Laser di Thulium ad onda continua per la cottura delle cellule coltivate per indagare gli effetti termici cellulari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare le risposte biologiche cellulari dose-dipendenti termiche in vitro riscaldando cellule in coltura con un controllo preciso della temperatura e del tempo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi che studiano le risposte cellulari o tissutali all'ipertermia, come lo studio del trattamento laser della retina. Il vantaggio principale di questa tecnica è un rapido riscaldamento delle celle e un controllo preciso della durata del riscaldamento, consentendo un'elevata esposizione termica riproducibile durante gli esperimenti.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle risposte delle cellule epiteliali pigmentate retiniche in coltura all'irradiazione laser termica, può essere applicato anche ad altri modelli come le cellule tumorali. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo riscaldato le cellule contenenti melanina con luce laser visibile. Tuttavia, ciò ha comportato profili di temperatura variabili a causa delle variazioni di pigmentazione.

Per iniziare la procedura, posizionare una piastra riscaldante in un supporto da laboratorio in metallo regolabile su un banco pulito. Impostare la piastra riscaldante a 39 gradi Celsius. Fissare una fibra da 0,22 NA con un diametro del nucleo di 365 micrometri al braccio orizzontale del supporto.

Posizionare il braccio di metallo sopra la piastra riscaldante e regolare il supporto in modo che la punta della fibra si trovi a 12 centimetri sopra la piastra riscaldante. Collegare un laser al tulio da 1,94 micrometri e 20 watt con un raggio di puntamento da 365 nanometri da un milliwatt alla punta della fibra. Posizionare un piatto di coltura di 30 millimetri di diametro sulla piastra calda.

Tracciare con cura la circonferenza del piatto sulla superficie della piastra riscaldante e quindi rimuovere il piatto. Accendere il raggio di puntamento e regolare il supporto finché il centro del punto del raggio sulla piastra riscaldante non corrisponde al cerchio tracciato. Quindi spegnere il raggio di puntamento.

Per iniziare la procedura di calibrazione della temperatura, riscaldare la punta di un ago calibro 20 con un bruciatore Bunsen. Con la punta dell'ago riscaldata, forare la piastra di coltura di 30 millimetri di diametro vicino al fondo in quattro punti a 90 gradi di distanza l'uno dall'altro per praticare fori di circa 300 micrometri di diametro. Posizionare del nastro isolante sui fori.

Utilizzare un ago sottile per praticare un foro di circa 200 micrometri di diametro attraverso il nastro che copre ogni foro. Sul lato inferiore del piatto di coltura, traccia una linea tra ogni coppia di fori a 180 gradi di distanza. Partendo dall'intersezione delle linee, segnare ogni tre millimetri radialmente lungo ciascuna linea per designare i 21 punti di misurazione.

Quindi posizionare esattamente 1,2 millilitri di terreno di coltura fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius nel piatto. Coprite il piatto e posizionatelo nel cerchio tracciato sulla piastra calda. Collegare una termocoppia con un diametro di 200 micrometri al computer di controllo laser e aprire il protocollo di calibrazione della temperatura.

Inserire la termocoppia in uno dei fori della piastra in modo che la punta si trovi sul fondo della capsula in una delle posizioni del segno. È molto importante controllare se la punta della termocoppia tocca il fondo del piatto con la precisione misurata perché la temperatura può variare in base alla profondità. Attendere che il terreno di coltura si stabilizzi a 37 gradi Celsius.

Quindi accendi il laser al tulio e imposta la potenza del laser al livello iniziale desiderato. Verificare che la durata del preriscaldamento sia impostata su 140 e otto secondi, quindi avviare la sequenza di irradiazione del preriscaldamento. Dopo 140 secondi, come indicato da un segnale acustico, rimuovere immediatamente il coperchio del piatto di coltura.

Attendere che il preriscaldamento termini e che si verifichi l'irradiazione di 10 secondi. Quindi coprire immediatamente il piatto. Misurare la temperatura nelle posizioni dei 21 segni in questo modo.

Eseguire questa procedura tre volte ciascuna a intervalli di potenza di tre watt che coprono la gamma di potenza del laser. Una volta terminato, spegnere il laser al tulio. Esporta e analizza i dati di temperatura.

Prima dell'esperimento, la coltura ha noleggiato cellule epiteliali pigmentate in piastre di coltura di 30 diametri. Mantenere le colture cellulari a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% e controllarle utilizzando un sistema di imaging di cellule vive. Un'ora prima dell'irradiazione, sostituire il terreno di coltura in ogni piatto con esattamente 1,2 millilitri di terreno di coltura fresco.

Restituisci le colture all'incubatrice. Verificare che la stazione di irradiazione sia pronta e che la piastra riscaldante sia impostata a 39 gradi Celsius. Quando si è pronti per iniziare l'irradiazione, avviare il laser al tulio alla potenza desiderata.

Aprire il protocollo dell'esperimento e verificare che la durata del preriscaldamento sia impostata su 140 e otto secondi. Posizionare una coltura cellulare RPE in una piastra chiusa nella posizione contrassegnata sulla piastra riscaldante e avviare immediatamente la sequenza di irradiazione di preriscaldamento di 140 e otto secondi. Rimuovere il coperchio del piatto dopo 140 secondi di preriscaldamento.

Attendere che il preriscaldamento termini e che si verifichi l'irradiazione di 10 secondi. Coprire immediatamente il piatto, attendere sette secondi, quindi rimettere il piatto nell'incubatrice. Irradiare campioni aggiuntivi all'aumentare dei livelli di potenza del laser.

Al termine, spegnere il laser al tulio. Per iniziare la valutazione della vitalità cellulare, lavare le cellule irradiate con PBS. Procurati un kit in grado di differenziare cellule vive apoptotiche e necrotiche.

Quindi, in condizioni di scarsa illuminazione, combinare 500 microlitri di tampone legante con 25 microlitri di omodimero di etidio-3, annessina FITC e Hoechst 33342. Incubare le cellule in questa soluzione colorante a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi lavare due volte le cellule con il tampone legante 1X.

Sostituire il tampone di legame con PBS e posizionare la cellula sul tavolino di un microscopio a fluorescenza dotato di filtri DAPI, FITC e TRITC. Impostare il percorso della luce del microscopio sulla lente oculare e selezionare il filtro DAPI. Accendi la luce di illuminazione e trova il piano di messa a fuoco con una lente dell'obiettivo 4X.

Impostare il percorso della luce verso la fotocamera del microscopio. Utilizzare il software di imaging del microscopio per centrare e mettere a fuoco l'immagine. Definire i parametri per l'acquisizione delle immagini utilizzando il filtro DAPI.

Ripetere il processo di messa a fuoco e la configurazione dell'acquisizione delle immagini con i filtri FITC e TRITC. Quindi utilizzare il software di imaging per acquisire più immagini con tre set di filtri sulla piastra e combinarle in un'unica immagine dell'intera piastra di coltura. Utilizza un software analitico per determinare le soglie di temperatura per l'apoptosi e la morte cellulare.

La relazione proporzionale tra l'aumento massimo della temperatura al centro di una piastra di coltura cellulare e la potenza del laser è stata determinata dalla procedura di calibrazione termica descritta. La distribuzione massima della temperatura attraverso la piastra di coltura cellulare è stata quindi adattata a una funzione gaussiana. Dopo l'irradiazione sono stati osservati tre modelli di colorazione.

Non è stato osservato alcun cambiamento di vitalità nelle colture sottoposte a temperature pari o inferiori a 43 gradi Celsius. L'apoptosi è stata osservata per la prima volta tre ore dopo l'irradiazione a 47 gradi Celsius. La morte cellulare è stata osservata più tardi di tre ore dopo i 51 gradi Celsius e oltre.

Le temperature medie di soglia per l'apoptosi e la morte cellulare sono state quindi determinate applicando la media dei raggi misurati delle aree morte e apoptotiche alla funzione gaussiana che descrive la distribuzione della temperatura. Seguendo questa procedura, le irradiazioni possono essere eseguite in molte condizioni diverse, come diversi profili laser, dimensioni dello spot e tempi di irradiazione. Questo può aiutare a comprendere e indagare le domande relative alle cause individuali della temperatura temporizzata a livello cellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riscaldare la coltura cellulare con un buon controllo della temperatura e del tempo. Ciò potrebbe dipendere dalle possibilità di studiare le risposte biologiche a diverse condizioni di irradiazione termica. Non dimenticare che lavorare con i laser può essere molto pericoloso per gli occhi e la pelle.

Tieniti informato sulla formazione sulla sicurezza dell'irradiazione laser. Indossare sempre occhiali di sicurezza, camice da laboratorio e guanti adeguati durante l'esecuzione di questa procedura.