Name: In vitro e in modelli in vivo per studiare transizione corneale endoteliale-mesenchimale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Scopri la transizione endoteliale-mesenchimale corneale in modelli in vitro e in vivo utilizzando cellule endoteliali bovine e un modello di criolesione nel ratto. Questo metodo aiuta a studiare la rigenerazione corneale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo il personale del Second Core Lab, Dipartimento di Ricerca Medica, Ospedale Universitario Nazionale di Taiwan per il loro supporto tecnico.

Tutte le procedure seguite in questo studio accordato con l&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia Dichiarazione per l&#39;uso degli animali in oftalmica e Vision Research e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali del National Taiwan University Hospital. 1. Isolamento, coltura primaria Preparazione e Immunocolorazione bovina CEC <ol><li> Acquisire gli occhi bovino fresco da un mattatoio locale. </li><li> Disinfettare gli occhi in un 10% w / v soluzione di iodio-povidone per 3 min. Lavare con una soluzione tampone fosfato (PBS). </li><li> Raccogliere il pulsante corneale con un bisturi e forbici in condizioni sterili. Membrana Peel della Descemet con una pinza sotto un microscopio da dissezione (si noti che in questo studio, gli occhi bovini sono stati enucleati da un mattatoio locale, pertanto, la prima procedura di studio era la disinfezione degli occhi preenucleated in laboratorio). </li><li> Incubare la membrana di Descemet in 1 ml di provaPSIN a 37 ° C per 30 min. Raccogliere i PEC bovine per centrifugazione a 112 g per 5 min. Risospendere le cellule in 1 ml di integrazioni media epiteliale ormonale (SHEM) contenente volumi uguali di HEPES-buffered medio di Dulbecco Modified Eagle e medie F12 di Ham, integrato con 5% di siero fetale bovino, 0,5% dimetilsolfossido, 2 ng / ml di epidermico umano fattore di crescita, 5 mg / ml di insulina, 5 mg / ml di transferrina, 5 ng / ml di selenio, 1 nmol / l di tossina colerica, 50 mg / ml di gentamicina, e 1,25 mg / ml di amfotericina B. </li><li> Seme le cellule (circa 1 x 10 5 cellule per occhio) in un piatto di 6 centimetri. loro cultura nel SHEM. Incubare il piatto a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2 in aria. Modificare il terreno di coltura ogni 3 giorni. </li><li> Quando le cellule raggiungono confluenza, lavarli in PBS e incubare in 1 ml di tripsina a 37 ° C per 5 min. li Raccogliere per centrifugazione a 112 xg per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di SHEM. <ol&gt; <li> Contare le cellule in un emocitometro. Seme le cellule su vetrini di copertura ad una densità di 1 x 10 4 per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti, e la cultura nelle cellule del SHEM. Per indagare l&#39;effetto EnMT di soppressione di Marimastat, incubare le cellule in SHEM con 10 micron di Marimastat aggiunti nel terreno di coltura, e cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni. </li></ol></li><li> Fissare le cellule in un punto di tempo indicato con 250 ml di paraformaldeide al 4%, pH 7,4, per 30 min a temperatura ambiente. Permeabilize con 250 ml di 0,5% Triton X-100 per 5 min. Blocco con 10% di sieroalbumina bovina per 30 min. </li><li> Incubare le cellule con anticorpi primari contro attivo beta-catenina (ABC), lumaca, e lumaca notte a 4 ° C. La diluizione degli anticorpi primari utilizzati è di 1: 200. Gli anticorpi sono diluiti in diluente anticorpale composto di 10 mM PBS, 1% w / v di BSA e 0,09% w / v di sodio azide. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS per 15 min, e incubare lam con l&#39;anticorpo Alexa Fluor-coniugato secondario (1: 100 nel diluente) a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Controcolorare nucleo della cellula coprendo le cellule con 2 ug / ml di 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo, lavare le cellule due volte con PBS per 15 min, e montarli con anti-sbiadimento soluzione di montaggio. </li><li> Ottenere immagini di immunofluorescenza alle lunghezze d&#39;onda di eccitazione di 405 e 488 nm utilizzando un scansione laser microscopio confocale con 20X ingrandimento dell&#39;obiettivo. </li></ol> Modello 2. Rat endotelio corneale Cryoinjury e Intracameral Iniezione <ol><li> Anestetizzare 12 settimane di età ratti maschi Sprague-Dawley con iniezioni intramuscolari di 2% xilazina (5,6 mg / kg) e tiletamina più zolazepam (18 mg / kg). Delicatamente pizzicare la pelle degli animali per confermare il corretto anestesia in assenza di contrazioni della pelle. </li><li> Instillare una goccia di 0,5% proparacaina cloridrato per l&#39;occhio destro di ogni ratto per ridurre al minimo dolore agli occhi e lo sbattere delle palpebre. Infonderetetraciclina unguento per l&#39;occhio sinistro per prevenire la secchezza della cornea. </li><li> Raffreddare una sonda in acciaio inossidabile (diametro = 3 mm) in azoto liquido. Applicare la sonda in acciaio inossidabile per la cornea centrale dell&#39;occhio destro per 30 sec. Spesso infondere PBS all&#39;occhio destro durante la procedura per prevenire la secchezza della cornea. </li><li> Instillare 0,1% e dello 0,3% atropina gentamicina solfato subito dopo cryoinjury e una volta al giorno per alleviare il dolore oculare derivante da ciliare spasmo e per prevenire l&#39;infezione. <ol><li> Dopo la procedura, mantenere i ratti calda usando una lampada di calore, e osservare il loro recupero ogni 15 min dopo l&#39;anestesia fino a quando non riprendere il controllo del motore. Inoltre, applicare tetraciclina pomata per l&#39;occhio destro per prevenire la secchezza della cornea durante il periodo di recupero. </li></ol></li><li> Ripetere la cryoinjury corneale per 3 giorni consecutivi. </li><li> Per fornire Marimastat o bFGF nella camera anteriore degli occhi ratto, anestetizzare i topi come descritto in precedenza. Instillare una gocciadel 0,5% proparacaina cloridrato in l&#39;occhio destro per ridurre al minimo dolore agli occhi e lo sbattere delle palpebre. </li><li> Irrigare la superficie oculare con PBS sterile. Eseguire paracentesi camera anteriore sotto un microscopio operatorio inserendo un ago 30 G attaccato ad una siringa da 1 ml a cornea chiara paralimbal in un piano sopra e parallela alla dell&#39;iride. </li><li> Girare l&#39;ago smusso, e un po &#39;deprimono la ferita corneale per drenare un po&#39; di umore acqueo e ridurre la pressione intraoculare. Iniettare 0,02 ml del farmaco intracamerally. comprimere delicatamente il tratto ago con una punta di cotone durante il ritiro dell&#39;ago. </li><li> Fotografare l&#39;occhio esterno in un punto di tempo indicato sotto il microscopio operatorio. </li></ol> 3. La raccolta Rat bottone corneale e Immunocolorazione <ol><li> Per eutanasia i topi, metterli in una camera di eutanasia e di infondere il 100% di CO 2 ad un tasso di riempimento del 10-30% del volume della camera per minuto. Mantenere CO 2 di infusione per unulteriore minuto dopo la mancanza di respiro e colore degli occhi sbiaditi. </li><li> Penetrare l&#39;occhio ratto a limbus con una lama affilata. Tagliare le cornee con le forbici corneali lungo il limbus. Appiattire le cornee di una diapositiva. Fai incisioni radiali supplementari se le cornee rannicchiarsi. </li><li> Fissare le cornee con 250 ml di paraformaldeide al 4%, pH 7,4, per 30 min a temperatura ambiente. Permeabilize con 250 ml di 0,5% Triton X-100 per 5 min, e bloccare con il 10% di sieroalbumina bovina per 30 min. </li><li> Incubare le cornee con anticorpi primari contro ABC notte a 4 ° C con una diluizione di 1: 200 nel diluente. Lavare le cornee due volte con PBS per 15 min, e incubare con l&#39;anticorpo secondario (1: 100 nel diluente) a temperatura ambiente per 1 ora. Controcolorare nucleo della cellula coprendo le cellule con 2 ug / ml di 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo, e lavare le cellule due volte con PBS per 15 min. </li><li> Montare le cornee di anti-sbiadimento soluzione di montaggio. Obtain le immagini di immunofluorescenza alle lunghezze d&#39;onda di eccitazione di 405 e 561 nm con un microscopio confocale a scansione laser a 20X di ingrandimento obiettivo. </li></ol>

<ol><li>Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+location+of+the+fluid+pump+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The location of the fluid pump in the cornea.</a> J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).</li>
<li>Joyce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+capacity+of+the+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Proliferative capacity of the corneal endothelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).</li>
<li>Morishige, N., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bullous+keratopathy+as+a+progressive+disease%3A+evidence+from+clinical+and+laboratory+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies.</a> Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).</li>
<li>Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophakic+bullous+keratopathy%3A+relationship+with+endothelial+cell+density+and+use+of+a+predictive+cell+loss+model.+A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report.</a> Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).</li>
<li>Wilson, S. E., Lloyd, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+its+receptor%2C+basic+fibroblast+growth+factor%2C+transforming+growth+factor+beta-1%2C+and+interleukin-1+alpha+messenger+RNA+production+in+human+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).</li>
<li>Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta2+in+aqueous+humor+suppresses+S-phase+entry+in+cultured+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).</li>
<li>Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDTA%3A+a+promoter+of+proliferation+in+human+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).</li>
<li>Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+corneal+endothelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth of human corneal endothelial cells in culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).</li>
<li>Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+endothelial+cell+expansion+for+corneal+endothelium+transplantation%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview.</a> Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).</li>
<li>Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+expression+in+human+corneal+endothelial+cells+cultured+from+young+and+older+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors.</a> Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).</li>
<li>Ko, M. K., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+FGF-2+on+type+I+collagen+expression+during+endothelial+mesenchymal+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).</li>
<li>Lee, H. T., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-2+induced+reorganization+and+disruption+of+actin+cytoskeleton+through+PI+3-kinase%2C+Rho%2C+and+Cdc42+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells.</a> Mol Vis. 9, 624-634 (2003).</li>
<li>Pipparelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibitor+Enhances+Adhesion+and+Wound+Healing+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells.</a> PloS one. 8 (4), e62095(2013).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li>
<li>Jakobiec, F. A., Bhat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrocorneal+membranes%3A+a+comparative+immunohistochemical+analysis+of+keratocytic%2C+endothelial%2C+and+epithelial+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins.</a> Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ZEB1+and+Snail1+in+excessive+production+of+extracellular+matrix+in+Fuchs+endothelial+corneal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+on+primate+corneal+endothelial+cell+survival+in+vitro+by+a+ROCK+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).</li>
<li>Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+p120+catenin+unlocks+mitotic+block+of+contact-inhibited+human+corneal+endothelial+monolayers+without+disrupting+adherent+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).</li>
<li>Ho, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Matrix+Metalloproteinase+Activity+Reverses+Corneal+Endothelial-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).</li>
<li>Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen+and+fibronectin+synthesis+by+retrocorneal+fibrous+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signal+Regulates+Corneal+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+Inhibitor+Eye+Drop+Accelerates+Corneal+Endothelium+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).</li>
<li>Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+in+corneal+epithelium+and+blood-retina+barrier%3A+emerging+role+of+transporters+in+ocular+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da dichiarare.

PEC sono noti per la loro propensione a subire EnMT durante la proliferazione cellulare. Sviluppare strategie per sopprimere il processo EnMT per scopi terapeutici, una conoscenza approfondita del meccanismo EnMT è necessario. Abbiamo descritto 2 modelli di indagare EnMT, vale a dire la CEC bovina nel modello di coltura in vitro e nel ratto corneale endoteliale modello cryoinjury. I nostri risultati hanno dimostrato il processo EnMT in entrambi i modelli. Inoltre, l&#39;effetto di soppressione...

Le cellule endoteliali corneali (CEC) svolgono un ruolo vitale nel mantenere la chiarezza corneale e quindi l'acuità visiva regolando lo stato di idratazione dello stroma corneale attraverso il pompaggio attivo1. A causa del limitato potenziale proliferativo delle CEC umane, il numero di cellule diminuisce con l'età e la riparazione delle ferite endoteliali corneali a seguito di una lesione è solitamente ottenuta attraverso l'ingrandimento e la migrazione cellulare, piuttosto che la mitosi cellulare2. Quando la conta CEC scende al di sotto di una soglia di circa 500 cellule/mm2, lo stato di disidratazione dello stroma corneale non può essere mantenuto, portando a cheratopatia bollosa e compromissione della vista3,4.
Il limitato potenziale proliferativo delle CEC umane è stato attribuito a diversi fattori, tra cui la ridotta espressione del fattore di crescita epidermico e del suo recettore nelle cellule che invecchiano5, il TGFβ2 antiproliferativo nell'umore acqueo6 e l'inibizione del contatto2,7. Sebbene alcuni fattori di crescita, come il fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF), possano aumentare la proliferazione in un endotelio corneale umano in coltura, l'efficienza della coltura rimane limitata8,9. Inoltre, le CEC possono subire un cambiamento fenotipico durante l'espansione ex vivo, simile alla transizione epiteliale-mesenchimale (EMT)10-13. La transizione endoteliale-mesenchimale (EnMT) è caratterizzata da destabilizzazione della giunzione cellulare, perdita di polarità apicale-basale, riarrangiamento citoscheletrico, espressione di actina della muscolatura liscia alfa e secrezione di collagene di tipoI 14. Tutte queste caratteristiche possono abrogare la normale funzione delle CEC, ostacolando l'uso di CEC coltivate ex vivo nell'ingegneria tissutale. Inoltre, l'EnMT è stata associata alla patogenesi di diverse malattie endoteliali corneali, tra cui la distrofia corneale endoteliale di Fuchs e la formazione della membrana retrocorneale15,16. Pertanto, la comprensione del meccanismo dell'EnMT può aiutare a manipolare il processo EnMT e facilitare la rigenerazione dei CEC per consentire una funzione competente. 
In questo studio, abbiamo descritto un metodo per isolare le CEC bovine dal bottone corneale. Nella coltura primaria in vitro, è stato osservato il processo EnMT, che include un cambiamento fenotipico, la traslocazione nucleare della β-catenina e i regolatori EMT lumaca e lumaca. Abbiamo inoltre descritto un metodo per dimostrare l'EnMT in vivo utilizzando un modello di criolesione dell'endotelio corneale di ratto. Utilizzando questi 2 modelli, abbiamo dimostrato che marimastat, un inibitore della metalloproteinasi della matrice (MMP) ad ampio spettro, può sopprimere il processo EnMT. I protocolli descritti facilitano l'analisi dettagliata del meccanismo EnMT e lo sviluppo di strategie per manipolare il processo EnMT per ulteriori applicazioni cliniche.

<table><tbody><tr><td>tripsina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modificato Eagle medium e Ham's F12 medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>dimetil solfossido</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>fattore di crescita epidermico umano</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>insulina, transferrina, selenio...</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>tossina colera</td><td>Sigma</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>amfotericina B</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 111219</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>marimastat</td><td>Sigma</td><td>M2699-25MG</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo beta-catenina anti-attivo</td><td>Millpore</td><td>05-665</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-lumaca</td><td>Santa cruz</td><td>sc28199</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-lumaca</td><td>Santa cruz</td><td>sc15391</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-topo IgG (H+L) secondario anticorpo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>per la colorazione dell'ABC delle CEC bovine</td></tr><tr><td>anticorpo IgG (H+L) di capra</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11003</td><td>per la colorazione dell'ABC dell'endotelio corneale di ratto</td></tr> capra <tr><td>anticorpo IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>per la colorazione di lumaca e lumaca di CEC bovine</td></tr><tr><td>diluente anticorpale</td><td>Genemed Biotecnologie</td><td>10-0001</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>mezzo di montaggio</td><td>Vector Laboratories Microscopio</td> confocale a scansione laser <td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>xilazina&nbsp;</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>tiletamina più zolazepam</td><td>Virbac</td><td>N/A</td><td>farmaco</td></tr><tr><td>veterinario proparacaina cloridrato soluzione oftalmica</td><td>Alcon</td><td>N/A</td><td>farmaco veterinario</td></tr><tr><td>0,1% atropina</td><td>Wu-Fu Laboratories Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>farmaco clinico&nbsp;</td></tr><tr><td>0,3% gentamicina solfato</td><td>Sinphar Gruppo</td><td>N/A</td><td>farmaco clinico&nbsp;</td></tr><tr><td>fattore di crescita dei fibroblasti di base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>farmaco clinico&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro e in modelli in vivo per studiare transizione corneale endoteliale-mesenchimale

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Le cellule endoteliali corneali (CEC) svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento della chiarezza corneale attraverso il pompaggio attivo. Una riduzione della conta CEC può portare a edema corneale e diminuzione dell'acuità visiva. Tuttavia, i CEC umani sono inclini a compromettere il potenziale proliferativo. Inoltre, la stimolazione della crescita cellulare è spesso complicata dalla graduale transizione endoteliale-mesenchimale (EnMT). Pertanto, la comprensione del meccanismo dell'EnMT è necessaria per facilitare la rigenerazione di CEC con funzione competente. In questo studio, abbiamo preparato una coltura primaria di CEC bovine staccando le CEC con la membrana di Descemet dal bottone corneale e abbiamo dimostrato che le CEC bovine mostravano il processo EnMT, incluso il cambiamento fenotipico, la traslocazione nucleare della β-catenina e i regolatori EMT lumaca e lumaca, nella coltura in vitro. Inoltre, abbiamo utilizzato un modello di criolesione dell'endotelio corneale di ratto per dimostrare il processo EnMT in vivo. Nel complesso, la coltura primaria in vitro di CEC bovine e modelli in vivo di criolesione dell'endotelio corneale di ratto offre piattaforme utili per studiare il meccanismo di EnMT.

Dopo l&#39;isolamento di PEC bovina, le cellule sono state coltivate in vitro. La Figura 1 presenta le immagini contrasto di fase dei PEC bovina. La forma esagonale delle cellule a confluenza indicato che le cellule non sono stati contaminati da corneale fibroblasti stromali durante l&#39;isolamento delle cellule. La Figura 2 illustra l&#39;immunocolorazione che è stata eseguita utilizzando anticorpi contro ABC, lumaca, e in blocco in un punto d...

Una cultura primarie di cellule endoteliali corneali bovini è stato utilizzato per studiare il meccanismo di transizione corneale endoteliale-mesenchimale. Inoltre, un corneale endotelio modello cryoinjury ratto è stato utilizzato per dimostrare corneale endoteliale transizione-mesenchimali in vivo.

In vitro e in modelli in vivo per studiare transizione corneale endoteliale-mesenchimale

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il meccanismo della transizione mesenchimale endoteliale corneale in vitro e in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande riguardanti la transizione mesenchimale endoteliale corneale nel campo della rigenerazione dell'endotelio corneale. Il vantaggio di questa tecnica è che può essere applicata sia ai modelli in vitro che a quelli in vivo.Ed è facile da manipolare. Le implicazioni di questa tecnica puntano verso la terapia delle malattie correlate alla transizione mesenchimale-endoteliale corneale. Ad esempio la formazione, poiché i modelli possono essere utilizzati per selezionare sostanze che inibiscono il processo di transizione mesenchimale-endoteliale corneale.La procedura sarà eseguita da Jung-Shen Chang, un tecnico di laboratorio. Per iniziare la procedura, disinfettare occhi bovini freschi in una soluzione di povidone-iodio al 10% peso per volume per tre minuti. Successivamente, lavarli con PBS.Raccogliere il tasto corneale con un bisturi e delle forbici e lavarlo con PBS. Sotto un microscopio stereoscopico, staccare la membrana di Descemet con pinzette. Successivamente, incubare la membrana di Descemet in un millilitro di tripsina a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Poi, raccogliere le CEC bovine mediante centrifugazione a 112 ×g per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in un millilitro di SHEM. Seminare le cellule in una piastra da sei centimetri e coltivarle in SHEM. Successivamente, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un’atmosfera al 5% di CO2 e sostituire il mezzo di coltura ogni tre giorni.Quando le cellule raggiungono la confluenza, lavarle in PBS. Successivamente, incubarle in un millimetro di tripsina a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Raccoglierle mediante centrifugazione a 112 ×g per cinque minuti.Dopo cinque minuti, risospendere il pellet cellulare in un millimetro di SHEM. Successivamente, contare le cellule utilizzando un emocitometro. Dopodiché, seminare le cellule su coprovetrini in una piastra a 24 pozzetti e coltivare le cellule in SHEM.Per valutare l'effetto inibitorio di Maramastat sulla ENMT, incubare le cellule in SHEM con 10 micromolar di Maramastat nel mezzo di coltura, sostituendo il mezzo ogni tre giorni. Successivamente, fissare le cellule in un punto temporale indicato con 250 microlitri di Paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopodiché, permeabilizzarle con 250 microlitri di Triton X-100 allo 0,5% per cinque minuti.E bloccarli con BSA al 10% per 30 minuti. Successivamente, incubare le cellule con anticorpi primari contro ABC, snail e slug tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, lavare le cellule due volte con PBS per 15 minuti ogni volta.E incubare con l'anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, controcolorare il nucleo cellulare coprendo le cellule con DAPI a due microgrammi per millilitro. Lavare le cellule due volte con PBS per 15 minuti ogni volta.E montarli con una soluzione di montaggio antiossidante prima di acquisire le immagini di immunofluorescenza. Dopo aver anestetizzato un ratto maschio SD di 12 settimane, pizzicare delicatamente la pelle dell'animale per confermare un'adeguata anestesia in assenza di contrazioni cutanee. Successivamente, applicare una goccia di cloridrato di proparacaina 0,5% sull'occhio destro del ratto per ridurre il dolore e il riflesso palpebrale.Successivamente, applicare un unguento a base di tetraciclina sull'occhio sinistro per prevenire la secchezza corneale. Successivamente, raffreddare una sonda in acciaio inox nell'azoto liquido. Applicare la sonda in acciaio inox sulla cornea centrale dell'occhio destro per 30 secondi.Instillare frequentemente PBS nell'occhio destro durante la procedura per prevenire la secchezza corneale e applicare 0,1% Atropina e 0,3% Solfato di Gentamicina immediatamente dopo la criolesione una volta al giorno per alleviare il dolore oculare derivante dallo spasmo ciliare e prevenire infezioni. Dopo la procedura, mantenere il ratto al caldo utilizzando una lampada riscaldante e osservarne il recupero fino al ripristino del controllo motorio. Applicare un unguento a base di Tetraciclina sull'occhio destro per prevenire la secchezza corneale durante il periodo di recupero e ripetere la procedura di criolesione corneale per tre giorni consecutivi.Per somministrare Maramastat o FGF basico all'interno della camera oculare dei ratti, applicare una goccia di cloridrato di Proparacaina 0,5% sull'occhio destro del ratto anestetizzato per ridurre al minimo il dolore e il riflesso palpebrale. Successivamente, irrorare la superficie oculare con PBS sterile. Sotto un microscopio operatorio, eseguire una paracentesi della camera anteriore inserendo un ago da 30 gauge collegato a una siringa da un millilitro nella cornea trasparente paralimbale in un piano superiore e parallelo all'iride. Quindi, ruotare l'ago con la faccia del becco rivolta verso l'alto e premere leggermente sulla ferita corneale per drenare una certa quantità di umor acqueo e ridurre la pressione intraoculare.Iniettare 0,02 millilitri del farmaco per via intracamerale e comprimere delicatamente il tratto del ago con un bastoncino di cotone durante il ritiro dell'ago. Questa figura mostra le immagini a contrasto di fase delle CEC bovine e delle colture. La forma esagonale delle cellule a confluenza indica che le cellule non sono state contaminate da fibroblasti stromali corneali durante l'isolamento cellulare.Durante la coltura in vitro di CEC bovini, la traslocazione nucleare di ABC, snail e slug è stata rilevata fino al giorno 14. Questa figura illustra l'effetto del Maramastat, un inibitore ampio spettro delle MMP, sul processo di ENMT dei CEC bovini coltivati in vitro. Qui di seguito sono riportate le fotografie dell'occhio esterno di ratti dopo criolesione, seguite da iniezione intracamerali.Le fotografie mostrano una riduzione dell'edema corneale dopo l'iniezione di FGF di base. Maramastat ha ulteriormente ridotto l'edema corneale rispetto al FGF di base somministrato da solo. Questa figura mostra la colorazione immunoistochimica del bottone corneale di ratto mediante anticorpo contro ABC dopo lesione da congelamento seguita da iniezione intracamerali.Il trasloco nucleare di ABC è osservato nel gruppo PBS ed è significativamente aumentato nel gruppo con FGF di base, indicando l'attivazione della segnalazione Wnt Beta-catenina e del processo di ENMT. Dopo iniezione intracambeale di FGF di base seguita da Maramastat, la colorazione nucleare di ABC è ridotta, suggerendo l'effetto inibitore del Maramastat sull'ENMT. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della Transizione Endoteliale-mesenchimale Corneale, In Vitro e In Vivo.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare le cellule endoteliali corneali bovine e di come eseguire una criolesione corneale nonché un'iniezione intracamerali.

in-vitro-vivo-models-to-study-corneal-endothelial-mesenchymal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Il protocollo descrive il dosaggio micropocket corneale come sviluppato nei topi.

Il corneale MICROPOCKET Assay: Un modello di angiogenesi nel Eye mouse

I topi sono stati utilizzati come modello per studiare molte forme di trapianto, incluso il trapianto di cornea.  In questo rapporto descriviamo un modello murino sia per il trapianto di cornea acuto che per quello tardivo.

Murini trapianto di cornea: Un modello per studiare la forma più comune di trapianto di organi solidi

La transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT) consente ai tumori di diventare invasivi. Per studiare l'EMT, viene descritto un modello in vitro basato su cellule staminali neurali (NSC) privo di siero ed enzimi. Questo sistema standardizzato consente la valutazione quantitativa e qualitativa della migrazione cellulare, dell'espressione genica e proteica. Il modello è adatto per la scoperta di farmaci.

Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery

Questo protocollo descrive un romanzo tridimensionale in vitro modello, cui sono coltivate cellule stromal corneale e cellule neuronali differenziate insieme per assistere nell'esame e nella comprensione delle interazioni tra i due tipi cellulari.

Ingegneria tissutale corneale: Un In Vitro modello delle interazioni Stromal-nervo della Cornea umana

Un protocollo per l'induzione in vitro di transizione endoteliali mesenchimali (EndMT), che è utile per investigare le vie di segnalazione cellulare coinvolti nella EndMT, è descritto. In questo modello sperimentale, EndMT è indotta dal trattamento con TGF-β in cellule endoteliali MS-1.

Analisi molecolare di transizione endoteliali mesenchimali indotta dalla trasformazione di segnalazione di fattore di crescita-β

Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

Qui, viene presentato un protocollo passo-passo per la preparazione e la coltivazione di bottoni corneali divisi su porcini. Poiché questo modello di coltura organo-tipicamente coltivata mostra i tassi di mortalità cellulare entro 15 giorni, paragonabili alle cornee dei donatori umani, rappresenta il primo modello che consente la coltivazione a lungo termine di cornee non umane senza aggiungere dextran tossico.

Un modello di cultura dell'organo endoteliale porcina utilizzando i pulsanti corneali divisi

Qui, presentiamo un protocollo per staccare le cellule endoteliali corneali (CEC) dalla membrana di Descemet (DM) utilizzando un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) come modello di malattia ex vivo per la cherata toropatia (BK).

Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Questo protocollo descrive i passaggi critici necessari per stabilire e coltivare colture di cellule endoteliali corneali da espianti di tessuto umano o o novino. Viene inoltre presentato un metodo per la subcultura delle cellule endoteliali corneali su biomateriali membranosi.

Crescita degli strati cellulari endoteliali umani e ovini sulle membrane biomateriali

Descriviamo metodi per studiare l'EndMT indotto da TGF-β2 nelle cellule endoteliali osservando i cambiamenti della morfologia cellulare ed esaminando i cambiamenti marcatori correlati all'endmt usando la colorazione dell'immunofluorescenza. L'editing genico CRISPR/Cas9 è stato descritto e utilizzato per esaurire il gene che codifica per Snail per indagare il suo ruolo nell'EndMT indotto da TGF-β2.

TGF-β endoteliale mediato a transizione mesenchimale (EndMT) e la valutazione funzionale degli effettori EndMT utilizzando crispr/cas9 gene editing

Qui, vengono sviluppati modelli animali basati su topo e coniglio per il danno meccanico e chimico dell'epitelio corneale per lo screening di nuove terapie e del meccanismo sottostante.

Modelli animali ex vivo e in vivo per lesioni meccaniche e chimiche dell'epitelio corneale

Scopri la transizione endoteliale-mesenchimale corneale in modelli in vitro e in vivo utilizzando cellule endoteliali bovine e un modello di criolesione nel ratto. Questo metodo aiuta a studiare la rigenerazione corneale.

In vitro e in modelli in vivo per studiare transizione corneale endoteliale-mesenchimale

Esplora altri video