuti è la fase più critica di questo protocollo per visualizzare il cuore con una risoluzione di una singola cellula. Inoltre, la scelta del metodo di pulizia, scala o CUBIC, è molto importante per preservare i segnali fluorescenti nel cuore embrionale intatto. Trasferire gli embrioni lavati e colorati in una fiala a scintillazione avvolta in un foglio di alluminio, che contiene un millilitro di soluzione in scala A2.
Incubare a quattro gradi Celsius con occasionali agitazioni leggere con le mani per 48 ore. Dopo l'incubazione in scala A2, sostituire la soluzione nel flaconcino con un millilitro di soluzione di scala B4 e incubare a quattro gradi Celsius agitando delicatamente di tanto in tanto per altre 48 ore. Incubare gli embrioni per altre 48 ore con un millilitro di scala 70 a quattro gradi Celsius con agitare leggermente di tanto in tanto come prima.
Infine, immergere il campione in un millilitro di glicerolo al 90% e conservarlo a quattro gradi Celsius fino all'imaging. Per l'imaging, trasferire il campione in una capsula di Petri con fondo di vetro con una quantità minima di glicerolo al 90% e l'imaging con un microscopio confocale dotato di capacità a due fotoni. Per la pulizia CUBICA, immergere ogni embrione in un millilitro di CUBIC one agitando delicatamente di tanto in tanto per 48 ore a 37 gradi Celsius.
Dopo 48 ore, sostituire la soluzione con lo stesso volume di reagente CUBIC fresco e incubare il campione per altre 48 ore, come prima. Dopo l'incubazione, lavare più volte gli embrioni trattati con PBS con CUBIC one agitando delicatamente a mano per rimuovere la soluzione di CUBIC one in eccesso. Quindi, immergere gli embrioni nella soluzione CUBIC two per 48 ore a 37 gradi Celsius con occasionali agitazioni leggere con le mani.
Se ci sarà un ritardo prima dell'imaging, incubare in sequenza i campioni con un millilitro di glicerolo al 30% al 50% e al 70% e PBS per 30 minuti ciascuno. Dopo aver attraversato la serie, trasferire in una soluzione di glicerolo al 90% per la conservazione a quattro gradi Celsius. Quando è pronto, immergerlo in una capsula di Petri con fondo di vetro con glicerolo al 90%, come prima.
Questo filmato mostra le sezioni ottiche di un cuore E 8.75 trattato in scala, dalla superficie del cuore al lume. Il giallo segna l'espressione PECAM e tutti i cardiomiociti appaiono verdi. La profondità è di 110,4 micron e ci sono 93 fette in totale.
Questa è l'immagine 3D della superficie del cuore ricostruito appena mostrata. Anche in questo caso, il giallo segna l'espressione di PECAM e il verde etichetta tutti i cardiomiociti. Questo filmato mostra sezioni di un singolo clone progenitore da un cuore E 9.5 trattato con squame nella regione del tratto di efflusso.
Il giallo contrassegna l'espressione PECAM e il clone appare in verde. La profondità è di 36 micron e ci sono 10 fette in totale. Questo filmato mostra sezioni di un cuore P 2 trattato con CUBIC dalla superficie al lume.
La profondità è di 130 micron con tre micron per sezione. Questo filmato mostra le sezioni di un cuore E 17,5 trattato con CUBIC dalla superficie al lume. La profondità è di 630 micron con sei micron per sezione.
Si tratta di un'immagine 3D della superficie del cuore appena mostrata, ricostruita tramite il software di ricostruzione 3D. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che l'embrione è fragile e la patologia cardiaca può essere facilmente disturbata. Seguendo questa procedura, è possibile realizzare altre proteine, utilizzando la colorazione per studiare la funzione genica in post-ost lazione e schiuma.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'acquisizione volumetrica di immagini di cellule marcate con proteine fluorescenti all'interno di cuori embrionali e postnatali intatti. Il metodo combina tecniche di chiarificazione dei tessuti con la colorazione in toto per ottenere immagini nitide con risoluzione a livello cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Sviluppo cardiaco
- Immagini fluorescenti
- Analisi della funzione genica
Sfondo
- Comprendere le funzioni geniche durante lo sviluppo cardiaco è fondamentale.
- L'imaging a risoluzione monocellulare permette un'analisi dettagliata.
- Il metodo è applicabile a diversi sistemi organici e organismi modello.
- La marcatura con proteine fluorescenti migliora la visualizzazione di cellule specifiche.
Scopo dello studio
- Studiare la funzione genica a risoluzione monocellulare nei tessuti cardiaci.
- Indagare i processi di sviluppo nei cuori embrionali e postnatale.
- Fornire un metodo di imaging relativamente semplice ed economico.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di metodi di chiarificazione dei tessuti.
- Colorazione in toto di cellule marcate con proteine fluorescenti.
- Acquisizione di immagini di embrioni fissati con paraformaldeide.
- Applicazione del metodo a diversi sistemi organici oltre al cuore.
Risultati principali
- Imaging di cellule marcate con proteine fluorescenti in cuori integri eseguita con successo.
- Visualizzazione chiara delle funzioni geniche durante lo sviluppo cardiaco.
- Dimostrazione della versatilità del metodo in diversi sistemi organici.
- Stabilimento di un protocollo accessibile ed efficiente.
Conclusioni
- Il protocollo consente uno studio dettagliato dello sviluppo cardiaco a livello cellulare.
- Può essere adattato per l'uso in altri sistemi biologici.
- Questo metodo migliora la nostra comprensione delle funzioni geniche nello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi mediante imaging di cuori embrionali e postnatale chiarificati a risoluzione singola cellula permette un'indagine dettagliata del comportamento e della differenziazione delle cellule progenitrici cardiache durante lo sviluppo. Questo approccio supporta la validazione degli bersagli chiarificando i meccanismi cellulari e molecolari alla base della morfogenesi cardiaca normale e anomala. Il metodo fornisce un'elevata affidabilità predittiva nei modelli preclinici collegando la funzione genica agli esiti strutturali in tessuti integri.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione della dinamica clonale nei tessuti cardiaci in via di sviluppo.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico attraverso l'osservazione diretta del contributo delle cellule progenitrici alle strutture cardiache.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nella selezione degli obiettivi collegando la perturbazione genica a esiti fenotipici a risoluzione singola-cellula.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi preservando i segnali fluorescenti dopo la chiarificazione.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione degli assay attraverso protocolli riproducibili di chiarificazione dei tessuti e colorazione in toto.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma in stadi embrionali e postnatali mediante metodi di chiarificazione adatti allo stadio (ScaLe per stadi embrionali, CUBIC per stadi postnatali).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica consentendo un'analisi dell'espressione genica coerente in tutte le fasi dello sviluppo.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Rivela la base cellulare delle malformazioni cardiache congenite mediante analisi clonale su cuori integri.
- Sistema rilevante per le malattie: Fornisce un modello fisiologicamente ricco di contesto per lo studio della morfogenesi cardiaca in relazione allo sviluppo umano.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'analisi iniziale dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, consentendo letture quantitative e risolte spazialmente della funzione genica in tessuto cardiaco integro.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione dell'espansione clonale e della differenziazione durante lo sviluppo cardiaco.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso protocolli standardizzati di chiarificazione e colorazione che preservano i segnali dell'epitopo e delle proteine fluorescenti.
- Analisi: Genera dati quantitativi di imaging 3D che consentono il confronto della distribuzione, dimensione e localizzazione clonale tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo la valutazione longitudinale di fenotipi strutturali cardiaci associati a perturbazioni genetiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di imaging riutilizzabile applicabile attraverso diversi sistemi organici (cuore, cervello, polmone, muscolo) e organismi modello.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi dello sviluppo cardiaco.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione grazie a passaggi definiti di chiarificazione e colorazione, compatibili con l'immagine confocale e a due fotoni.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo evidenze visive dirette dell'interazione con il bersaglio e delle conseguenze fenotipiche nel tessuto integro.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio collegando i fenotipi dello sviluppo precoce a potenziali meccanismi di difetti congeniti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'etichettatura con proteine fluorescenti, nell'immunomarcatura su preparati interi e nelle tecniche di chiarificazione dei tessuti.
- Richiede l'accesso a sistemi di microscopia confocale o a due fotoni in grado di effettuare imaging in profondità nei tessuti.
- Necessita della standardizzazione della scelta del metodo di chiarificazione (ScaLe vs. CUBIC) in base allo stadio di sviluppo, al fine di preservare l'integrità del tessuto e il segnale.
- Comporta considerazioni di adattamento nell'applicare il protocollo ad altri sistemi organici, a causa delle variazioni nella densità del tessuto e nella tolleranza alla chiarificazione.
- Comprende limitazioni pratiche, come la fragilità del tessuto durante la manipolazione e il potenziale disturbo della patologia se la chiarificazione non è ottimizzata per lo stadio di sviluppo.
