High-throughput di Gene Tagging in Trypanosoma brucei
12 agosto 2016
L'aggiunta di un tag a una proteina è un modo potente per ottenere informazioni sulla sua funzione. Qui, descriviamo un protocollo per marcare endogenamente centinaia di proteine di Trypanosoma brucei in parallelo in modo che sia possibile etichettare la scala del genoma.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di marcare le proteine in Trypansoma brucei in modo ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo cinetoplacido sulla localizzazione e la potenziale funzione di grandi coorti di proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un gran numero di proteine può essere rapidamente e facilmente etichettato in parallelo.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla localizzazione, le interazioni di grandi coorti di proteine possono essere studiate anche utilizzando altri tag. Ad esempio, il tag BirA per un esperimento di mappatura di prossimità bio-ID. A dimostrare la procedura sarà Ross Madden, un assistente di ricerca del nostro laboratorio.
Prima di iniziare questa procedura, precongelare un dispositivo di raffreddamento per PCR a 96 pozzetti nel congelatore a meno 80 gradi Celsius. Preparare il Master Mix A unendo quanto segue in un tubo da 10 millilitri. 2, 100 microlitri di acqua distillata deionizzata, 105 microlitri di DMSO di grado PCR, 105 microlitri di dNTP da 10 millimolari e 105 microlitri di modello pPOT.
Versare la Master Mix A in un serbatoio di reagenti e aliquotare 23 microlitri di Master Mix A in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Utilizzando una pipetta multicanale P20 a 12 canali, aggiungere due microlitri di primer raggruppati da 100 micromolari a ciascun pozzetto caricato. Sigillare la piastra con pellicola.
Posizionalo sul refrigeratore PCR pre-raffreddato e lascialo congelare per un minimo di 20 minuti a meno 80 gradi Celsius. Il congelamento della PCR Master Mix A è fondamentale per garantire un'efficiente reazione di avviamento a caldo, anche quando si utilizza una specifica polimerasi di avviamento a caldo. Questo porta a un'amplificazione riproducibile e ad alto rendimento.
Mentre la piastra PCR è nel congelatore, preparare Master Mix B.Combinare quanto segue in una provetta da 10 millilitri. 2.048 microlitri di acqua distillata deionizzata, 525 microlitri di tampone 10X e 52,5 microlitri di polimerasi, per un volume totale di 2.626 microlitri per piastra. Rimuovere la piastra PCR e il dispositivo di raffreddamento PCR dal congelatore a meno 80 gradi Celsius.
Con la piastra ancora sul raffreddatore PCR, aggiungere rapidamente 25 microlitri di Master Mix B sopra il Master Mix A congelato in ciascun pozzetto per un volume di reazione totale di 50 microlitri. Questo è critico in termini di tempo e dovrebbe essere completato prima che Master Mix A possa scongelarsi. Sigillare la piastra con pellicola.
Impostare il termociclatore come segue: 94 gradi Celsius per 10 minuti, quindi 30 cicli di 94 gradi Celsius per 15 secondi, 65 gradi Celsius per 30 secondi e 72 gradi Celsius per due minuti, seguiti da un periodo di estensione finale di 72 gradi Celsius per sette minuti. Dopo che il blocco ha raggiunto i 94 gradi Celsius, caricare la piastra PCR nel termociclatore e avviare il programma di amplificazione.
Iniziare questa procedura preparando un grande gel di agarosio all'1% in Tris-acetato EDTA o tampone di corsa TAE, con quattro file di pozzetti. Caricare una scala DNA da un kb nel primo e nel 28° pozzetto di ogni fila. Il passo successivo consiste nel trasferire due microlitri di prodotto PCR direttamente, senza tampone di caricamento del DNA, in ciascuna corsia del gel, seguendo lo schema mostrato qui.
Ad esempio, i prodotti PCR delle file A e B della piastra PCR vengono caricati rispettivamente nelle corsie pari e dispari della prima fila del gel. Lavorando rapidamente per ridurre la possibilità di contaminare gli ampliconi, caricare i prodotti PCR dalla fila A della piastra PCR nelle corsie dispari della prima fila del gel. Quindi, caricare i prodotti PCR dalla riga B della piastra PCR nelle corsie pari della prima fila del gel.
Caricare i prodotti PCR dalle file C e D della piastra PCR utilizzando lo stesso schema, con la riga C nelle corsie dispari e la riga D nelle corsie pari della seconda fila del gel. Continuare questo schema di caricamento fino a quando ogni pozzetto della piastra PCR non viene caricato sul gel. Posizionare il gel nel serbatoio in funzione e riempire il serbatoio con il tampone in esecuzione TAE fino a quando il gel non è sommerso.
Funziona a 100 volt per 30 minuti. Visualizzazione con un transilluminatore UV. Qui è mostrato un gel di agarosio rappresentativo per la validazione della PCR a 96 pozzetti, in cui 95 PCR su 96 hanno avuto successo.
La PCR non riuscita è stata l'H11. Questa procedura utilizza Trypansoma brucei, forma prociclica, linea cellulare SMOXP9. Far crescere le cellule alla densità appropriata come descritto nel testo del protocollo e raccogliere il numero richiesto di cellule mediante centrifugazione a 800 volte G per 10 minuti.
Iniziare la configurazione per l'elettroporazione mentre le celle vengono centrifugate. Collegare il manipolatore di piastre all'elettroporatore. Sull'unità elettroporator, impostare la tensione su 1.500 volt, la durata dell'impulso su 100 microsecondi, il numero di impulsi su 12 e l'intervallo tra gli impulsi su 500 millisecondi.
Sul gestore della piastra, impostare il conteggio degli impulsi su uno. Utilizzando una pipetta multicanale P200 a 12 canali, trasferire le reazioni PCR dalla piastra PCR a una piastra di elettroporazione monouso a 96 pozzetti. Lavare le cellule in 10 millilitri di citomix modificato e centrifugare nuovamente a 800 volte G per 10 minuti.
Risospendere le cellule in 23 millilitri di citomix modificato per una concentrazione finale di cinque volte 10 alla settima cellula per millilitro. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio di reagenti. Pipettare 200 microlitri della soluzione cellulare in ciascun pozzetto della piastra di elettroporazione e miscelare con il prodotto PCR mediante pipettaggio.
Utilizzare un fazzoletto per rimuovere eventuali goccioline dalla parte superiore della piastra per evitare cortocircuiti. Applicare una pellicola sigillante sulla parte superiore della piastra di elettroporazione, posizionandola in modo da lasciare scoperti i fori per gli elettrodi nella parte superiore e inferiore di ogni colonna. Evitare di coprire i punti rialzati utilizzati per guidare la pellicola.
Caricare la piastra di elettroporazione nel manipolatore di piastre e chiudere il coperchio. Premere a impulsi" sull'unità elettroporatore. Dopo l'elettroporazione, le cellule devono essere trasferite rapidamente in quattro piastre di coltura tissutale da 24 pozzetti che contengono un millilitro di terreno SDM-79 per pozzetto per il recupero.
Utilizzare una pipetta multicanale P200 a 12 canali con tutti gli altri puntali mancanti, in modo che i restanti sei puntali siano allineati con le sei file su una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Dopo che le celle sono state trasferite dalla piastra a 96 pozzetti alla piastra a 24 pozzetti, lavare i pozzetti nella piastra a 96 pozzetti con i terreni dei pozzetti corrispondenti nella piastra a 24 pozzetti. Quindi, trasferire nuovamente il lavaggio nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti.
Trasferire le cellule elettroporate dalla piastra di elettroporazione a 96 pozzetti alle piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti secondo lo schema predefinito mostrato di seguito. Ad esempio, le celle dei pozzetti con numero dispari della riga A della piastra a 96 pozzetti vengono trasferite alla riga A della piastra A, mentre le celle dei pozzetti con numero pari della riga A dalla piastra a 96 pozzetti vengono trasferite alla riga A della piastra C.Dopo ogni trasferimento delle celle dalla piastra a 96 pozzetti alla piastra a 24 pozzetti, Lavare i pozzetti nella piastra a 96 pozzetti con il terreno della fila corrispondente della piastra a 24 pozzetti. Quindi, trasferire nuovamente il lavaggio sulla piastra a 24 pozzetti.
Il trasferimento delle cellule alle piastre a 24 pozzetti crea confusione, ma è necessario essere in grado di tracciare le linee cellulari risultanti fino al gene corretto ID.It è fondamentale eseguire rapidamente questo passaggio per mantenere le cellule sane. Dopo che tutte le celle elettroporate sono state trasferite nelle quattro piastre da 24 pozzetti, posizionare le piastre da 24 pozzetti in una scatola di plastica pulita con un coperchio che formi una tenuta ermetica. Metti la scatola in un'incubatrice a 28 gradi Celsius.
Tra le sei e le otto ore dopo, aggiungere a ciascun pozzetto un millilitro di SDM-79 con il 10% di FCS contenente antibiotico selettivo. Incubare a 28 gradi Celsius per 9-10 giorni fino a quando le linee cellulari transgeniche diventano visibili. Dopo una trasfezione a 96 pozzetti per l'etichettatura di 96 diverse proteine sul terminale terminale, le cellule vengono trasferite su piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti per il recupero e la selezione.
Ogni pozzetto viene quindi valutato per determinare se contiene cellule sane e resistenti ai farmaci. Un pozzetto sano contiene prevalentemente cellule altamente attive che sono luminose nella microscopia a contrasto di fase. In questo schema di esempio, il verde rappresenta un pozzetto con trasfezione riuscita e il grigio rappresenta un pozzetto con solo celle morte.
88 su 96, ovvero il 92% dei pozzetti, contengono parassiti trasfettati con successo dopo 15 giorni dalla selezione. Una volta padroneggiato, ci vorrà circa un'ora dal conteggio delle celle alla placcatura dopo l'elettroporazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di aggiungere i farmaci selettivi da sei a otto ore dopo la trasfezione.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare grandi coorti di proteine in Trypansoma brucei.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo ad alto rendimento per l'etichettatura di proteine in Trypanosoma brucei, che consente lo studio della localizzazione e della funzione proteica. Il protocollo permette l'etichettatura parallela di centinaia di proteine, facilitando studi genomici su larga scala.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Genomica
Sfondo
- L'etichettatura delle proteine è essenziale per comprendere la funzione proteica.
- Trypanosoma brucei è un organismo modello per lo studio dei cinetoplastidi.
- Le tecniche ad alto rendimento aumentano l'efficienza degli studi sulle proteine.
- L'etichettatura può rivelare la localizzazione e la dinamica delle interazioni delle proteine.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'etichettatura endogena di proteine in T. brucei.
- Facilitare l'indagine sulla localizzazione e funzione delle proteine.
- Permettere l'etichettatura genomica su larga scala per studi completi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di miscele master PCR per l'amplificazione.
- Electroporazione di cellule T. brucei con costrutti marcati.
- Convalida dei prodotti PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio.
- Utilizzo di marcatori specifici per studi sulle interazioni proteiche.
Risultati principali
- Etichettatura riuscita di un ampio gruppo di proteine di T. brucei.
- Alta resa e riproducibilità dell'amplificazione PCR.
- Dimostrata fattibilità di studi proteici ad alto rendimento.
- Convalida del metodo attraverso risultati PCR positivi.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato consente un'efficace marcatura proteica in T. brucei.
- Questo metodo può accelerare significativamente la ricerca nel campo dei cinetoplastidi.
- Studi futuri potranno sfruttare questa tecnica per ottenere approfondimenti più dettagliati sulle funzioni proteiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La marcatura proteica ad alto rendimento consente l'annotazione funzionale sistematica dei proteomi patogeni, supportando la riduzione del rischio sui bersagli nella fase iniziale della scoperta di farmaci antiparassitari. Generando librerie marcate a partire da loci endogeni, questo metodo fornisce dati quantitativi sulla localizzazione e sulle interazioni, essenziali per prioritizzare bersagli farmacologicamente rilevanti nei percorsi di ricerca su malattie trascurate. La scalabilità dell'approccio si allinea con iniziative di screening su scala genomica, accelerando i cicli da ipotesi a validazione nei flussi di lavoro di validazione dei bersagli.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante marcatura endogena delle proteine patogene per la localizzazione e la mappatura delle interazioni.
- Valore operativo: Permette la marcatura parallela di decine o centinaia di candidati, aumentando la produttività per il triage degli obiettivi e il successivo screening fenotipico.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico generando dati riproducibili di localizzazione subcellulare e co-immunoprecipitazione su ampie coorti geniche.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Produce linee cellulari validate che esprimono proteine marcate, consentendo saggi standardizzati per il legame, la localizzazione o letture funzionali.
- Valore operativo: L'elettroporazione in formato 96 pozzetti permette un trasferimento costante di costrutti di DNA, migliorando la riproducibilità nelle piattaforme di screening basate sulla trasfezione.
- Scalabilità: Il recupero in piastre da 24 pozzetti supporta l'isolamento e la selezione clonale, creando una risorsa rinnovabile per campagne di validazione del bersaglio a valle.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Le linee cellulari con proteine marcate permettono di correlare fenotipi molecolari con la sensibilità ai farmaci, sostenendo modelli preclinici allineati ai biomarcatori.
- Approfondimento meccanicistico: Favorisce l'identificazione di complessi proteici e vie di segnalazione, contribuendo alla comprensione del meccanismo d'azione e dei meccanismi di resistenza.
- Conferma del bersaglio: La marcatura endogena preserva i livelli nativi di espressione, riducendo gli artefatti e migliorando il valore predittivo nelle valutazioni dell'essenzialità del bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase di biologia della scoperta, in cui il marcatore ad alto rendimento supporta l'identificazione e la validazione del bersaglio prima dell'ottimizzazione del capostipite. Permette la generazione di linee cellulari pronte all'uso per saggi biochimici e basati su cellule, collegando i risultati genomici alla validazione funzionale. Risultati come i modelli di localizzazione e le reti di interazione informano le decisioni di prosecuzione o interruzione nella priorizzazione dei bersagli.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi mediante l'identificazione della localizzazione subcellulare e dei partner d'interazione di geni candidati ottenuti da schermate genomiche.
- Schermata: Permette la preparazione di linee cellulari standardizzate e marcate per lo sviluppo riproducibile di saggi nelle cascade di validazione del target.
- Analisi: Genera campioni pronti per imaging quantitativo e proteomica per confrontare localizzazione, espressione e stati d'interazione in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la validazione del target molecolare agli esiti fenotipici attraverso linee marcate utilizzabili in studi sulla risposta ai farmaci e sulla resistenza.
- Riutilizzo aziendale: Il sistema di plasmidi e primer è adattabile a diversi insiemi genici, consentendo il riutilizzo in più progetti senza dover riprogettare i componenti principali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo mediante marcatura parallela endogena che preserva il contesto e la funzione proteica nativi.
- Valore operativo: Un flusso di lavoro standardizzato di elettroporazione e selezione in piastre a 96 pozzetti migliora la riproducibilità e riduce il tempo di manipolazione manuale per ogni obiettivo.
- Valore strategico: Consente una rapida scalabilità degli sforzi di validazione degli obiettivi, migliorando l'efficienza del capitale nella fase iniziale di scoperta riducendo l'abbandono tardivo dovuto a obiettivi scarsamente validati.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce l'avanzamento adeguato al rischio fornendo dati multiparametrici (localizzazione, interazioni, espressione) per una classificazione informata degli obiettivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di biologia molecolare nella progettazione di primer per PCR, clonaggio e tecniche di coltura di tripanosomi.
- Richiede l'accesso a sistemi di elettroporazione compatibili con manipolatori di piastre a 96 pozzetti e parametri di impulso standardizzati.
- Necessita di protocolli standardizzati di selezione con antibiotici e di recupero per garantire un recupero consistente di linee transgeniche tra le diverse piastre.
- L'adattamento ad altri tipi di marcatori (ad esempio fluorescenti, di affinità, di prossimità) richiede la validazione della funzionalità del marcatore e della compatibilità con i saggi successivi.
- Il successo dipende da un accurato tracciamento della corrispondenza pozzetto-gene durante i passaggi di trasferimento, al fine di mantenere l'associazione genotipo-fenotipo.
