Name: Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Scopri la fabbricazione di scaffold a cristallo colloidale invertito in PEG per l'ingegneria tissutale epatica. Questo metodo tridimensionale migliora la funzionalità delle cellule Huh-7.5 per test farmacologici avanzati.

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Gli autori desiderano ringraziare il sostegno di un Research Foundation Fellowship nazionale (NRF -NRFF2011-01) e Programma di ricerca competitiva (NRF-CRP10-2012-07).

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.

Ponteggi ingegneria dei tessuti sono in rapida evoluzione per fornire tutti i segnali fisici e biochimici necessari per rigenerare, mantenere o riparare tessuti per l&#39;applicazione della sostituzione di organi, lo studio delle malattie, lo sviluppo di farmaci, e molti altri 57. In ingegneria dei tessuti del fegato, epatociti umani primari rapidamente perdono le loro funzioni metaboliche, una volta isolati dal corpo, creando un grande bisogno di ponteggi di ingegneria e sviluppo di piattaforme per mantenere...

Il fegato è un organo altamente vascolarizzato con una moltitudine di funzioni, tra cui la disintossicazione del sangue, metabolismo di xenobiotici, e la produzione di proteine ​​del siero. tessuto epatico ha un complesso microstruttura tridimensionale (3D), composto da più tipi di cellule, canalicoli biliari, sinusoidi, e zone di diversa composizione biomatrice e concentrazioni di ossigeno differenti. Data questa struttura elaborata, è stato difficile creare un modello di fegato corretta in vitro 1. Tuttavia, vi è una crescente domanda di funzionale in modelli in vitro di hosting epatociti umani come piattaforme per la tossicità test anti-droga 2 e studiare malattie associate con il fegato 3. Piattaforme di ingegneria tissutale epatica corrente hanno semplificato la complessità del fegato isolando uno, o concentrandosi su alcuni, dei parametri del fegato, cioè co-coltura delle cellule 4, composizione biochimica della zonaL microambienti 5, dinamica del flusso 6,7 e la configurazione del Biomatrice 8. Configurazione della biomatrice può essere suddiviso in parametri quali materiali impalcatura, la composizione di matrice extracellulare (ECM) proteine, matrice di rigidezza nonché la progettazione e la struttura del ponteggio. C&#39;è stato un aumento negli studi di ingegneria dei tessuti utilizzando idrogel sintetici, in particolare poli (glicole etilenico) (PEG) idrogel 9, data la possibilità di regolare le proprietà meccaniche, bioattività, e velocità di degradazione del idrogel. Per quanto riguarda la ricerca di fegato legati, l&#39;idrogel biocompatibile è stata applicata per lo studio infezione da virus della malattia epatica 3. Come un design della piattaforma degli epatociti, numerosi studi hanno utilizzato epatociti panino culture 10,11 e l&#39;incapsulamento delle cellule all&#39;interno di un idrogel 12,13 per fornire l&#39;ambiente 3D e cellula-ECM e l&#39;interazione cellula-cellula, che sono essenziali per imitare nel microambiente vivo. However, queste piattaforme non possiedono un alto grado di controllo e organizzazione spaziale, portando a proprietà non uniformi attraverso l&#39;impalcatura 14. Il colloidale cristallo invertita (ICC) 14 patibolo è un&#39;impalcatura 3D altamente organizzato per coltura cellulare che è stato introdotto nei primi anni 2000. struttura unica del ponteggio può essere attribuito al semplice processo di fabbricazione utilizzando un cristallo colloidale, un reticolo ordinata di particelle colloidali di diametro variabile. In breve, per riassumere il processo, le particelle sono disposti in modo ordinato e ricotta usando il calore in modo da formare un reticolo. La lisciviazione del lattice, da un solvente organico, in polimerizzati risultati idrogel in cavità sferiche esagonale confezionati 15 con elevata area superficiale. Questa impalcatura altamente ordinato è già stato fatto con entrambi i materiali sintetici e naturali, incluso ma non limitato a poli (acrilammide) 16-21, poli (lattico-co-glicolico acido) 15,22-30, Poli (glicole etilenico) 31,32, poli (2-idrossietil metacrilato) 21,33-35, e chitosano 36-39. Impalcature ICC in materiali non sottomarina tendono a promuovere sferoidi cellulari all&#39;interno delle cavità 14,23,40. Tipi di cellule multiple hanno dimostrato di proliferare successo, differenziare e funzione all&#39;interno di questa configurazione, compresi condrociti 41, cellule stromali del midollo osseo 42, e cellule staminali 43,44. Per quanto riguarda epatociti, gli studi sono stati condotti con impalcature ICC fatte di Na 2 SiO 3 e poli (acrilammide), ma non PEG. Con semplici strategie bioconjugation (vale a dire, l&#39;accoppiamento ammina attraverso EDC / NHS), ponteggi PEG basati su ECM proteine-coniugati possono essere fabbricate, che può rivelarsi siti di legame più cellulari per essere un più vivo come l&#39;ambiente e migliorare la funzione epatica. In questo manoscritto e il video associato, dettagliamo la fabbricazione del ponteggio ICCutilizzando poli (glicole etilenico) diacrilato idrogel (PEGDA) e un reticolo di polistirolo microsfere, ottimizzato per epatocarcinoma (Huh-7.5) cultura. Dimostriamo le differenze tra i generalmente non adesivo nude ponteggi ICC PEGDA e il collagene rivestite PEGDA ICC impalcatura in termini di topologia patibolo e le prestazioni delle cellule. La vitalità cellulare e la funzione sono misurati qualitativamente e quantitativamente per valutare il comportamento delle cellule Huh-7.5.

<table><tbody><tr><td>Provetta PCR da 0,2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td> Colla <td>Gorilla resistente all'ebollizione</td></tr><tr><td></td><td>Gorilla Glue, Inc.</td><td>Dipende dal fornitore. Questo è stato acquistato da un negozio locale.</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td>Dimensioni: 24&volte; 60 mm2</td></tr><tr><td>Sfere di polistirene</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>Diametro = 140 &micro; m; 3x104 particelle per millilitro e distribuzione dimensionale 1,4%</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>1.00983.1011</td><td>assoluto per analisi EMSURE; Diluire al 70% con acqua Milli-Q</td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni</td><td>Elma</td><td>S10H</td><td>Forno per attrezzature</td></tr><tr><td></td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>200 & micro; l puntale per pipetta</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore oscillante</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>Glicole polietilenico (PEG)</td><td>Merck</td><td>1.09727.0100</td><td>Mw= 4 kDa; l'acrilazione dei monomeri PEG e la purificazione del precipitato risultante producono un macromero PEGDA con Mw = 4.6&nbsp; kDa</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>acrilato-poli(glicole etilenico) - Succinimidil valerato</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td><td>Mw = 3,4 kDa</td></tr><tr><td>2-idrossi-4'-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr><td>Film di paraffina</td><td>Parafilm M&nbsp;</td><td>#PM996</td><td>Mantenuto a 9" con un'intensità consentita di 10,84&nbsp; mW/cm2</td></tr><tr><td>Bluewave 200 Faretto UV</td><td>Blaze Technology&nbsp;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>Tetraidrofurano (THF)</td><td>Merck</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Heidolph</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Da ratto. 1x, senza CaCl2 MgCl2; pH = 7,2</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16% p/v aq. 10 x 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>VWR</td><td>43368.9M Attrezzatura</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura Microscopio elettronico a scansione</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi primari anti-topo contro il collagene di tipo I</td><td>Abcam</td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo coniugato con Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Piastra, coltura tissutale 24 pozzetti, fondo piatto (Nunclon)&nbsp;</td><td>Bio-Rev PTE LTD</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2,5 g/L Glucosio con L-Gln</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (P/S)</td><td>Life Tchnologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Piastre di coltura non trattate Corning</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430591</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Attrezzatura; 37&nbsp; &deg; C, 5% di umidità</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubatori</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Kit di vitalità/citotossicità viva/morta per cellule di mammifero</td><td>Life Technologies</td><td>L3224&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Assay</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04-11</td><td>Reagente al sale di monosodio (MSR)</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre Infinite 200 PRO&nbsp;</td><td>Kit</td> ELISA umano Tecan <td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Abcam</td><td>ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi primari anti-topo (contro CYP3A4, albumina)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850; sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 marcato Falloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC acqua</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Spettrofotometro 2000c</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Trascrizione inversa Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR selezionano Master Mix per CFX</td><td>Life Technology</td><td>4472937</td><td></td></tr><tr><td>Primer (da scegliere)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>SOFT-CFX-31-PATCH&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) scaffold: una piattaforma cell culture tridimensionale per il fegato tissue engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

La capacità di mantenere la funzione degli epatociti in vitro, allo scopo di testare citotossicità xenobiotici &#39;, studiando virus e sviluppare farmaci mirati al fegato, richiede una piattaforma in cui le cellule ricevono adeguati segnali biochimici e meccanici. sistemi recenti ingegneria dei tessuti del fegato hanno impiegato tridimensionali (3D) impalcature composte da idrogeli sintetici o naturali, data la loro ritenzione idrica e la loro capacità di fornire gli stimoli meccanici necessari da parte delle cellule. C&#39;è stato un crescente interesse nella scaffold invertito cristallo colloidale (ICC), uno sviluppo recente, che consente un&#39;elevata organizzazione spaziale, omotipica e interazioni cellula heterotypic, così come matrice di interazione cellula-extracellulare (ECM). Qui, descriviamo un protocollo per fabbricare patibolo ICC utilizzando poli (glicole etilenico) diacrilato (PEGDA) e il metodo di lisciviazione delle particelle. Brevemente, un reticolo è costituito da particelle di microsfere, dopo di che un pre-polymesi aggiunge soluzione r, correttamente polimerizzato, e le particelle vengono poi rimosso o dilavati, utilizzando un solvente organico (ad esempio, tetraidrofurano). La dissoluzione dei risultati reticolari in un ponteggio altamente porosa con dimensione dei pori controllati e interconnectivities che permettono media per raggiungere le cellule più facilmente. Questa struttura unica permette elevata area superficiale per le cellule di aderire come pure facile comunicazione tra i pori, e la capacità di rivestire il ICC scaffold PEGDA con proteine ​​mostra anche un effetto marcato sulla prestazioni della cella. Analizziamo la morfologia del patibolo, così come la cella di epatocarcinoma comportamento (Huh-7.5) in termini di fattibilità e la funzione di esplorare l&#39;effetto della struttura ICC e rivestimenti ECM. Nel complesso, questo documento fornisce un protocollo dettagliato di una impalcatura emergente che ha ampie applicazioni in ingegneria dei tessuti, in particolare l&#39;ingegneria dei tessuti del fegato.

I risultati rappresentativi per la caratterizzazione strutturale del ponteggio CPI e il confronto di efficacia ogni ICC di condizione di ponteggio in coltura epatociti sono illustrati e spiegati di seguito. Le condizioni ICC scaffold utilizzati in questi risultati sono rivestimenti collagene 0 pg / ml (Bare), 20 mg / ml (collagene 20), 200 mg / ml (collagene 200), e 400 mg / ml (collagene 400) e l&#39;iniziale huh-7.5 numero di semina cellulare è 1x10 6. <p class="jove_con...

Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per la fabbricazione di una piattaforma di coltura di epatociti tridimensionale emergente, l'impalcatura di cristalli colloidali invertiti e le tecniche concomitanti per valutare il comportamento degli epatociti. I pori controllabili in base alle dimensioni, l'interconnettività e la capacità di coniugare le proteine della matrice extracellulare all'impalcatura di poli(glicole etilenico) (PEG) migliorano le prestazioni delle cellule Huh-7.5.

Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fabbricare impalcature a cristallo colloide invertito a base di PEG con una matrice extracellulare codificata per applicazioni nell'ingegneria tissutale del fegato. L'ingegneria tissutale del fegato rappresenta un settore promettente nell'ambito dell'ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa. Stiamo creando impalcature tridimensionali ingegnerizzate che permettono alle cellule epatiche di mantenere la loro funzionalità per un lungo periodo.Le implicazioni di questa tecnica si estendono al test farmacologico, poiché le cellule epatiche coltivate con questo sistema potrebbero mantenere la loro funzionalità più a lungo e rispondere meglio ai farmaci. Sebbene questo metodo possa fornire spunti importanti per l'ingegneria tissutale, può essere applicato anche ad altri sistemi, come quelli che utilizzano cellule staminali. A dimostrare la procedura sarà Hitomi, una studentessa laureata del mio laboratorio.Per preparare gli stampi in microperline, tagliare innanzitutto le punte di provette microcentrifughe resistenti all'ebollizione da 0,2 millilitri al livello di 40 microlitri. Utilizzare una colla impermeabile per fissare le parti supe

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Descriviamo un chip basato su piattaforma per il tridimensionale coltura di cellule in micro-bioreattori. Un chip in grado di ospitare fino a 10 milioni. cellule che possono essere coltivate in condizioni ben definite in relazione al flusso del fluido, tensione ecc ossigeno in una sterile, la circolazione ad anello chiuso.

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Per la creazione di strutture altamente organizzate di tessuti complessi, è necessario assemblare più materiali e tipi di cellule in un composito integrato.  Questo design combinatorio incorpora fogli cellulari stratificati specifici per organo con due materiali distinti di derivazione biologica contenenti una forte base di matrice fibrosa e cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi.

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La matrice extracellulare tessuto-specifico (ECM) è un mediatore chiave della funzione delle cellule. Questo articolo descrive metodi per sintetizzare schiume e microcarriers che sono stabili in coltura senza la necessità di reticolazione chimica per applicazioni in 3D avanzata in colture di cellule in vitro o come bioscaffolds pro-rigenerativi ECM-derivato puri.

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Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

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Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.

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Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal

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