High-throughput di Gene Tagging in Trypanosoma brucei

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di marcare le proteine in Trypansoma brucei in modo ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo cinetoplacido sulla localizzazione e la potenziale funzione di grandi coorti di proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un gran numero di proteine può essere rapidamente e facilmente etichettato in parallelo.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla localizzazione, le interazioni di grandi coorti di proteine possono essere studiate anche utilizzando altri tag. Ad esempio, il tag BirA per un esperimento di mappatura di prossimità bio-ID. A dimostrare la procedura sarà Ross Madden, un assistente di ricerca del nostro laboratorio.

Prima di iniziare questa procedura, precongelare un dispositivo di raffreddamento per PCR a 96 pozzetti nel congelatore a meno 80 gradi Celsius. Preparare il Master Mix A unendo quanto segue in un tubo da 10 millilitri. 2, 100 microlitri di acqua distillata deionizzata, 105 microlitri di DMSO di grado PCR, 105 microlitri di dNTP da 10 millimolari e 105 microlitri di modello pPOT.

Versare la Master Mix A in un serbatoio di reagenti e aliquotare 23 microlitri di Master Mix A in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Utilizzando una pipetta multicanale P20 a 12 canali, aggiungere due microlitri di primer raggruppati da 100 micromolari a ciascun pozzetto caricato. Sigillare la piastra con pellicola.

Posizionalo sul refrigeratore PCR pre-raffreddato e lascialo congelare per un minimo di 20 minuti a meno 80 gradi Celsius. Il congelamento della PCR Master Mix A è fondamentale per garantire un'efficiente reazione di avviamento a caldo, anche quando si utilizza una specifica polimerasi di avviamento a caldo. Questo porta a un'amplificazione riproducibile e ad alto rendimento.

Mentre la piastra PCR è nel congelatore, preparare Master Mix B.Combinare quanto segue in una provetta da 10 millilitri. 2.048 microlitri di acqua distillata deionizzata, 525 microlitri di tampone 10X e 52,5 microlitri di polimerasi, per un volume totale di 2.626 microlitri per piastra. Rimuovere la piastra PCR e il dispositivo di raffreddamento PCR dal congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Con la piastra ancora sul raffreddatore PCR, aggiungere rapidamente 25 microlitri di Master Mix B sopra il Master Mix A congelato in ciascun pozzetto per un volume di reazione totale di 50 microlitri. Questo è critico in termini di tempo e dovrebbe essere completato prima che Master Mix A possa scongelarsi. Sigillare la piastra con pellicola.

Impostare il termociclatore come segue: 94 gradi Celsius per 10 minuti, quindi 30 cicli di 94 gradi Celsius per 15 secondi, 65 gradi Celsius per 30 secondi e 72 gradi Celsius per due minuti, seguiti da un periodo di estensione finale di 72 gradi Celsius per sette minuti. Dopo che il blocco ha raggiunto i 94 gradi Celsius, caricare la piastra PCR nel termociclatore e avviare il programma di amplificazione.

Iniziare questa procedura preparando un grande gel di agarosio all'1% in Tris-acetato EDTA o tampone di corsa TAE, con quattro file di pozzetti. Caricare una scala DNA da un kb nel primo e nel 28° pozzetto di ogni fila. Il passo successivo consiste nel trasferire due microlitri di prodotto PCR direttamente, senza tampone di caricamento del DNA, in ciascuna corsia del gel, seguendo lo schema mostrato qui.

Ad esempio, i prodotti PCR delle file A e B della piastra PCR vengono caricati rispettivamente nelle corsie pari e dispari della prima fila del gel. Lavorando rapidamente per ridurre la possibilità di contaminare gli ampliconi, caricare i prodotti PCR dalla fila A della piastra PCR nelle corsie dispari della prima fila del gel. Quindi, caricare i prodotti PCR dalla riga B della piastra PCR nelle corsie pari della prima fila del gel.

Caricare i prodotti PCR dalle file C e D della piastra PCR utilizzando lo stesso schema, con la riga C nelle corsie dispari e la riga D nelle corsie pari della seconda fila del gel. Continuare questo schema di caricamento fino a quando ogni pozzetto della piastra PCR non viene caricato sul gel. Posizionare il gel nel serbatoio in funzione e riempire il serbatoio con il tampone in esecuzione TAE fino a quando il gel non è sommerso.

Funziona a 100 volt per 30 minuti. Visualizzazione con un transilluminatore UV. Qui è mostrato un gel di agarosio rappresentativo per la validazione della PCR a 96 pozzetti, in cui 95 PCR su 96 hanno avuto successo.

La PCR non riuscita è stata l'H11. Questa procedura utilizza Trypansoma brucei, forma prociclica, linea cellulare SMOXP9. Far crescere le cellule alla densità appropriata come descritto nel testo del protocollo e raccogliere il numero richiesto di cellule mediante centrifugazione a 800 volte G per 10 minuti.

Iniziare la configurazione per l'elettroporazione mentre le celle vengono centrifugate. Collegare il manipolatore di piastre all'elettroporatore. Sull'unità elettroporator, impostare la tensione su 1.500 volt, la durata dell'impulso su 100 microsecondi, il numero di impulsi su 12 e l'intervallo tra gli impulsi su 500 millisecondi.

Sul gestore della piastra, impostare il conteggio degli impulsi su uno. Utilizzando una pipetta multicanale P200 a 12 canali, trasferire le reazioni PCR dalla piastra PCR a una piastra di elettroporazione monouso a 96 pozzetti. Lavare le cellule in 10 millilitri di citomix modificato e centrifugare nuovamente a 800 volte G per 10 minuti.

Risospendere le cellule in 23 millilitri di citomix modificato per una concentrazione finale di cinque volte 10 alla settima cellula per millilitro. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio di reagenti. Pipettare 200 microlitri della soluzione cellulare in ciascun pozzetto della piastra di elettroporazione e miscelare con il prodotto PCR mediante pipettaggio.

Utilizzare un fazzoletto per rimuovere eventuali goccioline dalla parte superiore della piastra per evitare cortocircuiti. Applicare una pellicola sigillante sulla parte superiore della piastra di elettroporazione, posizionandola in modo da lasciare scoperti i fori per gli elettrodi nella parte superiore e inferiore di ogni colonna. Evitare di coprire i punti rialzati utilizzati per guidare la pellicola.

Caricare la piastra di elettroporazione nel manipolatore di piastre e chiudere il coperchio. Premere a impulsi" sull'unità elettroporatore. Dopo l'elettroporazione, le cellule devono essere trasferite rapidamente in quattro piastre di coltura tissutale da 24 pozzetti che contengono un millilitro di terreno SDM-79 per pozzetto per il recupero.

Utilizzare una pipetta multicanale P200 a 12 canali con tutti gli altri puntali mancanti, in modo che i restanti sei puntali siano allineati con le sei file su una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Dopo che le celle sono state trasferite dalla piastra a 96 pozzetti alla piastra a 24 pozzetti, lavare i pozzetti nella piastra a 96 pozzetti con i terreni dei pozzetti corrispondenti nella piastra a 24 pozzetti. Quindi, trasferire nuovamente il lavaggio nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti.

Trasferire le cellule elettroporate dalla piastra di elettroporazione a 96 pozzetti alle piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti secondo lo schema predefinito mostrato di seguito. Ad esempio, le celle dei pozzetti con numero dispari della riga A della piastra a 96 pozzetti vengono trasferite alla riga A della piastra A, mentre le celle dei pozzetti con numero pari della riga A dalla piastra a 96 pozzetti vengono trasferite alla riga A della piastra C.Dopo ogni trasferimento delle celle dalla piastra a 96 pozzetti alla piastra a 24 pozzetti, Lavare i pozzetti nella piastra a 96 pozzetti con il terreno della fila corrispondente della piastra a 24 pozzetti. Quindi, trasferire nuovamente il lavaggio sulla piastra a 24 pozzetti.

Il trasferimento delle cellule alle piastre a 24 pozzetti crea confusione, ma è necessario essere in grado di tracciare le linee cellulari risultanti fino al gene corretto ID.It è fondamentale eseguire rapidamente questo passaggio per mantenere le cellule sane. Dopo che tutte le celle elettroporate sono state trasferite nelle quattro piastre da 24 pozzetti, posizionare le piastre da 24 pozzetti in una scatola di plastica pulita con un coperchio che formi una tenuta ermetica. Metti la scatola in un'incubatrice a 28 gradi Celsius.

Tra le sei e le otto ore dopo, aggiungere a ciascun pozzetto un millilitro di SDM-79 con il 10% di FCS contenente antibiotico selettivo. Incubare a 28 gradi Celsius per 9-10 giorni fino a quando le linee cellulari transgeniche diventano visibili. Dopo una trasfezione a 96 pozzetti per l'etichettatura di 96 diverse proteine sul terminale terminale, le cellule vengono trasferite su piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti per il recupero e la selezione.

Ogni pozzetto viene quindi valutato per determinare se contiene cellule sane e resistenti ai farmaci. Un pozzetto sano contiene prevalentemente cellule altamente attive che sono luminose nella microscopia a contrasto di fase. In questo schema di esempio, il verde rappresenta un pozzetto con trasfezione riuscita e il grigio rappresenta un pozzetto con solo celle morte.

88 su 96, ovvero il 92% dei pozzetti, contengono parassiti trasfettati con successo dopo 15 giorni dalla selezione. Una volta padroneggiato, ci vorrà circa un'ora dal conteggio delle celle alla placcatura dopo l'elettroporazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di aggiungere i farmaci selettivi da sei a otto ore dopo la trasfezione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare grandi coorti di proteine in Trypansoma brucei.