Co-cultura del vivere Microbiome con Microengineered umana intestinale Villi in un Gut-on-a-chip microfluidico dispositivo

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare la crescita dei villi di cellule intestinali umane sotto movimenti e flussi simili alla peristalsi in un dispositivo microfluidico gut-on-a-chip, nonché mostrare come coltivare congiuntamente queste cellule con un microbioma intestinale vivente. Pertanto, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della gastroenterologia, della microbiologia clinica e delle scienze farmaceutiche, al fine di identificare i meccanismi delle malattie e validare l'efficacia e la tossicità di nuovi composti farmacologici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i ricercatori possono stabilire in vitro un ecosistema post-microbioma vitale e funzionale dell'intestino umano vivente, utilizzando un sistema microfisiologico.

Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi a malattie come la colite ulcerosa o il morbo di Crohn, poiché la co-coltura stabile delle cellule dell'ospite con il microbioma può emulare le complessità di queste patologie. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni complesse tra il microbioma intestinale e il sistema immunitario nell'intestino, può essere applicato anche ad altri sistemi organici in cui avvengono interazioni tra l'ospite e i microrganismi, come la pelle, il tratto genitale o la cavità orale. Per iniziare, preparare il dispositivo microfluidico gut-on-a-chip come descritto nel protocollo testuale allegato.

Il dispositivo è costituito da un polimero di silicio trasparente permeabile ai gas che contiene due microcanali paralleli, separati da una membrana porosa in PDMS flessibile. Su ciascun lato dei canali sono presenti camere a vuoto, che possono essere utilizzate per applicare una deformazione meccanica ciclica. Sterilizzare il dispositivo facendo passare etanolo al 70% attraverso i canali mediante una siringa da un millilitro.

Quindi, asciugare il dispositivo in un forno a secco a 60 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, esporre il microsistema gut-on-a-chip, insieme ai tubi collegati, simultaneamente alla luce UV e all'ozono per 40 minuti. Raffreddare il dispositivo mantenendolo sotto la luce UV di una cappa a sicurezza biologica per 15 minuti.

Successivamente, caricare 100 microlitri di una soluzione codificante per la matrice extracellulare in una siringa da un millilitro ed erogarla nel microcanale superiore del dispositivo. Ripetere questo processo per rivestire anche il microcanale inferiore. Posizionare l'intero apparato in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con 5% di CO2 per un'ora.

Durante l'incubazione, degassare il mezzo di coltura completo preriscaldato facendolo passare attraverso un filtro da 0,45 micron in un sistema di filtrazione da 50 millilitri per un minuto. Toccare delicatamente il mezzo filtrato per un minuto per rimuovere eventuali bolle o gas disciolti nel mezzo. Successivamente, trasferire il mezzo completo degassato in due siringhe monouso da tre millilitri e incubare le siringhe per un'ora.

Successivamente, collegare le siringhe ai microcanali superiore e inferiore del chip-intestino, e rimuovere la soluzione di codifica facendo fluire il mezzo completo nei microcanali superiore e inferiore con un'impulso delicato. Quindi, utilizzare una pompa per siringa per far fluire il mezzo di coltura cellulare completo e disgasato nel microcanale superiore del dispositivo, mentre si incuba il chip durante la notte a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Raccogliere un flacone T75 completamente confluito contenente cellule epiteliali intestinali Caco-2 lavando prima le cellule con 10 millilitri di PBS privo di calcio e magnesio.

Quindi, aspirare il PBS e ripetere il risciacquo altre due volte. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% e incubare il fiasco per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Una volta staccate, aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare completo pre-riscaldato e pipettare la sospensione cellulare su e giù da tre a cinque volte prima di trasferirla in un tubo da centrifuga.

Centrifugare la sospensione cellulare. Quindi, rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule a 150.000 cellule per centimetro quadrato in mezzo completo preriscaldato. Aspirare 500 microlitri della sospensione cellulare in una siringa monouso da un millilitro, dotata di un ago da 25 gauge, 5/8 di pollice.

Quindi, dispensare 100 microlitri della sospensione cellulare nel microcanale superiore attraverso il tubo di uscita. Successivamente, chiudere con mollette tutti gli ingressi e le uscite collegati ai microcanali superiore e inferiore. Incubare l'intero apparato per un'ora per consentire alle cellule epiteliali intestinali di aderire alla superficie della membrana porosa.

Quindi, rimuovere le pinze e collegare il tubo del canale superiore a una siringa riempita di mezzo di coltura, posizionata su una pompa per siringa. Riprendere il flusso di mezzo di coltura verso il microcanale superiore a 30 microlitri all'ora fino a quando le cellule formano un monostrato integro. Una volta che le cellule hanno formato un monostrato, collegare il canale inferiore alla seconda siringa ed effettuare la perfusione del mezzo di coltura sia nel lume superiore sia nei microcanali capillari inferiori alla stessa velocità di flusso di 30 microlitri all'ora.

Per generare un movimento simile alla peristalsi nel chip, accendere prima la pompa a vuoto. Collegare le camere a vuoto del dispositivo al controllore di vuoto mediante tubi con un connettore in acciaio inossidabile. Successivamente, impostare il controllore in modo che fornisca un movimento ciclico di stiramento pari al 10% della deformazione media delle cellule a una frequenza di 0,15 Hertz, quindi fare clic su avvia.

Mantenere il flusso di mezzo di coltura in entrambi i microcanali superiore e inferiore in presenza di deformazioni meccaniche per almeno 80 ore per indurre la crescita dei villi. Preparare una miscela 50/50 di Brodo MRS per Lattobacilli autoclavato e Mezzo Clostridiale Rinforzato. Successivamente, risospendere una miscela batterica probiotica liofilizzata in 10 millilitri della miscela.

Misurare la densità ottica della miscela a 600 nanometri e regolare la densità cellulare finale a circa 0,2 unità di densità ottica. Aliquotare tre millilitri della sospensione cellulare microbica regolata in provette sterili monouso da 10 millilitri. Posizionare gli aliquote in un contenitore anaerobico e aggiungere due bustine generatrici di gas anaerobico nel contenitore.

Chiudere bene il coperchio del contenitore e incubare il sistema senza agitazione in un'incubatrice durante la notte. Successivamente, preparare il mezzo di coltura cellulare privo di antibiotici e degassato, e caricarlo in siringhe monouso da tre millilitri. Trasferire il dispositivo gut-on-a-chip contenente le villosità micro-ingegnerizzate all'interno della cappa a sicurezza biologica.

Rimuovere le siringhe collegate ai microcanali superiore e inferiore del dispositivo e sostituirle con siringhe contenenti il mezzo di coltura cellulare senza antibiotici e degassato. Al termine, riposizionare il dispositivo all'interno dell'incubatore a CO2. Successivamente, far fluire il mezzo di coltura senza antibiotici nel dispositivo per 12 ore prima di inoculare il microbioma.

Successivamente, centrifugare la miscela di cellule batteriche probiotiche precoltivate. Aspirare il sopranatante, quindi risospendere i batteri nel DMEM privo di antibiotici. Caricare circa 100 microlitri di questa sospensione cellulare in una siringa da un millilitro collegata a un ago da 25 gauge, 5/8 di pollice.

Iniettare i batteri nel lato luminale del microcanale contenente i villi intestinali precedentemente sterili. Lasciare che le cellule microbiche aderiscano alla superficie apicale dei villi intestinali per un'ora e mezza senza flusso, chiudendo il tubo con una pinza. Successivamente, perfondere il mezzo di coltura preriscaldato e privo di antibiotici in entrambi i microcanali superiore e inferiore a una velocità di 40 microlitri all'ora, applicando deformazioni ritmiche cicliche.

Questo protocollo di co-coltura permette la colonizzazione stabile di più specie di batteri probiotici nello spazio intervillocoriale. Microcolonie batteriche vitali possono essere mantenute per un periodo fino a due settimane in co-coltura. Qui viene mostrata una co-coltura differente composta da E.coli marcata con GFP e da villi intestinali.

L'ingrandimento ad alta potenza mostra chiaramente la posizione delle microcolonie batteriche al punto temporale di 72 ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di iniettare delicatamente e lentamente il mezzo di coltura nei canali microfluidici per evitare di danneggiare il monostrato di cellule epiteliali nelle fasi iniziali della coltura. A partire da questo metodo, un approccio di co-coltura con cellule immunitarie umane può inoltre fornire alcuni indizi su come il microbioma possa comunicare con il sistema immunitario e influenzare l'omeostasi e la salute intestinale ottimale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ricostituire il micro-ambiente dell'intestino umano e dimostrare la co-coltura tra il microbioma e i villi intestinali umani in vitro. Lavorare con batteri patogeni e cellule umane è estremamente pericoloso, quindi non dimenticare di operare all'interno di una cappa a sicurezza biologica.