Name: Three-Dimensional Cultura Assay per esplorare Cancer Cell invasività e formazione di tumori Satellite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Impara a creare un sistema di coltura 3D per studiare l'invasività delle cellule tumorali e la formazione di tumori satellite. Questo metodo utilizza collageno e fibrina per modellare il microambiente extracellulare.

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Lavoro parzialmente finanziato da Prostate Cancer Canada (sovvenzione # D2014-4 a SG e CJD) e dal Canadian Institutes of Health Research (sovvenzione # MOP-111069 a SG). Ringraziamo il Dr. Richard Poulin per l'assistenza editoriale e la Sig.ra Chanel Dupont per l'assistenza tecnica.

NOTA: Non etica considerazione dal momento che le cellule tumorali umane e animali sono stati acquistati o gentilmente forniti da noi. 1. Fare collagene spine (Pseudo-primaria del tumore) <ol><li> Preparare una dispersione di collagene. Collagene di tipo I da tendini coda di topo (RTT) possono essere estratti sia e sterilizzati come riportato in precedenza 17, o acquistati. Disperse collagene liofilizzato RTT (3,25-3,50 mg / ml in 0,02 N acido acetico) utilizzando un miscelatore (impostazione alta velocità; cinque 2 min funzionamenti) per una miscelazione uniforme. </li><li> Harvest (tripsina-EDTA, di solito) e utilizzare esclusione trypan blu per il conteggio delle cellule vitali con un emocitometro. Regolare la densità cellulare desiderato (5 x 10 4 cellule per spina). </li><li> Preparare tutte le soluzioni (NaOH, siero fetale bovino, DMEM 5x, NaHCO 3) separatamente (Tabella 1) in condizioni sterili e mantenere refrigerata in ghiaccio. Nota: L&#39;ordine di aggiunta dei vari soluzioni è importante per evitare shock osmotici o acidi nelle cellule. </li><li> Eseguire dispersione cella (1,25 x 10 6 cellule) nella soluzione di collagene finale (5 ml) più rapidamente possibile. Mescolare bene (pipettando su e giù) evitando bolle d&#39;aria, e quindi distribuire rapidamente 200 microlitri della soluzione pronta all&#39;uso in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. colpire delicatamente la piastra multi-bene sulla superficie della cappa di coltura cellulare di lavoro per rimuovere le bolle d&#39;aria e diffondere uniformemente la soluzione all&#39;interno dei pozzetti. </li><li> Dopo aver riempito fino tutti i pozzetti (questo passaggio richiede circa 15-20 minuti per ogni piastra a 96 pozzetti), memorizzarlo in incubatrice. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C da 2 ore a notte. Il collagene gelificazione (cioè, fibrillogenesi) si verifica entro 30 min. Aggiungere terreno di coltura (100 ul / pozzetto) alla cultura per eseguire una notte di incubazione. </li></ol> 2. Primo strato di fibrina gel <ol><li> Fibrinogeno preparazione della soluzione. NOTA: Lo stesso lotto di gel di fibrina dovrebbe idealmente essere utilizzato per Resul più riproducibilets, formazione di gel di fibrina come può variare tra i diversi lotti di fibrinogeno liofilizzato commerciale. <ol><li> Usare sempre una soluzione di fibrinogeno preparati al momento. Portare il fibrinogeno liofilizzato a temperatura ambiente prima di aprire il flacone per evitare la formazione di cristalli di idrati. </li><li> Progressivamente sciogliere il fibrinogeno in pre-riscaldato (37 ° C) soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con Ca 2+ / Mg 2+ ad una concentrazione di lavoro di 3 mg / ml (non preparare un eccesso del 15% del volume finale minima necessaria : ad esempio, 17.25 mg a 5,75 ml di soluzione 5 ml). <ol><li> Aggiungere pre-riscaldato a gocce HBSS in un primo momento per solubilizzare frammenti di fibrinogeno. Abbattere i frammenti più grandi con una spatola nel bicchiere. Agitare il bicchiere di volta in volta a facilitare la miscelazione. Non usare una piastra di agitatore durante la procedura. Sciogliere la polvere rimanente pipettando sospensione su e giù. </li></ol></li><li> Conservare la soluzione di fibrinogeno tiepida mentre sterilizing la soluzione passa attraverso un filtro di 0,22 micron. Nota: se il HBSS non è abbastanza caldo o il fibrinogeno non completamente dissolto, la soluzione può intasare il filtro. Se del caso, sostituire il filtro una o due volte, che possono ridurre la concentrazione di fibrinogeno, e la rigidità quindi coagulo di fibrina. </li><li> Sospendere le cellule di interesse (ad esempio, cellule endoteliali) in soluzione di fibrinogeno pronta per l&#39;uso durante la regolazione il volume finale, quale procedura alternativa. </li></ol></li><li> Preparare le soluzioni di trombina. <ol><li> Preparare una soluzione madre in DDH 2 O (50 NIH unità / ml), quindi sterilizzarlo con un filtro 0,22 micron. </li><li> Utilizzare un rapporto / trombina fibrinogeno ≥1: 0,0075 (v / v) per generare il gel di fibrina. </li></ol></li><li> Generazione del gel di fibrina. <ol><li> Tenere il fibrinogeno e trombina sterili soluzioni stock su ghiaccio durante tutte le fasi successive. I gel di fibrina possono formare in piastre da 24 pozzetti. </li><li> Prontamente sovrapposizione °e la superficie di ciascun pozzetto con la soluzione di fibrinogeno (200 pl / pozzetto) evitando la formazione di bolle d&#39;aria. Processo 6 pozzetti alla volta. </li><li> Una volta che la soluzione di fibrinogeno copre completamente la superficie dei pozzetti, inclinare il piatto in un angolo di 45 ° e aggiungere 1,5 ml di soluzione di trombina al primo pozzo facendo cadere la trombina al centro del pozzo, e poi ruotare delicatamente la piastra orizzontale per 1-2 sec. <ol><li> Lasciare la piastra in posizione stabile sotto cappa a flusso laminare (5-10 min) fino a quando il processo di gelificazione / coagulazione ha completato (NB: il processo di polimerizzazione non deve essere disturbato, ad esempio, trasportando la piastra alla incubatore). </li></ol></li><li> Una volta che i primi sei pozzi sono polimerizzati, ripetere la stessa sequenza (cioè i 3 passaggi precedenti) per i prossimi sei pozzi fino a quando tutti i pozzetti sono stati elaborati. </li></ol></li></ol> 3. secondo strato di fibrina gel e sandwich collagene Plug <ol><li> OpzioneA: (Utilizzo del plug collagene immediatamente). <ol><li> Assicurarsi che il primo strato di gel di fibrina è polimerizzato in tutti i pozzetti con delicatezza, inclinando la piastra. Posizionare la piastra a 96 pozzetti contenente lato tappi di gel di collagene fianco con piastra da 24 pozzetti (contenente gel di fibrina) per facilitare il trasferimento dei tappi di collagene. </li><li> Aggiungere una goccia di HBSS in ciascun pozzetto della piastra contenente i tappi di collagene. </li><li> Rimuovere ciascun tappo collagene dal pozzo con un ago sottile montato su una siringa (usato come una maniglia) o utilizzando un micro-cucchiaio (vedi video). Trasferire ogni spina collagene sul primo strato di gel di fibrina utilizzando uno o due micro-cucchiai, facendo in modo che il tappo di collagene sia ben centrato nel bene e che la sterilità è ben mantenuto. </li><li> Sovrapporre il gel di fibrina precedentemente formato con il secondo strato di soluzione di fibrinogeno (300 ml / pozzetto) e introdurre la trombina come descritto in 2.3, mantenendo una minima 1:. Rapporto di 0,0075 e una sequenza di sei pozzetti alla volta &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Opzione B (rivestimento Plug collagene con un sottile strato di Growth Factor-ridotto membrana basale (GFRBM)). <ol><li> Raffreddare tutte le soluzioni preparate e gli strumenti in anticipo e tenerli a 4 ° C o su ghiaccio (ad esempio, pipette, consigli, provette) durante la movimentazione da aliquote congelate di GFRBM sono molto sensibili alla velocità di riscaldamento eccessivo durante lo scongelamento (seguire le istruzioni del produttore) . </li><li> Dopo la rimozione dai pozzetti della piastra, immergere ogni spina collagene per 2 minuti in una provetta da centrifuga da 1,5 ml su ghiaccio contenente 100 ml di una soluzione GRFBM puro. </li><li> Trasferire ciascun tappo rivestito sul primo strato di fibrina assicurando è ben centrata, come descritto in precedenza. Incubare le piastre a innesto contenente a 37 ° C per 5 minuti per consentire la GRFBM per formare un gel. Aggiungere il secondo strato di fibrina come al punto 3.1.4. </li></ol></li></ol> 4. colture cellulari condizioni medie <ol><li> Riempire ogni pozzetto con terreno di coltura (400 ml). I terreni di coltura e supplementi saranno selezionati in base alla linea cellulare e condizioni sperimentali. </li><li> Aggiungere aprotinina, un agente antifibrinolitico, al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 100 unità di inibitore callicreina (KIU) / ml. NOTA: Conservare le piastre in un incubatore di coltura cellulare nelle condizioni utilizzate per la linea cellulare testato. </li><li> Rifornire culture con terreno fresco ogni altro giorno o in base alla pianificazione sperimentale, e aggiungere aprotinina. Prima di aggiungere mezzo fresco, inclinare leggermente la piastra (con un angolo di 30-35 °) e inclinare il pipetta contro il lato del bene mentre accuratamente aspirazione terreno condizionato sotto costante osservazione. </li></ol>

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Gli autori non hanno alcuna divulgazione.

Come importante nota tecnica, è essenziale che non gap è presente all&#39;interfaccia tra la centrale ei gel periferici. Altrimenti, si potrebbe ridurre la capacità delle cellule di migrare / invadere il gel di fibrina. Uno spazio tra il collagene e gel di fibrina possono formarsi durante il primo 24 ore di coltura se trombina non è stato opportunamente diluito. È anche possibile che la linea cellulare testato potrebbe portare il gel di collagene per contrarre durante la coltura, causando così uno spazio relativamente g...

Indagare le caratteristiche fondamentali e biomediche di invasione delle cellule tumorali / migrazione e la successiva creazione di metastasi è oggetto di un intenso lavoro di ricerca 1,2. Metastasi è la fase finale di cancro e la sua gestione clinica resta sfuggente. Una migliore comprensione di metastasi a livello cellulare e molecolare consentirà lo sviluppo di terapie più efficaci 3. Diverse proprietà di cellule metastatiche possono essere esplorate in vitro 4 compreso il loro stemness e potenziale per acquisire uno stato di transizione (per esempio, epithelioid-mesenchimale transizione) di migrare e invadere all&#39;interno e dal tumore primario 5. Tuttavia, la valutazione in vitro di processi / metastasi invasione è stata una sfida poiché esclude praticamente il contributo del sangue / circolazione linfatica. colture organotipiche che incorporano frammenti di tumore in gel di collagene hanno Precesornione stato utilizzato per monitorare l&#39;aggressività del cancro. Anche se la complessità dei tumori è conservata (ad esempio, la presenza di cellule non cancerose), frammenti di tumore sono esposti a limitata diffusione media, la variazione di campionamento, e ad una crescita eccessiva di cellule stromali 6. Un metodo alternativo consiste nel crescere cellule tumorali all&#39;interno dei componenti della matrice extracellulare (ECM), che imita l&#39;ambiente cellulare tridimensionale (3D). La proliferazione di linee cellulari di cancro al seno in un gel di collagene e / o una matrice membrana basale-derivato è tra gli esempi meglio caratterizzati di coltura cellulare 3D. Utilizzando specifici ambienti di coltura cellulare 3D, il gruppo disorganizzato osservata per le cellule del cancro al seno coltivate in condizioni standard può essere invertito per la formazione spontanea di acini mammaria e strutture tubolari 7-10. Inoltre, la formazione di sferoidi tumorali multicellulari derivate da cellule tumorali adenocarcinoma congregata con tecniche diverse (ad esempio, appeso gocce, sferoidi galleggiante, agar embedment) ora costituisce la coltura delle cellule 3D test più comunemente usato 11-13. Tuttavia, questo test è limitata dal ristretto insieme di linee cellulari tumorali che possono formare sferoidi e dal breve periodo a disposizione per studiare le cellule in queste condizioni. In questa tecnica visualizzata, abbiamo qui introduciamo un sofisticato test di coltura cellulare 3D in cui le cellule tumorali di interesse sono incorporati in un gel di collagene per consentire la formazione in vitro di un tumore pseudo-primario che può essere alternativamente rivestita con una matrice di membrana derivate interrato. Una volta formato, il tumore pseudo-primaria viene poi inserita in una matrice acellulare (gel di fibrina nel presente caso), che permette alle cellule tumorali di attraversare l&#39;interfaccia tra i due compartimenti matrice (vedi Figura 1). È interessante notare che le strutture di tumore-come secondarie provenienti dal tumore pseudo-primaria con le cellule tumorali aggressive appaiono nelgel di fibrina. Tale sistema di coltura 3D offre la flessibilità necessaria per indagare, ad esempio, farmaci antitumorali, espressione genica e cellula-cellula e / o interazioni cellula-ECM 14-16. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig1.jpg" /> Figura 1:.. Panoramica del metodo di sintesi schematica del metodo per generare il sistema di coltura cellulare 3D come modello per lo studio del cancro <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Collagene liofilizzato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td><td>da tendine di coda di ratto (dispersione solubile) o fatto in casa (vedi Rajan et al., ref.#14)</td></tr><tr><td>Fibrinogeno (liofilizzato)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F8630</td><td>Tipo I-S, 65 - 85% di proteina con &ge; 75% di proteina è coagulabile</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>605157</td><td>&nbsp; Gibbstown, NJ; Unità NIH/mg di peso secco&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel ridotto con fattore di crescita</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>precedentemente da BD Biosciences</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279&nbsp;</td><td>&nbsp; soluzione a 5 - 10T UI/ml (Unità Inibitore della Tripsina)&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Micro-cucchiai</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td>Fisherbrand Handi-Hold Microspatula</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti, base rotonda</td><td>Sarstedt</td><td>3925500</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle's Medium</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>D5546</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>VWR</td><td>CAA15-701</td><td>FBS, origine canadese.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata&nbsp;</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>H8264</td><td>HBSS</td></tr></tbody></table>

three-dimensional cultura assay per esplorare cancer cell invasività e formazione di tumori satellite

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

colture cellulari di mammifero in monostrati è ampiamente usato per studiare i vari processi fisiologici e molecolari. Tuttavia, questo approccio per studiare le cellule in crescita genera spesso artefatti indesiderati. Pertanto, coltura cellulare in un ambiente tridimensionale (3D), spesso utilizzando componenti della matrice extracellulare, emerso come un&#39;alternativa interessante per la sua somiglianza al nativo nel tessuto vivo o organo. Abbiamo sviluppato un sistema di coltura cellulare 3D utilizzando due compartimenti, cioè (i) un vano centrale contenente cellule tumorali annegate in una recitazione gel di collagene come tumore macrospherical pseudo-primaria e (ii) un vano privo di cellule periferiche in un gel di fibrina, cioè un componente della matrice extracellulare diverso da quello utilizzato nel centro, in cui le cellule tumorali può migrare (anteriore invasione) e / o formare tumori microspherical rappresentano tumori secondari o satellitari. La formazione di tumori satellite nel compartimento periferico ènotevolmente correlata all&#39;aggressività noto o l&#39;origine metastatica delle cellule tumorali native, che rende questo sistema di coltura 3D unica. Questo approccio coltura cellulare può essere considerata per valutare invasività cancro delle cellule e la motilità, interazioni cellula-matrice e come un metodo per valutare le proprietà anti-cancro droga.

Come precedentemente accennato, una caratteristica interessante di questo test coltura cellulare 3D è che le cellule tumorali possono non solo migrare dalla spina collagene al gel di fibrina adiacente, ma anche stabilire tumori secondari (strutture ad esempio, satellite tumore-like). Questo può essere direttamente osservata con un microscopio a contrasto di fase invertito a bassi e alti ingrandimenti attraverso lo spessore di gel, in particolare con una distanza di lavoro conden...

Le cellule tumorali vengono incorporate in un gel di collagene e poi inserite in un gel di fibrina acellulare per generare un sistema di coltura 3D in cui l'invasività e la formazione di tumori satelliti possono essere monitorate.

Three-Dimensional Cultura Assay per esplorare Cancer Cell invasività e formazione di tumori Satellite

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di incapsulare cellule tumorali immerse nel collagene all'interno di un gel di fibrina per generare un sistema di coltura tridimensionale utile al monitoraggio dell'invasività e della formazione di tumori satelliti. Il nostro sistema di coltura 3D può offrire nuove prospettive per lo studio di diversi tipi cellulari e di molte varianti chiave durante l'apoptosi o la migrazione delle cellule tumorali, oppure per valutare l'efficacia dei trattamenti contro la perdita di cellule neoplastiche. Un aspetto interessante di questo modello di coltura cellulare 3D è la possibilità di modificare la concentrazione della matrice extracellulare o di utilizzare una diversa matrice extracellulare per l'assemblaggio del sistema tridimensionale.La procedura sarà dimostrata da Marie-France Cote, assistente di ricerca del mio laboratorio, e da Audrey Turcotte, una studentessa laureata sotto la mia supervisione. Iniziare mescolando la collagena di tipo I proveniente dal tendine della coda del ratto liofilizzata, effettuando cinque mescolamenti di due minuti ciascuno alla velocità massima, per disperdere uniformemente il collagene.Mentre viene incorporat

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Un test per misurare quantitativamente fattore di crescita trasformante (TGF)-β-indotta invasione in 3-dimensionale gel collagene è descritto. Questo saggio si avvale della MCF10A serie di linee cellulari, che rappresentano diversi stadi di sviluppo del cancro al seno. Questo metodo può essere adottato per essere utilizzato con altre linee cellulari e può essere utilizzato per indagare altri potenziali attivatori o inibitori di invasione.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

Questo video fornisce una metodologia dettagliata per far crescere cellule di cancro al seno in una matrice proteica di membrana basale 3D, esemplificando il potenziale della coltura 3D nella valutazione dell'invasione cellulare nell'ambiente circostante.

Saggio della membrana basale di coltura 3D: coltura di cellule tumorali su matrice proteica della membrana basale 3D per studiare l'invasione cellulare

Questo video mostra un metodo per stabilire una co-coltura tridimensionale di sferoidi tumorali e cellule T. Viene preparato un calco di agarosio con micropozzetti contenenti sferoidi tumorali, seguito dall'aggiunta di cellule T. Dopo l'incubazione, questa configurazione consente di studiare l'interazione delle cellule T con gli sferoidi tumorali in un ambiente tridimensionale controllato.

Un modello tridimensionale di co-coltura di cellule T infiltranti negli sferoidi tumorali

Questo articolo presenta un metodo per etichettare fluorescently collagene che può essere ulteriormente utilizzato sia per correzione e di imaging vivo di colture cellulari 3D. Forniamo anche un protocollo ottimizzato per visualizzare endogene proteine ​​del citoscheletro delle cellule coltivate in ambienti 3D.

Rivelare l&#39;organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D

Tre coltura tridimensionale di cellule epiteliali mammarie su una membrana basale ricostituita è un metodo utile ricordare l'architettura in vivo del seno benigno, e per differenziare il fenotipo maligno dal fenotipo seno benigno. È importante sottolineare che questo sistema può essere applicato a studiare carcinomi invasivi in ​​altri tessuti.

Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

Questo articolo fornisce metodologie dettagliate per l'utilizzo di tridimensionali (3D) test per quantificare l'invasione delle cellule di cancro al seno. In particolare, discuteremo le procedure necessarie per configurare tali analisi, quantificazione e analisi dei dati, così come i metodi per esaminare la perdita dell'integrità della membrana che si verifica quando le cellule invadono.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

Qui presentiamo un protocollo per la co-coltura in tre dimensioni, che è utile per studiare le interazioni multicellulari e la modulazione dipendente dalla matrice extracellulare del comportamento delle cellule tumorali. In questo modello sperimentale, le cellule tumorali vengono coltivate su gel di collagene incorporati con fibroblasti umani associati al cancro.

Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Questo metodo valuta l'invasione delle cellule tumorali dagli sferoidi in una matrice 3D circostante.  Gli sferoidi vengono generati con il metodo della coltura a goccia sospesa e quindi incorporati in una matrice composta da materiali a membrana basale e collagene di tipo I.  L'invasione degli sferoidi viene successivamente monitorata.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

I processi che governano l'invasione della vescica cancro rappresentano opportunità di biomarcatore e sviluppo terapeutico. Qui vi presentiamo un modello di invasione del cancro della vescica che incorpora 3-d cultura di sferoidi di tumore, time-lapse imaging e microscopia confocale. Questa tecnica è utile per definire le caratteristiche del processo invasivo e per lo screening di agenti terapeutici.

Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Impara a creare un sistema di coltura 3D per studiare l'invasività delle cellule tumorali e la formazione di tumori satellite. Questo metodo utilizza collageno e fibrina per modellare il microambiente extracellulare.

Three-Dimensional Cultura Assay per esplorare Cancer Cell invasività e formazione di tumori Satellite

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