Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare scaffold di cristalli colloidali invertiti basati su PEG con una matrice extracellulare codificante per applicazioni di ingegneria del tessuto epatico. L'ingegneria dei tessuti epatici è un campo entusiasmante per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa. Stiamo creando un'impalcatura ingegneristica 3D che consente alle cellule epatiche di mantenere la loro funzione per lungo tempo.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono ai test farmacologici, poiché le cellule epatiche coltivate con questo sistema possono mantenere la loro funzione più a lungo e una migliore risposta al farmaco. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'ingegneria tissutale, può essere applicato anche ad altri sistemi, come quelli che utilizzano cellule staminali. A dimostrare la procedura sarà Hitomi, uno studente laureato del mio laboratorio.

Per preparare gli stampi per microsfere, tagliare prima le punte da provette da microcentrifuga antiebollizione da 0,2 millilitri al livello di 40 microlitri. Utilizzare la colla impermeabile per far aderire la parte superiore dei tubi tagliati ai vetrini del microscopio e quindi incollare attorno agli stampi. Successivamente, sostituire l'acqua in una fiala di microsfere di polistirene con etanolo al 70%.

Mettere la soluzione di sfere in un bagno ad ultrasuoni e sonicare la miscela a 30 watt per tre minuti per sciogliere le sfere aggregate. Una volta preparate le microsfere, pipettare 100 microlitri di etanolo in ciascuno degli stampi. Quindi, tagliare quattro millimetri dalla parte superiore di un puntale per pipetta da 200 microlitri e utilizzarlo per pipettare due volte 25 microlitri di microsfere di polistirene nello stampo.

Posizionare gli stampi su uno shaker a dondolo e impostarlo a 120 giri/min. Lasciare riposare i campioni sull'agitatore per una notte. Il giorno successivo, posizionare gli stampi al microscopio e verificare che le sfere siano ordinate esagonalmente.

Lasciate evaporare l'etanolo a temperatura ambiente per due notti. A questo punto, posizionare con cura lo stampo e il complesso di perline in un forno a 130 gradi Celsius per sei ore per ricuocere le perle di polistirolo e formare il negativo dell'impalcatura 3D. Innanzitutto, sintetizzare i macromeri del diacrilato di polietilenglicole utilizzando protocolli stabiliti come descritto in questi due riferimenti.

Successivamente, preparare una soluzione al 50% di PEGDA in acqua deionizzata e centrifugare la miscela fino a quando non è completamente disciolta. Per gli scaffold coniugati a matrice extracellulare, aggiungere un ulteriore 10% di olio di krill, PEG NHS nella soluzione di PEGDA al 50%. Quindi, preparare una soluzione madre al 20% del fotoiniziatore in etanolo al 70%.

Aggiungere 50 microlitri della soluzione fotoiniziatrice per ogni millilitro della miscela PEDDA. Quindi, agitare il composto per un minuto. Quindi, staccare gli stampi dai vetrini, spingere i reticoli con cautela verso l'esterno usando una spatola e metterli in provette da centrifuga separate da 1,5 millilitri.

Pipettare 300 microlitri della soluzione PEGDA in ciascuna provetta, quindi centrifugare le provette per consentire alla soluzione PEGDA di infiltrarsi nel reticolo di polistirene. Quindi, rimuovere il reticolo dal tubo usando una pinzetta e tamponare accuratamente la soluzione PEGDA in eccesso dalla superficie. Posizionare il reticolo su un vetro ricoperto di pellicola di paraffina con la superficie piana e circolare rivolta verso l'alto.

Quindi, esporre l'impalcatura alla luce ultravioletta a 365 nanometri per cinque minuti utilizzando una lampada spot UV. Mettere una decina di reticoli cristallini polimerizzati PEGDA in una nuova fiala e aggiungere 20 millilitri di THF. Agitare le fiale su un agitatore orbitale a 300 giri/min per sei ore.

Rimuovere il flaconcino ogni una o due ore e sostituire il solvente contenente polimero con THF fresco. Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere acqua alla soluzione di THF utilizzata per verificare se le sfere di PS si sono completamente dissolte. Se la soluzione è bianca, eseguire ulteriori risciacqui fino a quando la soluzione non diventa trasparente.

Per sterilizzare gli scaffold, preparare una provetta da microcentrifuga da 50 millilitri con due millilitri di etanolo al 70% per scaffold e posizionare gli scaffold nella provetta utilizzando una spatola. Lasciare in ammollo le impalcature in etanolo per un'ora. Dopo un'ora, versare con cura l'etanolo e sostituirlo con un volume uguale di PBS sterile.

Quindi, centrifugare gli scaffold per rimuovere eventuali bolle. Conservare gli scaffold della centrifuga a quattro gradi Celsius e rimuoverli ogni una o due ore per sostituire la soluzione con PBS fresco. Dopo alcune modifiche al PBS, rimuovere gli scaffold da rivestire di collagene e metterli in un tubo contenente un millilitro di collagene di tipo uno per scaffold da rivestire.

Quindi, centrifugare la provetta come prima, quindi agitare gli scaffold a 400 giri/min su un agitatore orbitale per 30 minuti. Conservare le impalcature durante la notte a quattro gradi Celsius. Coltura di cellule di epatocarcinoma in piastre di coltura cellulare da 100 millimetri con 10 millilitri di terreno di coltura.

Cambiare il terreno ogni tre giorni fino a quando la densità cellulare raggiunge il 75-80% della superficie di coltura. Quando le celle sono pronte, posizionare con cura gli scaffold con la superficie piana rivolta verso l'alto in una piastra a 24 pozzetti. Quindi, sciacquare ogni impalcatura con due millilitri di PBS.

Aspirare il PBS e aggiungere due millilitri di terreno di coltura agli scaffold. Dopo 30 minuti, rimuovere il mezzo e lasciare asciugare l'impalcatura per un'ora. Successivamente, raccogli le cellule dell'epatocarcinoma utilizzando il metodo di digestione della tripsina.

Dopo aver pellettato le cellule, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in modo che ci siano un milione di cellule per 25 microlitri. Pipettare lentamente 25 microlitri di sospensione cellulare direttamente sopra ogni scaffold. Quindi, copri il piatto e mettilo nell'incubatrice per una notte.

Quindi, trasferire con cura gli scaffold in una nuova piastra a 24 pozzetti e pipettare due millilitri di terreno in ciascun pozzetto prima di rimettere la piastra nell'incubatore. Qui è mostrato un microscopio elettronico a scansione dell'impalcatura. È costituito da una disposizione esagonale più vicina di pori che hanno un diametro medio compreso tra 100 e 105 micron che forma interconnessioni con i pori vicini che hanno per lo più un diametro compreso tra 35 e 40 micron.

Quando vengono seminate con cellule di epatocarcinoma, le cellule crescono e proliferano sugli scaffold che sono pre-rivestiti di collagene di tipo uno ma non si espandono in numero sugli scaffold nudi. Inoltre, le cellule di epatocarinoma sugli scaffold rivestiti di collagene hanno mostrato una maggiore funzione cellulare in modo dipendente dalla concentrazione. Il giorno 14, le cellule dell'epatocarcinoma coltivate negli scaffold ICC rivestiti da 400 microgrammi per millilitro secernevano più di tre volte la quantità di albumina rispetto a quelle coltivate nello scaffold nudo.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che le sfere di polistirene nel reticolo siano disposte correttamente. Una cattiva disposizione porterà a una scarsa interconnettività che può influire negativamente sull'attività cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare scaffold in cristallo colloidale invertito a base di PEG celciati con un rivestimento.

Non dimenticare che lavorare con il tetraidrofurano può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come operare in una cappa aspirante e indossare guanti e occhiali protettivi.