Name: Hydroponics: un sistema versatile per studiare nutrienti allocazione e vegetali risposte a disponibilità di nutrienti e lesposizione a elementi tossici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Impara a configurare un sistema idroponico per studiare la nutrizione vegetale utilizzando Arabidopsis thaliana. Questo metodo permette di analizzare le risposte delle piante a carenze o eccessi di nutrienti.

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Questa ricerca è stata supportata dal Consiglio di Ricerca dell'Università del Missouri (Progetto CB000519) e dalla National Science Foundation degli Stati Uniti (IIA-1430428 a DMC). Nga T. Nguyen è stata sostenuta dal Vietnam Education Foundation Training Program (programma di scambio di visitatori n. G-3-10180). Ringraziamo anche Roger Meissen (MU Bond Life Sciences Center) per la sua assistenza e competenza durante le sessioni di registrazione e montaggio video.

1. piantina Nursery <ol><li> Sterilizzazione in fase vapore di semi di Arabidopsis <ol><li> Versare semi (40-50 mg) in 1,5 ml provette da centrifuga. (Vedi Figura 1 per il volume del seme del caso, ~ 50 ml). Etichettare ogni tubo con la matita (inchiostro potrebbe scomparire durante la sterilizzazione). Mettere ogni tubo con etichetta, tappo aperto, in un essiccatore 13. </li><li> Posizionare il essiccatore in una cappa attiva e chiudere la valvola del essiccatore. </li><li> Aliquota 100 ml di candeggina (NaClO 6,15%) in un bicchiere da 250 ml e poi posto in un essiccatore. </li><li> Aggiungere rapidamente 3 ml di 12 M di acido cloridrico per la candeggina con una pipetta di trasferimento. chiudere rapidamente il coperchio del essiccatore come la reazione procede rapidamente. Lasciare che la sterilizzazione di procedere per 4 ore (segnando un tubo con inchiostro e di vedere l&#39;inchiostro svanire aiuta a visualizzare che una quantità sufficiente di gas di cloro è stato generato). ATTENZIONE: Il gas di cloro è tossico; manigliai suoi residui con misure di sicurezza supplementari in una cappa aspirante funzionale. Contattare le autorità locali o visitare la pagina web del Dipartimento di salute ambientale e sicurezza - University of Missouri (ESH-MU) 14 per la sicurezza chimica e le linee guida per l&#39;utilizzo di una cappa aspirante: https://ehs.missouri.edu/chem/. </li><li> Quindici minuti prima della sterilizzazione è completo (3,75 ore), si trasformano in una cappa a flusso laminare e pulire la superficie con il 70% di etanolo. </li><li> Dopo 4 h di sterilizzazione aprire la valvola, rimuovere brevemente il coperchio del essiccatore interno della cappa, rimuovere la candeggina, e smaltire secondo le procedure istituzionali. Questo passaggio rilascerà una gran parte dei fumi di cloro. Sigillare la camera di sterilizzazione e portarlo alla cappa a flusso laminare. Aprire il coperchio ampiamente e aerare i semi sterilizzati per circa 40 min. Trascorso questo tempo, utilizzare i semi subito o conservare in un luogo asciutto. Nota: la sterilizzazione in fase vapore di semi è consigliato, ma altri metodi doch lavaggi come si alternano con l&#39;etanolo, acqua e candeggina, come descritto in Alatorre-Cobos et al. 2 sono ugualmente efficaci. </li></ol></li><li> Terreni di coltura per i semi di germinazione Nota: I terreni di coltura preparato in questa fase è ¼ Murashige e Skoog (MS) con vitamine 15. <ol><li> Aggiungere 450 ml di acqua deionizzata (DI) di acqua, 0,55 g supporti MS Plus vitamine, 0,3 g MES (4-idrato morpholineethanesulfonic acido), e una ancoretta magnetica in un bicchiere di vetro 1 L. </li><li> Sciogliere e aggiustare il pH a 5,7 con NaOH e quindi aggiungere 3,5 g phytoagar. Continuate a mescolare la soluzione per altri 5 minuti. </li><li> Versare l&#39;intera soluzione in un cilindro graduato e aggiungere acqua deionizzata fino a 500 ml. Autoclave questa soluzione da 500 ml, con l&#39;ancoretta magnetica all&#39;interno, utilizzando una bottiglia autoclavabile 1 L. </li><li> Dopo che la soluzione è stata autoclavato, agitare la soluzione per 7-10 min usando l&#39;agitatore magnetico nella bottiglia. </li><li> Dopo che i media si è raffreddatoa 50-60 ° C, versare i mezzi di comunicazione in piastre in condizioni sterili e lasciate solidificare. Le piastre possono essere memorizzati per un uso successivo nel freddo-stanza. </li></ol></li><li> placcatura Seed <ol><li> Accendere la cappa a flusso laminare 15 minuti prima dell&#39;uso e pulire la superficie con il 70% di etanolo. Sono necessari i seguenti elementi: semi sterili, carta da filtro, stuzzicadenti, nastro micropori e piatti ¼ MS. </li><li> Mettere i semi sterili su una carta da filtro sterile. Leggermente bagnato un&#39;estremità di uno stuzzicadenti sterile (con acqua sterile o colpendo media ¼ MS). Utilizzare questo fine idratata a raccogliere i semi dalla carta da filtro e poi li mettono sulla superficie dei media. </li><li> Diffondere i semi attraverso la piastra ad una densità di circa 1 seme per cm 2 (Figura 2). Quindi utilizzare il nastro micropori per tenere il coperchio piatto attaccato al corpo piatto. Questo tipo di nastro aiuta a prevenire contaminazioni pur consentendo lo scambio di gas tra l&#39;aria e il microclima insidvia e la piastra. </li><li> Prima di germinazione, i semi stratificare mantenendo le piastre due giorni in cella coperti dalla luce. </li><li> Dopo stratificazione, mettere i semi in una camera di crescita o in un luogo con condizioni di crescita ottimali (23 ° C, 16 ore luce / 8 ore buio e il 60% di umidità relativa per Arabidopsis). Piantine saranno pronti per la coltura idroponica 10-12 giorni dopo la germinazione. Nota: Durante la germinazione ci può essere significativo condensa sotto il coperchio della piastra, per evitare annegamento, l&#39;acqua in eccesso deve essere smaltita in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. </li></ol></li></ol> 2. processo di installazione e Trapianto idroponica <ol><li> soluzione idroponica Nota: Come menzionato nell&#39;introduzione, piante possono avere requisiti nutrizionali specifici Arabidopsis è stato coltivato con successo con la soluzione nutritiva mostrato nella Tabella 1 16 A seconda dei fornitori, il..sali qui elencati possono avere un contenuto di acqua diversa (idrato) e con tali alternative non influenza le proprietà della soluzione nutritiva finché la molarità viene mantenuto costante. <ol><li> Preparare le soluzioni madre di ogni macronutrienti in bottiglie diverse (Tabella 1) e tutti i micronutrienti ad eccezione di Fe-EDTA in una bottiglia sterile (sterilizzare per filtrazione 0,22 micron utilizzando membrane). Aggiungere sempre Fe-EDTA finalmente durante la miscelazione la soluzione. Preparare una soluzione nutritiva 10x in anticipo dell&#39;esperimento ma autoclave e conservare a 4 ° C. Utilizzare o modificare le sostanze nutritive solo quando la soluzione nutritiva ha raggiunto la temperatura ambiente. </li></ol></li><li> trapianto <ol><li> Preparare titolare impianti e contenitori idroponiche <ol><li> Fare un&#39;incisione nella schiuma, che corre lungo la sua lunghezza con una lama di rasoio (vedere Figura 3). Preparare una spina per pianta. </li><li> spine tubo di schiuma a liquido autoclave imbevuto di acqua deionizzata. &lt;/ Li&gt; <li> Tagliare il pannello di schiuma in tavole più piccole, assicurandosi che la larghezza e la lunghezza dei pannelli in schiuma sono 0,5-1,0 cm in meno dimensioni del contenitore (vedere Figura 4). </li><li> Utilizzare una sonda di carotaggio per creare fori sul pannello isolante. La densità delle piante dovrebbe essere uniformemente distribuito, idealmente 1 pianta per 10 cm 2. Questa densità manterrà piante nettamente separati gli uni dagli altri; densità superiori tuttavia sono possibili e non preclude il successo degli esperimenti. Assicurarsi che la dimensione dei fori corrisponde alla dimensione dei tappi (vedere Figura 4). </li><li> Riempire i contenitori con la soluzione nutritiva. Assicurarsi che la profondità della soluzione è sufficiente per lo sviluppo delle radici (almeno 5 cm). Poi posto con attenzione i pannelli in schiuma sulla superficie della soluzione. </li><li> Impostare l&#39;impianto di pompa per fornire ossigeno nella soluzione (vedi Figura 5). Nota: Riempire il contenitore idroponica con soluzione nutritiva il same piantine giorno vengono trapiantate. Coprire i lati del contenitore dalla luce aiuterà a prevenire la crescita delle alghe. </li></ol></li><li> Trasferimento Seedling da piastre per sistema idroponico <ol><li> Utilizzare piccole pinzette per estrarre delicatamente ogni piantina fuori del piatto medio e gettare le radici lungo l&#39;incisione della spina tubo di schiuma. inserire con attenzione il tubo di schiuma tenendo la piantina nel pannello isolante quindi posizionare il pannello posteriore al contenitore idroponica. Vedi Figura 6 per la manipolazione appropriata. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Esperimenti idroponici <ol><li> La sostituzione della soluzione nutritiva e la manipolazione <ol><li> La sostituzione della soluzione nutritiva <ol><li> Per sostituire la soluzione nutritiva, preparare una soluzione fresca idroponiche come descritto al punto 2.1. Rimuovere il pannello isolante contenente le piante dal contenitore idroponica e metterlo in un contenitore riempito di temporaneaacqua o soluzione idroponica. </li><li> Eliminare la vecchia soluzione, sciacquare il contenitore per breve tempo tre volte con acqua deionizzata. Aggiungere la soluzione idroponica appena preparata in questo contenitore e delicatamente posizionare il pannello isolante con le piante nel contenitore idroponica. Sostituire la soluzione idroponica due volte a settimana. </li></ol></li><li> Modifica della composizione dei nutrienti della soluzione idroponica <ol><li> Regolare la composizione della soluzione idroponica mostrato in Tabella 1 per modificare la concentrazione finale di un elemento di interesse. Ad esempio, per indurre carenza di ferro (Fe), modificare la soluzione idroponica per diminuire la concentrazione di Fe-EDTA. Include una serie di piante di controllo coltivate su una soluzione completa (o piena) idroponica, senza alcuna modifica, per il confronto. </li><li> Per manipolare la soluzione nutritiva con un elemento tossico, prima preparare una soluzione madre indipendente del elemento tossico desiderato, preferibilmente 1,000x concentrato. Usare unpipetta a picco la soluzione idroponica con l&#39;elemento tossico alla concentrazione finale desiderato utilizzando il brodo concentrato 1,000x. </li><li> Ad esempio, al fine di rendere 3 L di soluzione idroponica contenente 20 mM di cadmio, preparare un 0,5 M CdCl 2 stock, e aggiungere 120 ml di 2 stock 0,5 M CdCl nella soluzione idroponica 3 L. Include una serie di controllo di piante coltivate in idroponica, senza CdCl 2 per il confronto. ATTENZIONE: Toxic elementi quali cadmio, arsenico e piombo sono molto pericolosi per la salute umana e per l&#39;ambiente. Si prega di contattare le autorità locali o visitare la pagina web del EHS-MU (https://ehs.missouri.edu/train/chemical.html) 14 per le linee guida di sicurezza ambientale e la salute prima di effettuare esperimenti. </li></ol></li></ol></li><li> Sterilizzazione degli strumenti per i prossimi esperimenti <ol><li> Come quasi tutto il materiale utilizzato per preparare la idroponica impostato può essereriutilizzato, pulire le varie parti con candeggina diluita (NaClO 0,6%). </li><li> Dopo il risciacquo con candeggina, lavare tutti i materiali accuratamente con acqua deionizzata. Tenere i contenitori, pannelli in schiuma, e le pietre bolla acquario in un luogo asciutto per un utilizzo futuro. tappi di schiuma sono pronti per il riutilizzo dopo la rimozione delle radici e di essere autoclavato. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La salute delle piantine utilizzate per la coltura idroponica è uno dei principali fattori che contribuiscono al successo di un esperimento idroponica. Sterilizzazione degli strumenti, semi e terreni di coltura anche svolgere un ruolo importante nel ridurre il rischio di contaminazione e di fornire un buon inizio per le piante prima vengono trapiantate nel sistema idroponico. Un ambiente di lavoro con strutture come un&#39;autoclave, cappa, fredda camera (4 ° C), e lo spazio di crescita con condizioni controllate (intensità luminosa e temperatura) è necessario per un buon sperimentale impostato. La freschezza della soluzione nutritiva determina anche la salute delle piante e, a sua volta determina il successo di un esperimento idroponica. Poiché l&#39;acqua evapora più velocemente sotto illuminazione diretta, la concentrazione di sali cambierà a causa di una riduzione del volume totale della soluzione; quindi è meglio cambiare la soluzione idroponica almeno due volte alla settimana. Tuttavia, se grandi contenitori profondidotato di un sistema di pompa di aria vengono utilizzati può non essere necessario sostituire la soluzione nutritiva per esperimenti che sono di breve durata. Si noti che in caso di Arabidopsis abbiamo utilizzato vasi Magenta (77 mm di larghezza x 77 mm di lunghezza x 97 mm di altezza), ma altri contenitori, più grandi possono essere utilizzati anche per ospitare impianti di maggiori dimensioni. Per i ricercatori interessati a elementi nutritivi, esperimenti idroponici offrono un ambiente unico per testare fenotipi e le risposte della pianta a differenti disponibilità di nutrienti 17. Manipolando le concentrazioni degli elementi di interesse, i ricercatori possono impostare diversi esperimenti per testare gli effetti di sufficienza, la carenza o concentrazioni tossiche di nutrienti essenziali e non essenziali. Rispetto al sistema a base di terreno, il sistema idroponico fornisce un mezzo nutriente più omogenea agli impianti con meno rischi di malattie del terreno. Inoltre, sia radice e sparare tessuti possono essere raccolte e separate facilmenteper ulteriori analisi su tessuti vegetali specifici. Nella sezione rappresentante, abbiamo introdotto due esempi in cui un semplice sistema idroponico è stato utilizzato per gli studi più dettagliati sulla nutrizione delle piante. Nel primo esempio, per la coltivazione di piante su un gradiente di concentrazione di zinco, siamo riusciti a illustrare il livello di controllo che può essere raggiunto sulla composizione nutriente utilizzando questo sistema idroponico. Le piante coltivate con 7 micron Zn è cresciuto molto più vigoroso rispetto a piante coltivate in 50 micron Zn, mentre le piante coltivate senza ulteriore Zn aggiunto sono stati stentata rispetto alle piante coltivate con 7 micron Zn. Questo è in parte a causa della lunghezza di tempo le piante sono state lasciate crescere in condizioni sufficienti; in precedenza la rimozione del Zn dai media rischia di indurre forti sintomi di zinco-carenza. Applicando lo stesso principio, siamo stati in grado di indurre tossicità utilizzando il metallo non essenziale, cadmio, che è noto per alterare la crescita delle piante. Nel secondoad esempio, la composizione elementare di Col-0 radici e germogli trattati con 20 mM Cd per 72 ore è stata determinata mediante ICP-OES. Abbiamo trovato differenze in tutti i metalli rilevati tra radici e germogli. Macro-elementi sono stati trovati in concentrazioni più elevate nei germogli relativi alle radici, mentre il ferro e zinco sono stati trovati più abbondante nelle radici. Il cadmio ha seguito un modello simile a ferro e zinco, essendo più concentrata nelle radici rispetto ai germogli. Questi dati rafforzano l&#39;idea che le foglie e le radici forniscono diverse informazioni sullo stato ionome della pianta e quindi entrambi i tessuti devono essere analizzati separatamente per capire nutrizione minerale e la composizione a livello di impianto complesso. Oltre ICP-OES diversi metodi spettroscopici, come spettroscopia di assorbimento atomico (AAS) o plasma accoppiato induttivamente spettrometria di massa (ICP-MS) può essere utilizzato anche per misurare la composizione elementare (ionome) di impianto dei tessuti 18-20. In un hydroponic esperimento, i sintomi e fenotipi di piante che rispondono alle diverse condizioni di nutrienti rappresentano l&#39;inizio di quello che potrebbe essere esteso in più elaborate analisi, come l&#39;espressione genica (trascrittomica) e l&#39;abbondanza di proteine ​​(proteomica). Queste tecniche -omic sono le chiavi per integrare il metabolismo della pianta considerando i processi in maniera tessuto-specifica.

Le piante sono tra i pochi organismi che possono sintetizzare tutti i metaboliti richiesti da ioni inorganici, acqua e CO 2 che utilizzano l&#39;energia catturata dal sole 1. Hydroponics è un metodo di coltivazione di piante che sfrutta questo fatto fornendo tutti i nutrienti, nella loro forma inorganica, in una soluzione liquida con o senza supporto solido. Sistemi idroponici sono stati ampiamente utilizzati dagli scienziati per esplorare i requisiti nutrizionali e anche la tossicità di alcuni elementi in Arabidopsis e di altre specie vegetali 2-5. Per esempio, Berezin et al. 3, Conn et al. 4, e Alatorre-Cobos et al. 2 utilizzati sistemi idroponici e diverse specie di piante, tra cui pomodoro e tabacco, di generare sufficiente biomassa vegetale per l&#39;analisi minerale 2-4. Applicazioni industriali di coltura idroponica sono stati sviluppati anche per le colture come il pomodoro e lattuga 6. Qui, outline l&#39;uso idroponica nel contesto della ricerca, possibili variazioni metodi disponibili, e infine presentare un sistema che può essere facilmente scalabile ed utili per laboratori di ricerca interessati a studiare nutrizione minerale delle piante. Sistemi idroponici permettono una facile separazione dei tessuti radice e il controllo preciso della disponibilità di nutrienti Hydroponics offre diversi vantaggi rispetto ai sistemi basati sul suolo. Quando viene rimosso dal suolo, il tessuto radice è spesso tranciato meccanicamente causando la perdita di tessuto o di danni. Questo è particolarmente vero per le strutture di root sottili come le radici laterali e peli radicali. sistemi idroponici che non utilizzano un supporto particellare inerte, consentono una separazione meno invasiva di radice e sparare tessuti. Nei sistemi di suolo, i cambiamenti dei nutrienti di biodisponibilità in tutta la matrice del suolo come nutrienti si legano alle particelle di terreno che creano microambienti all&#39;interno del terreno. Questo heterogeneità potrebbe aggiungere un ulteriore livello di complessità in esperimenti che necessitano di un controllo preciso sulla concentrazione esterna di sostanze nutritive o di altre molecole. Al contrario, la soluzione idroponica è omogenea e può essere facilmente sostituito in tutto il corso dell&#39;esperimento. Varianti di sistemi idroponici Tutte le colture idroponiche basano su una soluzione nutritiva per trasportare gli elementi essenziali alla pianta. Oltre alle sostanze nutritive, le radici anche bisogno di un rifornimento costante di ossigeno. Quando le radici diventano anossico non sono in grado di prendere e metaboliti di trasporto per il resto del corpo dell&#39;impianto 7. sistemi idroponici possono essere classificati in base a come fornire ossigeno e altri nutrienti alle radici: l&#39;apporto di ossigeno saturando la soluzione con l&#39;aria (coltura idroponica classiche), non immergendo le radici in ogni momento, o permettendo alle radici essere completamente esposti a l&#39;aria (aeroponica) 8. In coltura idroponica,soluzione nutriente può essere saturo di aria prima del suo utilizzo e sostituiti frequentemente, o aria può essere fornito in continuo nella soluzione durante il ciclo di vita della pianta 9. In alternativa, le piante possono essere coltivate su supporti inerti (ad esempio pellet, lana di roccia, vermiculite o argilla) e sottoposti a secco-umido cicli per gocciolamento una soluzione attraverso i media o periodicamente immergendo il substrato nella soluzione nutritiva 10. In aeroponica, le radici vengono spruzzati con la soluzione nutritiva per prevenire l&#39;essiccamento. Svantaggi di sistemi idroponici Anche se le culture idroponiche offrono chiari vantaggi rispetto ai sistemi basati sul suolo, ci sono alcune considerazioni che devono essere riconosciuti quando si interpretano i dati. Per esempio, sistemi idroponici espongono impianti a condizioni che possono essere visti come non fisiologica. Pertanto, fenotipi o risposte delle piante rilevati utilizzando sistemi idroponici possono variare in grandezza when piante sono coltivate in sistemi alternativi (ad esempio, del suolo o dei media agar-based). Queste considerazioni non sono gli unici per i sistemi idroponici; risposte differenziali possono essere osservati anche se le piante sono coltivate in diversi tipi di terreno 11,12. Il seguente protocollo fornisce istruzioni passo-passo su come impostare un sistema idroponico in un laboratorio. Questo protocollo è stato ottimizzato per Arabidopsis thaliana (Arabidopsis); tuttavia, simili o in alcuni casi passaggi identici possono essere utilizzati per crescere altre specie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Per la sterilizzazione dei semi</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>The Clorox Company</td><td>NA</td><td>La normale candeggina www.cloroxprofessional.com</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Corpo essiccatore</td><td>Nalgene</td><td>D2797 SIGMA</td><td>Commercializzato da Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Piastra essiccante</td><td>Nalgene</td><td>5312-0230</td><td>Commercializzato da Thermo Scientific</td></tr><tr><td colspan="4">Per un quarto di preparazione media MS</td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>172591000</td><td>4-Morpholineethanesulfonic acid hydrate</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0404-10L</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Phytoagar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1003.1000</td><td></td></tr><tr><td>Piatto quadrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711A</td><td>Piastra Petri usa e getta con griglia</td></tr><tr><td colspan="4">Per la placcatura dei semi&nbsp; </td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Whatman</td><td>1004090</td><td></td></tr><tr><td>Stuzzicadenti</td><td>Jarden Home Brands</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Reynolds Wrap</td><td>NA</td><td>Foglio di alluminio standard</td></tr><tr><td>Nastro microporoso</td><td>3M Health Care</td><td>19-898-074</td><td>Nastro chirurgico; Commercializzato da Fisher Scientific</td></tr><tr><td colspan="4">Per la preparazione di soluzioni idroponiche</td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP368-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P386-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2</td><td>Acros Organics</td><td>A0314209</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>B9645-500G</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-100G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Sigma</td><td>Z0251-100G</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4</td><td>Aldrich</td><td>737-860-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CoCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>232696-5G</td><td></td></tr><tr><td>FeEDTA</td><td>Sigma</td><td>E6760-100G</td><td></td></tr><tr><td>" Stericup & Steritop" bottiglia&nbsp;</td><td>Milipore Corporation</td><td>SCGVU02RE</td><td>Contenitore per micronutrienti www.milipore.com</td></tr><tr><td colspan="4">Per la preparazione del tampone per il lavaggio delle radici</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics A0305456</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Per configurazione idroponica</td></tr><tr><td>Tappo per tubo in schiuma autoclavabile</td><td>Jaece Industries Inc.</td><td>L800-A</td><td>Identi-Plugs si adattano ai fori con 2R = 6-13 mm</td></tr><tr><td>Foam Board</td><td>Styrofoam Marca Dow</td><td>ESR-2142</td><td>Lo spessore è di 1/2 pollice</td></tr><tr><td>Cork Borer</td><td>Humboldt</td><td>H-9662</td><td>Cork Borer Set con maniglie, , Plated Brass Set di 6, 3/16" a 1/2" OD Size</td></tr><tr><td>Pompa ad aria</td><td>Aqua Culture</td><td>MK-1504</td><td></td></tr><tr><td>Pompa ad aria</td><td>Commercializzata da Wal-mart Stores, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi aerei e pietre a bolle per acquari</td> Tubi per <td>acquacoltura</td><td>: 928/25-S</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per aerei e pietre a bolle per acquari</td><td>commercializzati da Wal-mart Stores, Inc.</td><td>Pietra: ASC-1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Other</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A995-4</td><td>Reagente Alcool</td></tr><tr><td>Cloruro di cadmio (CdCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108-64-2</td><td></td></tr></tbody></table>

hydroponics: un sistema versatile per studiare nutrienti allocazione e vegetali risposte a disponibilità di nutrienti e l&#39;esposizione a elementi tossici

Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements

sistemi idroponici sono state utilizzate come uno dei metodi standard per la ricerca Biologia Vegetale e sono utilizzati anche nella produzione commerciale per diverse colture, tra cui lattuga e pomodoro. All&#39;interno della comunità di ricerca impianto, numerosi sistemi idroponici sono stati progettati per studiare le risposte delle piante agli stress biotici e abiotici. Qui vi presentiamo un protocollo idroponica che può essere facilmente implementato in laboratori interessati a perseguire studi sulla nutrizione minerale delle piante. Questo protocollo descrive il sistema idroponico impostato in dettaglio e la preparazione di materiale vegetale per esperimenti di successo. La maggior parte dei materiali descritti in questo protocollo può essere trovato al di fuori società di fornitura scientifici, rendendo il set up per esperimenti idroponiche meno costoso e conveniente. L&#39;uso di un sistema di crescita idroponica è più vantaggiosa in situazioni in cui devono terreno nutritivo essere ben controllata e quando intatta roOTS devono essere raccolte per le applicazioni a valle. Abbiamo inoltre dimostrato come le concentrazioni di nutrienti può essere modificato in modo da indurre risposte pianta per entrambe le sostanze nutrienti essenziali e gli elementi non essenziali tossici.

In questa sezione, i risultati di due tipi di esperimenti, utilizzando il sistema idroponico qui descritto, sono presentati. Nel primo esperimento, la soluzione nutritiva è stata modificata per ottenere diverse concentrazioni di zinco. Abbiamo inoltre modificato la soluzione nutritiva con l&#39;aggiunta di concentrazioni non letali del cadmio elemento tossico (Figura 7). Nel secondo esperimento, abbiamo utilizzato plasma accoppiato induttivamente ottica spettrometria di emissione (ICP-OES) 1 per misurare la composizione elementare di radici e foglie di piante coltivate in soluzione contenente cadmio idroponica (Figura 8). Questo esperimento illustra i vantaggi di ottenere radici e foglie separatamente. esperimento 1 Piantine di Arabidopsis (Col-0) sono state coltivate in sistema idroponico descritto in protocol punti 1 e 2. Le piante sono state lasciate crescere per un totale di 3 settimane prima di essere trattate con diverse concentrazioni di zinco (Figura 7A-B) o una concentrazione non letale di cadmio (Figura 7C). Sei giorni dopo il trattamento, piante cresciute a concentrazioni elevate di zinco (&gt; 42 micron) hanno mostrato un ritardo di crescita a causa di Zn tossicità, mentre le piante senza zinco extra aggiunti anche mostrare un ritardo di crescita rispetto alle piante coltivate con 7 micron Zn 2+. Figura 7 mostra anche il riduzione della crescita riprese, la crescita delle radici e foglie di clorotico sintomi tipici di piante esposte al cadmio (Figura 7C). esperimento 2 Col-0 piante sono state coltivate come descritto nei passaggi 1 e 2. Dopo due settimane, la soluzione non modificato (piene) è stato sostituito con 80 ml di soluzione idroponica contenente 20 mM Cd. Dopo 72 ores, tessuti radicali sono stati lavati con il trasferimento di tutto il bordo della gomma piuma con le piante in un nuovo recipiente contenente 80 ml di Tris 20 mM (pH 8,0) e 5 mM EDTA. Questa soluzione rimuovere i metalli pesanti legati alla superficie della radice. Le piante sono state incubate nella soluzione EDTA contenente su un agitatore rotante per 5 minuti. EDTA è stato poi sostituito con 80 ml di acqua deionizzata e le piante sono state incubate rotativo per altri 5 minuti. Questa fase di risciacquo con acqua deionizzata è stato ripetuto due volte. Dopo il risciacquo le piante con acqua DI, foglie e radice tessuti sono state raccolte in maniera indipendente e trattati per ICP-OES 1. La Figura 8 mostra che la composizione elementare di foglie è diverso da radici, dove macronutrienti (Ca, K e Mg) nel tessuto fogliare sono presenti in concentrazione superiore rispetto alle radici. D&#39;altra parte, micronutrienti come Zn e Fe sono preferenzialmente accumulati nelle radici. La concentrazione dell&#39;elemento cadmio non essenziale è risultato hi<html> gher in radici rispetto ai germogli. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54317/54317fig1.jpg" /> Figura 1. Vapor-fase di sterilizzazione dei semi di Arabidopsis. (A) Quantità di semi di Arabidopsis per 1,5 ml provette da centrifuga. (B) Tubi contenenti semi con tappi aperti nel supporto cremagliera tubo pronto per la sterilizzazione, un tubo con un inchiostro marcata sul tappo è incluso. (C) Sterilizzazione allestita all&#39;interno di un essiccatore, coperchio e valvola chiusa. (D) L&#39;inchiostro marchio sul coperchio di un tubo inserito nel processo di sterilizzazione del seme con un forte colore di inchiostro-mark, prima e dopo la sterilizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54317/54317fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> file / ftp_upload / 54317 / 54317fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. passo Seed placcatura. (A) semi vengono posti sulla carta sterilizzati prima placcatura. è anche necessario un stuzzicadenti sterilizzato per questo passo. (B) leggermente bagnare l&#39;estremità dello stuzzicadenti con i media o acqua sul lato della piastra supporto. (C) I semi vengono spostati a ¼ piastre MS. (D) Una densità ideale di semi è ≈1 seme / cm 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54317/54317fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54317/54317fig3.jpg" /> Figura 3. spina Schiuma utilizzato per contenere piantine nella soluzione nutritiva. Un&#39;incisione sulla metà del tappo tubo di schiuma aiuta tenendo la piantina durante trapianto da piastre per coltura idroponica.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54317/54317fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54317/54317fig4.jpg" /> Figura 4. Schiuma preparazione bordo. (A) Controllare la dimensione del bordo della gomma piuma modello con la dimensione del contenitore prima di preparare pannelli in schiuma in grandi quantità. Due piccole perforazioni effettuate in centro del bordo di schiuma rendono più facile da tenere e gestire la schiuma con una pinzetta. (B- C) una sonda di carotaggio viene utilizzato per creare fori sul pannello isolante. (D) Verificare il corretto montaggio tra la spina tubo schiuma e fori creati sul pannello isolante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54317/54317fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> . Figura 5. impostazione Air-pompa per l&#39;esperimento idroponica da top-view (A) e vista laterale (B) I numeri indicano: 1 - pompa di alimentazione dell&#39;aria; 2 - tubi in plastica che collega la pompa di aria con il sistema di valvola per controllare il flusso d&#39;aria; 3 - il sistema di valvole; 4 e 5 - tubi in plastica che collega il sistema di valvole con pietre bolla per l&#39;aerazione; 6 e 7 -. Pietre bolla (venduti per acquari) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54317/54317fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54317/54317fig6.jpg" /> Figura 6. Trasferimento di piantine per il sistema idroponico. (A) Utilizzare le pinzette per prendere una piantina dalla piastra di media. (B) Posizionare il roo piantinat lungo l&#39;incisione sulla spina tubo espanso. (C) Inserire la spina tubo di schiuma nel pannello isolante. (D) A compilato impostazione bordo della gomma piuma con piantine pronte per essere immesse sul soluzione nutritiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54317/54317fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54317/54317fig7.jpg" /> Figura 7. Le soluzioni nutrizionali possono essere modificati per testare carenza o effetti tossici di elementi 4 settimane di età hydroponically cresciuto Arabidopsis 6 giorni dopo il trattamento. (AB) piante coltivate con 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, e 50 mM di Zn. Le piante coltivate a concentrazioni elevate Zn (&gt; 42 micron) mostrano ritardo della crescita (tossicità) la crescita (carenza di nutrienti), mentre piante senza Zn aggiunto anche mostrare in ritardo rispetto alle piante coltivate con<html> 7 micron Zn 2+. (C) Le piante coltivate in assenza (a sinistra) o la presenza di 20 micron Cd nella soluzione nutritiva (foto è stata scattata dopo 6 giorni di esposizione Cd). Esposizione al cadmio induce clorosi e riduce la crescita. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54317/54317fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54317/54317fig8.jpg" /> Figura 8. composizione elementare di radici e germogli da piante coltivate idroponica. Shoots contengono più macronutrienti (Ca, K, Mg) rispetto alle radici mentre i micronutrienti essenziali zinco e ferro sono più concentrati nelle radici. Analogamente l&#39;elemento cadmio non essenziale è preferenzialmente accumulato nelle radici. Le barre di errore rappresentano gli intervalli di 95% di confidenza (n = 14, germogli e n = 9, radici)._upload / 54317 / 54317fig8large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <table><tbody><tr><td> Tipo di nutrienti </td><td> Sale / Reattivo </td><td> Concentrazione nella soluzione idroponica </td><td> Unità </td></tr><tr><td> macronutrienti </td><td> KNO 3 </td><td> 1.250 </td><td> mM </td></tr><tr><td> macronutrienti </td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0,625 </td><td> mM </td></tr><tr><td> macronutrienti </td><td> MgSO 4 </td><td> 0.500 </td><td> mM </td></tr><tr><td> macronutrienti </td><td> Ca (NO 3) 2 </td><td> 0.500 </td><td> mM </td></tr><tr><td> micronutrienti </td><td> H 3 BO 3 </td><td> 17.500 </td><td> micron </td></tr><tr><td> micronutrienti </td><td> MnCl 2 </td><td> 5.500 </td><td> micron </td></tr&gt; <tr><td> micronutrienti </td><td> ZnSO4 </td><td> 0.500 </td><td> micron </td></tr><tr><td> micronutrienti </td><td> Na 2 Moo 4 </td><td> 0,062 </td><td> micron </td></tr><tr><td> micronutrienti </td><td> NaCl 2 </td><td> 2.500 </td><td> micron </td></tr><tr><td> micronutrienti </td><td> CoCI 2 </td><td> 0.004 </td><td> micron </td></tr><tr><td> micronutrienti </td><td> FeEDTA </td><td> 12.500 </td><td> micron </td></tr></tbody></table> Tabella 1. concentrazione attiva di nutrienti nella soluzione idroponica.

Qui, presentiamo un protocollo facile da seguire per stabilire un sistema idroponico di successo per gli studi sulla nutrizione delle piante. Questo protocollo è stato ampiamente testato in Arabidopsis e può essere facilmente adattato ad altre specie vegetali per studiare specifiche esigenze nutrizionali o l'effetto di elementi non essenziali sulla crescita e lo sviluppo delle piante.

Hydroponics: un sistema versatile per studiare nutrienti allocazione e vegetali risposte a disponibilità di nutrienti e l&#39;esposizione a elementi tossici

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several ...

Il seguente protocollo fornisce istruzioni dettagliate per allestire un sistema idroponico in laboratorio. Questo protocollo è stato ottimizzato per Arabidopsis thaliana. Uno dei fattori principali che contribuisce al successo dell'insediamento di una coltura idroponica è la salute delle piantine utilizzate per l'esperimento.Pertanto, la sterilizzazione di strumenti, semi e mezzi di coltura riveste un ruolo importante nella riduzione del rischio di contaminazione e garantisce un buon avvio per le piante prima del loro trapianto nel sistema idroponico. In questo passaggio, il gas cloro rilasciato dalla reazione tra candeggina e acido cloridrico sterilizza la superficie dei semi. Prima di trasferire i semi in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri, etichettare la provetta con una matita per identificare i semi.Si preferisce la matita perché l'inchiostro potrebbe sbiadire durante la sterilizzazione. Contrassegnare anche il tappo del tubo con un pennarello indelebile. Questo segno dovrebbe scomparire nel corso del processo di sterilizzazione a causa del gas cloro rilasciato.Il volume raccomandato di seme per provetta è di circa 100 microlitri. Posizionare la provetta etichettata, con il tappo aperto, nel desiccante o nella camera a vuoto. Collocare il desiccante in una cappa chimica attiva.Versare 100 millilitri di candeggina in un becher da 250 millilitri, posizionarlo nel desiccatore e chiudere la valvola del desiccatore. Aggiungere rapidamente 3 millilitri di acido cloridrico al 12% alla candeggina utilizzando una buretta. Chiudere immediatamente il coperchio.Lasciare procedere la sterilizzazione per quattro ore. Ecco il desiccante in una cappa a flusso laminare attiva dopo quattro ore di sterilizzazione e dopo la rimozione della candeggina. Lo sbiadimento del segno rosso indica che è stata generata una quantità sufficiente di gas cloro.Aprire ampiamente il coperchio del desiccante e aerare i semi sterilizzati per almeno 30 minuti. Successivamente, i semi possono essere utilizzati immediatamente o conservati in un luogo asciutto. Questo passaggio contribuisce a ottenere piantine sane prima della fase di trapianto.Questi sono gli elementi necessari per iniziare le piastre di semina. Semi sterili, piastre con terreno MS 1/4, carta filtro sterile, nastro millipore, stecchini sterili, penna marcata, foglio di alluminio. Trasferire innanzitutto i semi dal tubo da centrifuga a una carta filtro sterile.Inumidire leggermente un'estremità dello stuzzicadenti e utilizzare questa estremità umidificata per raccogliere i semi dalla carta filtro e disporli sulla superficie dell'agar. Distribuire i semi sulla piastra con una densità di circa un seme per centimetro quadrato. Qui utilizziamo solo alcuni semi per dimostrare il passaggio, ma è possibile riempire l'intera piastra di semi.Scrivere la data sul coperchio della piastra per tenere traccia dell'età della pianta. Utilizzare nastro microporoso per mantenere il coperchio della piastra attaccato al corpo della piastra. Questo nastro consente anche lo scambio di umidità tra l'aria e il microclima all'interno della piastra.Utilizzare della carta d'alluminio per coprire la piastra e bloccare la luce prima di posizionare la pianta nella stanza fredda per due giorni. Tempi più lunghi possono essere utilizzati per favorire il processo di germinazione. Come per il MS 1/4, anche la soluzione idroponica deve essere sterilizzata dopo la preparazione.Abbiamo utilizzato con successo la seguente soluzione nutritiva per coltivare Arabidopsis thaliana, ma può essere modificata per adattarla a esperimenti specifici o a diverse specie vegetali. Si consiglia di preparare una soluzione madre per ciascun macronutriente in bottiglie separate e una soluzione contenente tutti i micronutrienti in un'unica bottiglia, ad eccezione del ferro-EDTA. Una soluzione nutritiva 10x può essere preparata in anticipo rispetto all'esperimento, ma deve essere sterilizzata in autoclave e conservata in frigorifero.Di seguito sono elencati i materiali necessari per preparare i supporti per piante. Contenitore per idrocoltura, tavola di polistirolo, taglierino, perforatore di sughero, tappi sterili in schiuma tubolari, pinzette. Misurare innanzitutto le dimensioni del contenitore.Quindi tagliare il pannello di polistirolo secondo le dimensioni necessarie. In questo caso, un taglierino è utile. Verificare che le dimensioni del pannello di polistirolo siano adatte al contenitore.Usare pinzette piccole per tenere il supporto. Regolare le dimensioni del supporto di polistirolo se necessario. Utilizzare una matita per segnare le posizioni in cui le piante verranno fissate.Utilizzare un trapano per tappi per creare fori nella tavola di poliuretano espanso. Densità raccomandata: una pianta ogni 10 centimetri quadrati. Successivamente, effettuare un taglio lungo ciascun tappo di poliuretano espanso utilizzando una lametta da rasoio.Usare la massima cautela quando si maneggiano lame di rasoio. Ogni foro verrà riempito con un tappo di schiuma. Pertanto, le dimensioni dei fori devono essere proporzionali ai tappi.Immergere i due tappi in acqua deionizzata e sterilizzarli in autoclave liquida prima dell'allestimento dell'idrocoltura. Trasferire ora le piantine e collegare la pompa dell'aria. Questa è la soluzione idroponica alla concentrazione di lavoro.Questi sono i tappi sterili in schiuma per provette. E queste sono le piantine di 12 giorni su piastra con mezzo di coltura. Aprire la piastra.Utilizzare pinzette piccole per estrarre delicatamente una piantina dalla piastra del mezzo e posizionare la radice lungo l'incisione del tappo di schiuma. Inserire con attenzione il tubo di schiuma contenente la piantina nella tavola di schiuma e posizionare la tavola nel contenitore con la soluzione idroponica. Continuare il trapianto fino a ottenere il numero desiderato di piante.Assicurarsi che i tappi di schiuma siano inzuppati con la soluzione idroponica. Successivamente, mostreremo come configurare il sistema di aerazione, per il quale sono necessari piccole pompe per aria di tipo acquario, tubi di plastica, pietre per bolle da acquario, un sistema di valvole e una pompa per aria. Collegare innanzitutto la parte corta e tagliata del tubo dell'aria alle pietre per bolle.Quindi collegare le pietre al sistema di valvole. Successivamente collegare il sistema di valvole alla pompa. Dopo aver attivato la pompa, la persona in scena regola la valvola per controllare la portata d'aria.Il flusso d'aria deve essere sufficiente a fornire ossigeno senza danneggiare il sistema radicale. Posizionare ora la lastra di poliuretano con le piantine nell'allestimento idroponico. Coprire i lati del contenitore per limitare la luce che raggiunge la soluzione e ridurre la crescita di alghe.Coprire anche le cime dei contenitori con tappi trasparenti per evitare una luce intensa che potrebbe disseccare le piantine appena trapiantate. Una volta che le piante crescono, rimuovere i tappi. Per i ricercatori interessati ai nutrienti vegetali, gli esperimenti idroponici offrono un sistema ideale per testare le risposte delle piante a diverse condizioni nutrizionali, modificando le concentrazioni degli elementi di interesse.I ricercatori possono impostare condizioni di crescita con quantità di nutrienti sufficienti, carenti o tossiche. Queste sono piantine di Arabidopsis coltivate nel sistema idroponico come descritto nel protocollo. Le piante sono state lasciate crescere per tre settimane nel sistema idroponico prima di modificare la composizione della soluzione idroponica.La persona nella scena sta rinnovando la soluzione idroponica prima di somministrare il trattamento alle piante. È stata utilizzata una soluzione madre dell'elemento tossico cadmio per arricchire la soluzione idroponica. La concentrazione di cadmio utilizzata in questo esperimento era di 20 micromolari.Dopo la preparazione della soluzione, le piante vengono reinserite nei loro contenitori. Dopo sei giorni di trattamento, le piante esposte al cadmio hanno mostrato un ritardo nella crescita e sintomi di clorosi. Si osserva inoltre una riduzione della biomassa di fusto e radici.Questa figura mostra un esperimento diverso su piante di Arabidopsis coltivate in un sistema idroponico e trattate con diverse concentrazioni di zinco. Le piante coltivate a concentrazioni di zinco superiori a 42 micromolari hanno mostrato un ritardo nella crescita a causa dell'elevata concentrazione di zinco. Allo stesso tempo, le piante senza zinco aggiunto hanno mostrato un ritardo nella crescita dovuto alla carenza di zinco, rispetto alle piante coltivate con 7 micromolari di zinco.In conclusione, questo sistema idroponico è economico e facilmente scalabile. Permette di testare la sensibilità delle piante a elementi tossici o di studiare i requisiti nutrizionali delle piante. Sia le radici che le parti aeree possono essere osservate e raccolte separatamente per analisi elementari o analisi dell'espressione genica.

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Fonte: Nathoo, N., et al. Un sistema di co-coltivazione idroponica per l'analisi simultanea e sistematica delle interazioni molecolari pianta/microbo e della segnalazione. J. Vis. Exp. (2017).Questo video mostra un sistema di co-coltivazione idroponica per lo studio delle interazioni pianta-batteri in condizioni sterili. Le piantine delle piante vengono trasferite in un terreno di coltura sterile e acido, incubate e ispezionate per verificare la presenza di contaminazioni prima...

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Un sistema di co-coltivazione idroponica per l&#39;analisi simultanea e sistematica delle interazioni molecolari e della segnalazione delle piante / microbe

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