Co-cultura del vivere Microbiome con Microengineered umana intestinale Villi in un Gut-on-a-chip microfluidico dispositivo

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare la crescita dei villi delle cellule intestinali umane sotto movimenti e flussi simili alla peristalsi in un dispositivo microfluidico gut-on-a-chip, nonché mostrare come co-coltivare queste cellule con il microbioma intestinale vivente. Quindi questo metodo può aiutare le domande chiave nel campo della gastroenterologia, della microbiologia clinica e delle scienze farmaceutiche a identificare il meccanismo della malattia e a convalidare l'efficacia e la tossicità dei nuovi composti farmacologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ricercatori possono stabilire l'ecosistema post-microbioma vitale e funzionale dell'intestino vivente umano in vitro utilizzando un sistema microfisiologico.

Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi a malattie come la colite ulcerosa o il morbo di Crohn, poiché la co-coltura stabile delle cellule ospiti con il microbioma può emulare la complessità di queste malattie. Sebbene questo metodo possa fornire una visione delle complesse interazioni tra il microbioma intestinale e il sistema immunitario nell'intestino, può essere applicato anche ad altri sistemi di organi in cui sono presenti interazioni tra microbi ospiti, come la pelle, il tratto genitale o la cavità orale. Per iniziare, prepara il dispositivo microfluidico gut-on-a-chip come descritto nel protocollo di testo allegato.

Il dispositivo è costituito da un polimero di silicio trasparente permeabile ai gas contenente due microcanali paralleli, separati da una membrana PDMS flessibile e porosa. Su ciascun lato dei canali sono presenti camere a vuoto, che possono essere utilizzate per applicare una deformazione meccanica ciclica. Sterilizzare il dispositivo utilizzando una siringa da un millilitro per far fluire il 70% di etanolo attraverso i canali.

Quindi, asciugare il dispositivo in un forno a secco a 60 gradi Celsius per una notte. Il giorno successivo, esporre il microsistema gut-on-a-chip, insieme al tubo collegato, alla luce UV e all'ozono contemporaneamente per 40 minuti. Raffreddare il dispositivo rimanendo sotto la luce UV di una cabina di biosicurezza per 15 minuti.

Quindi, caricare 100 microlitri di una soluzione codificante per matrici extracellulari in una siringa da un millilitro ed erogarla nel microcanale superiore del dispositivo. Ripetere questo processo per rivestire anche il microcanale inferiore. Posiziona l'intera configurazione in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 gradi Celsius per un'ora.

Durante l'incubazione, il degassatore ha preriscaldato il terreno di coltura completo facendolo passare attraverso un filtro da 0,45 micron in un sistema di filtrazione da 50 millilitri per un minuto. Picchiettare delicatamente sul mezzo filtrato per un minuto per rimuovere eventuali bolle o gas disciolto nel mezzo. Quindi, trasferire il terreno completo degassato in due siringhe monouso da tre millilitri e incubare le siringhe per un'ora.

Quindi, collegare le siringhe ai microcanali superiore e inferiore dell'intestino su chip e lavare via la soluzione codificante facendo scorrere il terreno completo nei microcanali superiore e inferiore con un impulso delicato. Quindi, utilizzare una pompa a siringa per far fluire il terreno di coltura cellulare completo degassato nel microcanale superiore del dispositivo, incubando il chip per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Raccogliere un pallone T75 completamente confluente contenente cellule epiteliali intestinali Caco-2 risciacquando prima le cellule con 10 millilitri di PBS privo di calcio e magnesio.

Quindi, aspirare il PBS e ripetere il risciacquo altre due volte. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% e incubare il pallone per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Una volta staccata, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura cellulare completo preriscaldato e pipettare la sospensione cellulare su e giù da tre a cinque volte prima di trasferirla in una provetta da centrifuga.

Abbassare la sospensione della cella. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule a 150.000 cellule per centimetro quadrato in un mezzo completo preriscaldato. Aspirare 500 microlitri di sospensione cellulare in una siringa monouso da un millilitro, dotata di un ago da 25 gauge da 5/8 di pollice.

Quindi, erogare 100 microlitri di sospensione cellulare nel microcanale superiore attraverso il tubo di uscita. Quindi, bloccare tutti gli ingressi e le uscite collegati ai microcanali superiore e inferiore utilizzando le clip per legante. Incubare l'intero impianto per un'ora per consentire alle cellule epiteliali intestinali di aderire alla superficie della membrana porosa.

Quindi, rimuovere i morsetti e collegare il tubo del canale superiore a una siringa riempita di terreno di coltura che è stata posizionata su una pompa a siringa. Riprendere il flusso del terreno di coltura verso il microcanale superiore a 30 microlitri all'ora fino a quando le cellule non saranno formate da un monostrato intatto. Una volta che le cellule formano un monostrato, collegare il canale inferiore alla seconda siringa e perfondere il terreno di coltura sia nel lume superiore che nei microcanali capillari inferiori alla stessa velocità di flusso di 30 microlitri all'ora.

Per creare un movimento simile a una peristalsi nel chip, accendere prima la pompa del vuoto. Collegare le camere a vuoto del dispositivo al regolatore del vuoto tramite un tubo con un connettore in acciaio inossidabile. Quindi, impostare il controller in modo che fornisca un movimento di allungamento ciclico del segno pari al 10% della deformazione cellulare media a una frequenza di 0,15 Hertz, quindi fare clic su Avvia.

Mantenere il terreno di coltura in flusso su entrambi i microcanali superiore e inferiore in presenza di deformazioni meccaniche per almeno 80 ore per indurre la crescita dei villi. Preparare una miscela 50/50 di brodo MRS di lattobacilli autoclavati e terreno clostridiale rinforzato. Quindi, sospendi nuovamente una miscela batterica probiotica liofilizzata in 10 millilitri di miscela.

Misurare la densità ottica della miscela a 600 nanometri e regolare la densità cellulare finale a circa 0,2 unità di densità ottica. Aliquotare tre millilitri della sospensione di cellule microbiche regolate in provette sterili monouso da 10 millilitri. Mettere le aliquote in un contenitore anaerobico e aggiungere due confezioni di bustine per la generazione di gas anaerobico nel contenitore.

Chiudere bene il coperchio del contenitore e incubare la configurazione del contenitore senza agitare in un'incubatrice per una notte. Successivamente, preparare un terreno di coltura cellulare privo di antibiotici degassato e caricarlo in siringhe monouso da tre millilitri. Trasferire il dispositivo gut-on-a-chip contenente villi microingegnerizzati nella cabina di biosicurezza.

Rimuovere le siringhe collegate ai microcanali superiore e inferiore del dispositivo e sostituirle con siringhe contenenti il terreno di coltura cellulare privo di antibiotici degassato. Una volta terminato, reinserire il dispositivo nell'incubatore a CO2. Quindi, far scorrere il terreno di coltura privo di antibiotici nel dispositivo per 12 ore prima di posizionare il microbioma.

Quindi, centrifugare la miscela di cellule batteriche probiotiche pre-coltivate. Aspirare il surnatante, quindi sospendere nuovamente i batteri nel DMEM privo di antibiotici. Caricare circa 100 microlitri di questa sospensione cellulare in una siringa da un millilitro collegata a un ago da 25 gauge da 5/8 di pollice.

Infondere i batteri nel lato del lume del microcanale contenente i villi intestinali precedentemente privi di germi. Lasciare che le cellule microbiche aderiscano alla superficie apicale dei villi intestinali per un'ora e mezza senza flusso bloccando il tubo. Quindi, perfondere il terreno di coltura preriscaldato privo di antibiotici nei microcanali superiore e inferiore a 40 microlitri all'ora con deformazioni ritmiche cicliche.

Questo protocollo di co-coltura consente la colonizzazione stabile di più specie di batteri probiotici nello spazio intervilloso. Le microcolonie batteriche vitali possono essere mantenute per un massimo di due settimane in co-coltura. Qui è mostrata una diversa co-coltura costituita sia da E.coli marcato con GFP che da villi intestinali.

L'ingrandimento ad alta potenza mostra chiaramente la posizione delle microcolonie batteriche al punto temporale di 72 ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniettare delicatamente e lentamente il terreno di coltura nei canali microfluidici per evitare di danneggiare il monostrato di cellule epiteliali nelle prime fasi della coltura. Sulla base di questo metodo, un metodo di co-coltura con le cellule immunitarie umane può anche fornire alcuni indizi in termini di come il microbioma può comunicare in modo incrociato con il sistema immunitario e influenzare la salute intestinale ottimale dell'omeostasi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ricostituire il microambiente dell'intestino umano e dimostrare quella co-coltura tra il microbioma e i villi intestinali umani in vitro. Lavorare con batteri patogeni e cellule umane è estremamente pericoloso, quindi non dimenticare di lavorare all'interno della cabina di biosicurezza.