Name: Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di Drosophila In un Olfattometro quattro quadranti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Scopri come analizzare i comportamenti olfattivi di Drosophila melanogaster utilizzando un olfattometro a quattro quadranti con software di tracciamento automatizzato. Questo metodo versatile consente di studiare i meccanismi neurali dell'olfatto.

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Ringraziamo Terry Shelley per aver realizzato l'arena di volo e l'involucro a tenuta di luce, Liz Marr per l'aiuto con la manutenzione del bestiame di mosche e Xiaojing Gao e Junjie Luo per l'aiuto con il codice Matlab utilizzato per l'analisi dei dati. Ringraziamo Johan Lundström del Monell Chemical Senses Center per aver dimostrato la sua configurazione per l'erogazione degli odori. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Whitehall Foundation (CJP) e del NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

1. Setup Assembly <ol><li> Fabbricazione l&#39;arena a forma di stella (19,5 cm x 19,5 cm x 0,7 cm) di politetrafluoroetilene (PTFE), secondo le previste disegno (materiali supplementari, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). L&#39;arena può essere prodotto da una pubblicità o di un impianto personalizzato. </li><li> Acquisire due lastre di vetro (20,25 cm x 20,25 cm con spessore di 2 mm), ed un foro (~ 0,7 cm di diametro) esattamente al centro di una delle lastre di vetro con una punta diamantata. </li><li> Fabbricazione di una scatola di comportamento a tenuta di luce per l&#39;arena comportamentale. Produciamo anche una scatola di macchina fotografica a tenuta di luce per la videocamera CCD a raggi infrarossi in base ai disegni forniti (materiali supplementari, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Le scatole possono essere fabbricati da un commerciale o di un impianto personalizzato. </li><li> Montare il condizionatore sulla parete posteriore e le matrici LED sulle pareti laterali della scatola comportamento. Posizionare la sonda di temperaturanella casella comportamento attraverso un foro laterale per risposte tempo reale della temperatura e regolazione (vedi figure 1 e 2 per i dettagli). </li><li> Attaccare il filtro IR e polarizzatore circolare per la fotocamera e montare il gruppo nella casella di fotocamera. La casella di comportamento e la scatola della fotocamera sono separati da una finestra di vetro per un migliore controllo della temperatura della scatola comportamento (vedi figure 1 e 2 per i dettagli). </li><li> Collegare la fotocamera CCD ad infrarossi ad un adattatore fotocamera. Collegare l&#39;adattatore fotocamera a un convertitore USB. Collegare il convertitore USB ad una porta USB del computer per l&#39;acquisizione dei dati. </li><li> Installare il driver per il convertitore video sul computer in base alle istruzioni del produttore. Facoltativamente, installare il software di elaborazione delle immagini fornite dal produttore del convertitore video USB per accedere a una gamma più ampia di impostazioni della fotocamera e parametri di acquisizione. </li><li> Collegare il condizionatore (attraverso &quot;l&#39;uscita&quot;Sul retro del regolatore di temperatura) e la sonda di temperatura (tramite&quot; termocoppia &quot;sul retro del regolatore di temperatura) al controllore di temperatura. Posizionare la sonda nella casella comportamento. Nota: Il sistema di controllo della temperatura nel nostro layout è in grado di mantenere la temperatura di dialogo fra 18 ° C e 30 ° C. Temperature ambiente superiori o inferiori potrebbero essere utili per thermogenetic (dTrpA1, TRPM8 o shibire ts) esperimenti per manipolare l&#39;attività neuronale o inibire la trasmissione sinaptica. Per la maggior parte degli esperimenti, la temperatura viene mantenuta a 25 ° C. </li><li> Assemblare il sistema di erogazione degli odori nei passaggi successivi (si veda la Figura 1B per gli schemi dettagliati e raccordi di collegamento): <ol><li> Utilizzare il regolatore di pressione dell&#39;aria per controllare l&#39;ingresso aria dal sistema d&#39;aria centrale. Collegare un filtro dell&#39;aria in carbonio (riempito con carbone) al regolatore di pressione per purificare l&#39;aria dalla zona centralesistema di ir. </li><li> Assemblare il sistema di controllo di flusso costituito da più canali regolati da tubi flussimetro ad alta risoluzione. </li><li> Collegare l&#39;uscita dal filtro dell&#39;aria carbonio ai tubi flussometro tramite un collettore come mostrato in figura 1B e 2F. Dirigere l&#39;uscita dei tubi di misuratori di portata attraverso elettrovalvole a 3 vie a comando elettronico per regolare se l&#39;aria pulita lasciando i misuratori di portata viene espulsa nella stanza o è entrato in camere odore misura 24. </li><li> Installare il controller elettrovalvola secondo il manuale del costruttore. </li></ol></li><li> Installare il misuratore di flusso d&#39;aria elettronica collegandolo ad un dispositivo di acquisizione dati (DAQ) e un alimentatore secondo il manuale del costruttore. Installare il software di interfaccia DAQ per verificare portate uguali in ogni quadrante della scena prima di ogni esperimento. </li></ol> 2. olfattiva stimoli Preparazione <ol><li> Preparare 5 odoricamere formica 24 che consistono in un contenitore esterno di plastica, vetro contenitore interno, un PTFE coperchio inserto misura, coperchio del contenitore originale con parte centrale rimossi, e due valvole unidirezionali. Nota: Un O-ring intorno al coperchio PTFE potrebbe essere utilizzata per impedire la perdita di aria dalla camera dell&#39;odore durante odore perfusione. Vedere la Figura 1 per schematica e la Figura 2 per le foto delle camere. </li><li> Utilizzare quattro camere odoranti per controlli con solvente, e una camera per un odorizzante test. Riempire i contenitori di vetro con 1.000 ml di diluizione solvente o odorizzante (test odoranti + opportuni solventi, mescolare accuratamente prima di esperimenti), posizionare il contenitore di vetro all&#39;interno della camera di plastica corrispondente (non fuoriuscire il liquido nella camera di plastica) e serrare il coperchio . Assicurarsi di utilizzare sempre una camera pulita per l&#39;odorizzante di test e controlli con solvente. Nota: attrazione olfattivo può essere innescato da 1/16 di diluizione di aceto di mele (5% acidità) in wAter. Al contrario, il comportamento repulsione olfattivo può essere studiata utilizzando una diluizione 10% di etil propionato in olio minerale. stimoli di controllo in questi casi sono camere odore di olio minerale puro. </li></ol> 3. Preparazione Fly <ol><li> Posteriore vola su medie farina di mais standard. Mettere 30 maschi e 30 femmine mosche genitori in una bottiglia standard, e far loro deporre le uova per 5 giorni a 25 ° C oa temperatura ambiente. </li><li> Per ogni esperimento, raccogliere nuova eclosed (&lt;1 giorno di età) 25 maschi e 25 donne vola sotto brevi di CO 2 l&#39;anestesia. </li><li> Tenere mosche in un flaconcino con il mezzo mosca standard per 2-4 giorni. </li><li> 40-42 ore prima dell&#39;esperimento, trasferire le mosche senza CO 2 anestesia &#160; in una fiala con ~ gel 10 ml 1%. Ciò manterrà le mosche umidificate senza cibo, che contribuisce ad aumentare la loro attività locomotoria. Nota: Più del 90% delle mosche deve sopravvivere alla fame. Alcuni genotipi sono meno guarireil tuo e non può farlo attraverso una fame di 40 ore. In tali casi, periodi più brevi come 24-28 hr sono accettabili, ma dovrebbero essere mantenuti gli stessi per tutte le condizioni sperimentali e ripete. </li></ol> 4. risposte comportamentali alla attraenti e repellenti Sostanza odorante <ol><li> Accendere il regolatore di temperatura e impostarlo a 25 ° C. </li><li> Collegare camere di odorizzante (controllo e test odoranti) inserendo il tubo all&#39;uscita della camera di odorizzante e al push-to-connect montaggio sulla scatola comportamento. </li><li> Controllare la portata in ogni quadrante utilizzando il debimetro per assicurarsi che il controllo e correnti d&#39;aria olfattivi sono pari a 100 ml / min. </li><li> Pulire l&#39;arena PTFE volo e le lastre di vetro con il 70% di etanolo 2-3 volte e lasciare asciugare completamente all&#39;aria (~ 3-4 minuti). </li><li> Fissare le lastre di vetro per l&#39;arena con fascette. </li><li> Trasferimento vola senza CO 2 anestesia nell&#39;arena attraverso il foro in una delle lastre di vetro. A poppaer il trasferimento, posizionare una maglia circolare sul foro per evitare la fuoriuscita mosche. Nota: CO 2 anestesia ha mostrato di influenzare il comportamento Drosophila 25 e non deve essere utilizzato entro 24 ore di un esperimento comportamentale. </li><li> Posizionare l&#39;arena con le mosche nella camera a tenuta di luce, collegare i flussi d&#39;aria quattro controllo collegando il tubo collegato al raccordo sulla scatola comportamento verso gli angoli dello stadio push-to-connect, chiudere la porta della camera e attendere 10- 15 minuti per consentire le mosche acclimatarsi al nuovo ambiente. Se possibile, attivare le luci nella stanza in cui vengono eseguiti gli esperimenti, per evitare possibili perdite di luce minima che può pregiudizio il risultato sperimentale. </li><li> Eseguire un esperimento di controllo 5-10 minuti, in cui le mosche sono esposti a correnti d&#39;aria 4 di controllo. </li><li> Analizzare i dati immediatamente (vedere la sezione di analisi dei dati di seguito) per fare in modo che le mosche sono distribuite in modo uniforme in campo, e l&#39;attrazione indice è vicino0. Questo passaggio è essenziale, poiché verifica che non vi siano fonti incontrollate di preferenza o evasione all&#39;interno dell&#39;arena (ad esempio la luce che fuoriesce dall&#39;esterno, distribuzione di temperatura uniforme, un&#39;arena irregolare, contaminazione odori, etc.). Se le mosche sono distribuite inegualmente o la loro attività locomotoria è bassa, scartare le mosche, pulire nuovamente l&#39;arena (Passo 4.4) e utilizzare un nuovo lotto di mosche di ripetere l&#39;esperimento. </li><li> Collegare la camera di prova odorizzante per la messa a punto inserendosi valvole a 3 vie o ri-collegare i tubi di collegamento. </li><li> Eseguire esperimento di prova per 5-10 minuti e analizzare i dati come discusso nella sezione 5 di seguito (vedi anche Riferimento 14 e Figura 3). Le registrazioni più lunghe di 20 minuti può risultare in file di dati che possono essere difficili da trattare computazionalmente. Se le registrazioni più sperimentali sono desiderati, rapidamente fermare e riavviare il programma di monitoraggio. Ciò si traduce in un vuoto ~ 10 sec tra le registrazioni sperimentali. </li><li> Discard mosche. </li><li> Piastre pulite arena e vetro con il 70% di etanolo (passo 4.4) e sostituire i tubi di collegamento all&#39;interno del contenitore a tenuta di luce. Per accelerare esperimenti, una nuova arena pulito può essere utilizzato, e l&#39;arena sporca pulita durante l&#39;esecuzione di prove sperimentali. </li><li> Eseguire un altro esperimento con un nuovo lotto di mosche, se necessario. Se diversi esperimenti vengono eseguiti nello stesso giorno, prestare la massima attenzione per garantire che nessun odorizzante viene lasciato nel sistema da una precedente prova. Questo non è normalmente un problema con basse concentrazioni di odoranti o con CO 2, ma può essere necessaria per stimoli altamente concentrate fino ad un gap 24 ore tra prove sperimentali. Inoltre, tutti i tubi dopo le portate tubi può essere sostituito se la contaminazione odorizzante è sospettata durante esperimenti di controllo. lasciare sempre l&#39;aria secca su tra gli esperimenti per irrigare continuamente il sistema </li></ol> Analisi 5. I dati Nota: La mosca suggerito acquisizione di monitoraggio software (descritto nei materiali), tiene traccia mosche in tempo reale durante l&#39;acquisizione, e consente di risparmiare il timestamp e le coordinate di tutte le mosche rilevati in formato * .dat. Abbiamo sviluppato una routine misura Matlab per convertire i dati in un formato Matlab, e analizzare i dati. Esempi di codice sono forniti in materiali supplementari, ma i dettagli di implementazione dipenderanno dal software utilizzato per l&#39;acquisizione dei dati. <ol><li> Caricare i dati grezzi. Creare una maschera spaziale che segue i contorni del campo e applicare la maschera per i dati grezzi per rimuovere tutti i punti di dati che non rientrano dell&#39;arena in quanto rappresentano il rumore (Figura 4A, supplementare Codice MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m). </li><li> Rimuovere tutti i punti di dati che si muovono ad una velocità inferiore 0.163 cm / s per più di 3s, come questi dati è probabile che sia rumore o generato da mosche non-movimento (Figura 4B, complementare Codice TemporalFiltering.m). </li><li> Visualizzare i dati rimanentipunti da loro tracciando fuori tutto in una volta o come singole traiettorie (Figura 3, Codice supplementare SingleTrajectoryViewer.m). Nota: La posizione dei confini odore in quattro campi probabilmente dipende da una serie di fattori, quali le caratteristiche di ogni odorizzante e le portate in uso. Ad esempio, odoranti altamente volatili probabilmente riempire il quadrante odore più completo rispetto odoranti meno volatili. Quindi è probabile che ogni odorizzante può mostrare leggermente diversi confini odore. L&#39;uso di un rivelatore fotoionizzazione per misurare confini odore può essere problematico in quanto utilizza un vuoto per campionare l&#39;aria da un determinato luogo, e quindi interrompe la concentrazione di odorizzante in quel punto. Tuttavia, i confini odore può essere rapidamente stimati sulla base di dati comportamentali mosca. Ad esempio, un confine odore base di tracce fly cumulate in risposta a diversi odori può osservare chiaramente nelle figure 3C e 3D. </li><li> Calcolare un indice attrazione per determinare se esperimenti di controllo generano alcuna risposta preferenza, e anche per accedere alla risposta ad un odorizzante (o optogenetic 9) stimolo. Per calcolare un indice di attrazione (AI), utilizzare gli ultimi 5 minuti di un controllo o di registrazione di prova. Per ottenere una misura di attrazione che cade tra +1 (attrazione assoluta) e -1 (repulsione assoluta), la seguente formula per calcolare la AI: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54346/54346eq1.jpg" /> dove prova N è il numero di punti di dati nel quadrante di prova, il controllo N è il numero medio di punti dati tre quadranti di controllo. Questa misura è intuitivo come nessuna preferenza sarebbe indicato da valori prossimi allo zero. Tuttavia, non indica correttamente la proporzione del numero totale di linea che si trovano nel quadrante odorizzante. Per ottenere questa misura, un indice percentuale (PI) può essere utilizzato: <img alt="Equazione 2" src=&quot;/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg&quot; /&gt; dove prova N è il numero di punti di dati nel quadrante test e N totale è il numero totale di punti di dati in quattro quadranti. Questa formula fornisce una misura che rientra tra 0 e 1, con 0,25 corrispondenti a nessuna preferenza comportamentale (Figura 3E e 4C, complementare Codice AttractionIndex.m). </li><li> Eseguire 5-10 ripetizioni di ogni condizione sperimentale, utilizzando un nuovo gruppo di mosche per ogni ripetizione. Confrontare gli indici di attrazione tra le condizioni o contro i controlli utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov non parametrico (Figura 3F, la funzione kstest2 in Matlab). </li></ol>

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<li>Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+Quantification+of+Odor-guided+Behavior+in+Drosophila+melanogaster+Using+the+Flywalk+Paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm.</a> J. Vis. Exp. (106), (2015).</li>
<li>Claridge-Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Writing+memories+with+light-addressable+reinforcement+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry.</a> Cell. 139 (2), 405-415 (2009).</li>
<li>Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+discrimination+in+Drosophila%3A+from+neural+population+codes+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior.</a> Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il olfattometro a quattro campi qui descritto è un sistema comportamentale versatile per studiare le risposte olfattive di grandi popolazioni di wild-type e mutante Drosophila mosche. Ogni esperimento prende ~ 1 ora (tra cui l&#39;installazione, prove sperimentali, e pulizia), e 4-6 esperimenti può essere eseguita di routine di ogni giorno. Un tipico saggio usando 40-50 mosche per 5 minuti produce circa 450.000 monitorati punti dati per l&#39;analisi. La configurazione descritta può anche essere utilizzato, con...

La capacità di adattarsi e rispondere all&#39;ambiente esterno è critico per la sopravvivenza di tutti gli animali. Un animale ha bisogno di evitare i pericoli, cercare cibo e trovare i compagni, e imparare dalle esperienze precedenti. sistemi sensoriali funzione di ricevere una varietà di stimoli, come visiva, chimiche e meccanosensoriali, e inviare questi segnali al sistema nervoso centrale per interpretare e decodificato. Il cervello dirige quindi comportamenti motori appropriati in base all&#39;ambiente percepito, come la ricerca di cibo o di fuga da un predatore. Capire come sistemi sensoriali rilevano il mondo esterno, e come il cervello decodifica e dirige le decisioni, è una sfida importante in neurobiologia. Drosophila melanogaster è un sistema potente modello per indagare come neurale comportamenti circuiti di guida. Oltre ad essere semplice e poco costoso da mantenere, Drosophila presentano molti comportamenti diversi e complessi stereotipati, ma farlo con un compact sistema nervoso di circa 100.000 neuroni. Esistono tecniche genetiche potente per manipolare il genoma di Drosophila, e migliaia di linee transgeniche sono stati generati che selettivamente e riproducibile etichettare gli stessi sottoinsiemi di neuroni 10-13. Queste linee transgeniche possono essere utilizzati per manipolare selettivamente l&#39;attività dei neuroni marcati (attivare o inibire), e queste manipolazioni possono essere utilizzati per studiare come neurale comportamenti funzioni di guida. Molteplici test comportamentali sono stati sviluppati per lo studio dei vari comportamenti di Drosophila. Drosophila, come molti animali, usano il loro senso dell&#39;olfatto per guidare molte scelte comportamentali, come trovare cibo, trovare compagni, ed evitando i pericoli. L&#39;olfatto è quindi un buon sistema sensoriale per indagare come gli stimoli esterni vengono rilevati e interpretati dal sistema nervoso di un animale per guidare scelte appropriate. Come tale, un certo numero di saggi sono stati sviluppati per investigating larvale e comportamenti olfattive adulti. Tradizionalmente, i comportamenti olfattive in Drosophila sono stati analizzati da una a due scelta paradigma T-labirinto, che può essere utilizzato per saggiare innata e comportamenti appresi olfattive 3. In questo saggio, a circa 50 mosche sono date una scelta tra due tubi: un tubo contiene l&#39;odore in questione e l&#39;altro contiene un odorizzante di controllo (di solito il solvente odore). Le mosche sono dati un determinato periodo di tempo per fare una scelta, e quindi il numero di mosche che si trovano nelle varie camere sono contati. Sebbene il T-labirinto è un semplice saggio per molti esperimenti, ci sono diverse limitazioni. Ad esempio, i comportamenti olfattivi sono misurati in un solo punto di tempo e differenti scelte effettuate prima di questo punto di tempo vengono scartati. Allo stesso modo, i singoli comportamenti delle mosche all&#39;interno della popolazione sono trascurate. Inoltre, il T-maze richiede conteggio manuale di mosche, che potrebbe introdurre errori. Infine, poiché ci sono solo due scelte misurati, questoriduce la potenza statistica spesso richiesto per rilevare cambiamenti comportamentali sottili. Un&#39;alternativa a due scelta T-labirinto è un quattro quadranti (quattro campi) olfattometro 14-18. In questo test, gli animali esplorano un&#39;arena in cui ciascuno dei quattro angoli del campo è riempito con una potenziale sorgente di aria odorizzata. Lo stadio ha una forma increspata stella per ottimizzare la formazione di quattro quadranti odore sperimentalmente definiti. Se l&#39;odore è fornito in uno degli angoli, allora è contenuto solo in quella quadrante. I comportamenti degli animali possono essere monitorati in quanto entrano ed escono dal quadrante odore e facilmente rispetto al loro comportamento nei tre quadranti di controllo. Il saggio olfattometro a quattro quadranti, quindi, record risposta comportamentale spaziale e temporale agli stimoli odore oltre una grande arena sperimentale. Il olfattometro a quattro quadranti è stato sviluppato da Pettersson et al. 15 e Vet et al. 17 per indagare sulla OLfabbrica risposte comportamentali dei singoli Imenotteri parassiti. Faucher et al. 18 e Semmelhack e Wang 16 adattato il setup per monitorare le risposte olfattive dei singoli Drosophila. Il olfattometro a quattro quadranti è altrettanto sensibile alle risposte attrazione e di repulsione, consentendo una vasta gamma di odoranti e condizioni di prova. Custom-scritto software di monitoraggio fly, sviluppato da Alex Katsov 19 e attualmente mantenuto da Julian Brown (descritto nei materiali), ha introdotto ulteriori vantaggi per le implementazioni più recenti dei quattro quadranti olfattometro 14,20-23. È ora possibile saggiare fino a 100 mosche contemporaneamente ad alta spaziale (27,5 pixel / cm) e temporale (30 fotogrammi al secondo) risoluzione, che consente l&#39;estrazione di vari parametri, quali la posizione, velocità e accelerazione di mosche in qualsiasi punto nel tempo. Ciò consente indagini sulle dinamiche di risposte comportamentali delle mosche &#39;agli odori 20 </sup&gt;. Va notato, tuttavia, che l&#39;identità di mosche individuali all&#39;interno della popolazione durante l&#39;intero periodo di monitoraggio non viene mantenuta. Invece, ogni traccia volo viene registrata per la durata di due tracce mosca non si intersecano. A quel punto, le nuove tracce vengono assegnate dopo le mosche divergono. Incorporando altri software di video-cattura (dettagliato nella tabella Materials), la stessa configurazione consente periodi di monitoraggio flessibile e può essere utilizzato per monitorare le mosche per un massimo di 24 ore, prendendo le immagini ad un frame rate inferiore. Questa opzione è stata utilizzata per studiare i comportamenti di deposizione delle uova di mosche e confrontare le loro posizioni del corpo con le preferenze ovipositional 14. Il olfattometro a quattro campo può essere usato anche per studiare le risposte a multimodali (ad esempio, olfattivi e visivi) stimoli, o combinare optogenetic 9 o 21 thermogenetic stimolazione con presentazioni di stimoli sensoriali. Inoltre, l&#39;alta risoluzione temporale permette l&#39;estrazione di traiettorie for ogni singolo volo nel set di dati insieme. Pertanto, il metodo permette di indagine in comportamenti di popolazione olfattive-guidato e anche singoli interazioni sociali. I dati generati da questo test sono robusti e altamente riproducibili, consentendo l&#39;uso del olfattometro quattro campi per schermi comportamentali. Descriviamo qui il gruppo di installazione per un olfattometro a quattro quadranti. Dimostriamo ulteriormente il suo uso in saggiare attrazione olfattiva in risposta ad aceto di mele e repulsione in risposta a propionato di etile altamente concentrata. Infine, descriviamo e fornire codice di esempio per l&#39;analisi dei dati di rilevamento fly registrati.

<table><tbody><tr><td>Sistema di erogazione dell'aria&nbsp; </td><td></td><td></td><td>(Quantità necessaria)</td></tr><tr><td>Tubi e connettori</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collettori termoplastici NPT(F)</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-31522-31</td><td>1</td></tr><tr><td>Nipplo di riduzione esagonale (1/4MNPT->1/8MNPT)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5232T314</td><td>1</td></tr><tr><td>Tubo ( ID:1/8)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5108K43</td><td>Tubi da 50 piedi</td></tr><tr><td>(ID:1/16)</td><td>McMaster-Carr, IL, Stati Uniti</td><td>52355K41</td> Raccordi per tubi spinati <td>da 100 piedi</td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr, IL, Stati Uniti</td><td>5117K71</td><td>1 confezione</td></tr> di <tr><td>raccordi per tubi push-to-connect</td><td>McMaster-Carr, IL, Stati Uniti</td><td>5779K102</td><td>4</td></tr><tr><td>raccordi per tubi spinati (1/4MNPT->1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, Stati Uniti</td><td>5463K439</td><td>1 confezione (10)</td></tr><tr><td>Raccordi per tubi spinati (1/8MNPT->1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K438</td><td>2 pezzi (10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Raccordi per tubi spinati (1/8MNPT->1/16BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K4</td><td>confezione da 2 (10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Raccordi per tubi spinati (1/4MNPT->1/4BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA&</td><td>nbsp; 5670K84</td><td>1</td></tr><tr><td>tappo a testa esagonale</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>48335K152</td><td>1</td></tr><tr><td>Regolatore di pressione dell'aria, filtro dell'aria e flussometri</td><td></td><td></td><td>(Quantità necessaria)</td></tr><tr><td>Unità di essiccazione del gas Labatorio</td><td>W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA</td><td>Modello: L68-NP-303; stock #26840</td><td>1</td></tr><tr><td>Telai multitubo per tubi di flusso da 150 mm</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R03215-30</td><td>1</td></tr><tr><td>Telai multitubo per tubi di flusso da 150 mm</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R03215-76</td><td>1</td></tr><tr><td>tubi di flusso da 150 mm</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-03217-15</td><td></td></tr> 9 <tr><td>Cartuccia valvola</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-03218-72</td><td>9</td></tr><tr><td>Regolatore dell'aria di precisione</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>6162K13</td><td>1</td></tr><tr><td>Valvole Soleniod</td><td>Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>02-10i</td><td>4</td></tr><tr><td>Controller per elettrovalvole</td><td>ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>01-18</td><td>1</td></tr><tr><td>Misuratore di portata elettronico</td><td>Honeywell</td><td>AWM3100V</td><td>1</td></tr><tr><td>DAQ (NI USB-6009, National Instruments) e a&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td>1</td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>Extech Instruments</td><td>382200</td><td>1</td></tr><tr><td>Camere per odori</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polipropilene Vaso a bocca larga 2 oz; 60 ml</td><td>Nalgene</td><td>562118-0002</td><td>Ne sono necessari almeno 5 per esperimento, ma è necessaria una camera separata per ogni diluizione di ciascun odorante. Disponibile presso Container Store, parte # 635114)</td></tr> <tr><td>Camera degli odori in vetro,</td><td>bottiglia Sunburst</td> da 0,25 once <td>LB4B</td><td>Ne sono necessari almeno 5 per esperimento.</td></tr><tr><td>Valvola "In" per camera di odori</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>214224PB-0011S000-4074</td><td>1 di queste parti viene utilizzata per camera di odore, ma devono essere sostituite frequentemente</td></tr> <tr><td>Valvola "Out" per camera di odori</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>224214PB-0011S000-4074</td><td>1 di queste parti viene utilizzata per camera di odore, ma devono essere sostituite frequentemente</td></tr><tr><td>O ring</td><td>RT Dygert International, MN, USA</td><td>AS568-029 Buna-N O-R</td><td>1 confezione (100)</td></tr><tr><td>Fly arena, fotocamera e scatole di comportamento</td><td></td><td></td><td>(Quantità necessaria)</td></tr><tr><td>Comportamento e materiale della scatola della fotocamera</td><td>Plastiche interstatali, CA, USA</td><td>ABS estruso nero (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)</td><td>1803 pollici quadrati</td></tr><tr><td>Teflon per inserti per arena di mosche e camere per odori, spessore 3/8", 12" x 12"</td> <td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>8545K27&nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Lastre di vetro, 1/8" di spessore, 9" x 9"</td> <td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>8476K191&nbsp;</td><td>numero arabo</td></tr><tr><td>Regolatore termoelettrico a doppia azione</td><td>WAtronix Inc, CA, USA</td><td>DA12V-K-0</td><td>1</td></tr><tr><td>array di LED IR</td><td>Illuminazione avanzata, Rochester, VT, USA</td><td>AL4554-88024, PS24-TL</td><td>2 array di LED e un alimentatore</td></tr><tr><td>Unità di condizionamento d'aria</td><td>Melcor Store</td><td>&nbsp; MAA280T-12</td><td>1</td></tr><tr><td>Sistema di imaging</td><td></td><td></td><td>(Quantità necessaria)</td></tr><tr><td>Cosmicar/Pentax C21211TH (12,5 mm F/1,4) Obiettivo C-Mount</td><td>B E H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td> PEC21211 <td>KP</td><td>1</td></tr><tr><td>CCXC-12P05N Cavo di interconnessione</td><td>B E H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>SOCCXC12P05N</td><td>1</td></tr><tr><td>DC-700 Adattatore per fotocamera</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td></td><td>SODC700 1</td></tr><tr><td>B+W 40,5 093 Filtro IR</td><td>B E H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>65-072442</td><td>1</td></tr><tr><td>Polarizzatore circolare TiFFEN da 40,5 mm</td><td>Amazon</td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>IR Videocamera</td><td>Industrial Vision Source, FL, USA</td><td>Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)</td><td>1</td></tr><tr><td>Convertitore video USB</td><td>The Imagingsource, NC, USA</td><td>DFG/USB2-It</td><td>1</td></tr><tr><td>iFlySpy2 (software di tracciamento delle mosche)</td><td>Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com</td><td>iFlySpy2</td><td>1</td></tr><tr><td>IC Capture 2.2 software</td><td>The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varie</td><td></td><td></td><td>(Quantità necessaria)</td></tr><tr><td>Utensile rotante Dremel</td><td>Dremel, Racine, WI, USA</td><td>Dremel 8000-03&nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Punte diamantate per il taglio del vetro</td><td>Disponibili presso vari fornitori; MSC Industrial Supply Co, Melville, NY</td><td>90606328</td><td>1</td></tr></tbody></table>

comportamenti olfattive analizzati da computer di monitoraggio di<em&gt; drosophila</em&gt; in un olfattometro quattro quadranti

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Una sfida chiave in neurobiologia è capire come i circuiti neurali funzionano per guidare i comportamenti appropriati su animali. Drosophila melanogaster è un sistema eccellente modello per tali indagini a causa dei suoi comportamenti complessi, potenti tecniche genetiche, e del sistema nervoso compatto. Laboratorio analisi comportamentale sono da tempo utilizzati con Drosophila per simulare le proprietà dell&#39;ambiente naturale e studiare i meccanismi neurali alla base dei comportamenti corrispondenti (ad es fototassi, chemiotassi, l&#39;apprendimento sensoriale e memoria) 1-3. Con la recente disponibilità di grandi collezioni di linee di Drosophila transgeniche che un&#39;etichetta specifica sottoinsiemi neurali, test comportamentali hanno assunto un ruolo di primo piano per collegare i neuroni con i comportamenti 4-11. paradigmi versatili e riproducibili, insieme con le routine di calcolo alla base per l&#39;analisi dei dati, sono indispensabili per test rapidi di linee di volo candidati con varie Genotypes. Particolarmente utili sono configurazioni che sono flessibili in numero di animali esaminati, la durata degli esperimenti e la natura degli stimoli presentati. Il dosaggio di scelta dovrebbe generare dati riproducibile che è facile da acquisire ed analizzare. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di un sistema e protocollo per saggiare risposte comportamentali di Drosophila vola in una grande arena quattro campi. La messa a punto è qui utilizzato per saggiare le risposte di mosche a un singolo stimolo olfattivo; Tuttavia, la stessa impostazione può essere modificata per testare olfattiva multipla, stimoli visivi o optogenetic, o una combinazione di questi. La configurazione olfattometro registra l&#39;attività delle popolazioni di mosca che rispondono agli odori, e metodi di analisi computazionali vengono applicate per quantificare i comportamenti mosca. I dati raccolti vengono analizzati per ottenere una rapida lettura su una corsa sperimentale, che è essenziale per la raccolta di dati efficiente e l&#39;ottimizzazione delle condizioni sperimentali.

I record del test olfattometro a quattro quadranti e analizza le attività ambulanti di molti vola sopra un grande spazio comportamentale. Odoranti possono essere introdotti nelle aeree correnti che entrano uno, due, tre, o tutti i quattro quadranti. In assenza di odori, le mosche muoversi liberamente tra tutti i quattro quadranti. Questo comportamento è fondamentale per osservare in quanto indica che i pregiudizi non intenzionali, non sono state introdotte nel test. Questi pregiudizi pos...

Descriviamo qui un metodo di configurazione comportamentale e di analisi dei dati per analizzare le risposte olfattive di un massimo di 100 mosche dell'aceto (Drosophila melanogaster). Questo sistema può essere utilizzato con stimoli olfattivi singoli o multipli e può essere adattato per l'attivazione optogenetica o il silenziamento di sottogruppi neuronali.

Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di<em&gt; Drosophila</em&gt; In un Olfattometro quattro quadranti

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

L'obiettivo generale di questa configurazione è analizzare i comportamenti olfattivi di moscerini in un olfattometro a quattro quadranti, utilizzando uno script software automatizzato per il tracciamento dei moscerini. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo al modo in cui i sistemi neurali olfattivi percepiscono il mondo esterno e come il cervello decodifichi e guidi le decisioni comportamentali. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua versatilità e robustezza, che consentono test ripetuti delle risposte olfattive di popolazioni di moscerini in un'arena sperimentale di grandi dimensioni.Per questo protocollo, preparare cinque camere per odoranti costituite da un contenitore esterno in plastica, un contenitore interno in vetro e un inserto per coperchio in PTFE su misura. L'inserto è un coperchio originale del contenitore con la parte centrale rimossa e due valvole unidirezionali attaccate. Utilizzare quattro delle camere per odoranti come controlli del solvente e una camera per un odorante di prova.Assicurarsi che ogni camera sia pulita, quindi caricare un contenitore di odorante con un millilitro di solvente o di diluizione dell'odorante. Successivamente, verificare la posizione del contenitore all'interno della camera di plastica ed assicurarsi che nessun liquido si sia versato. Fissare il coperchio utilizzando il tappo a vite e una guarnizione O-ring sull'inserimento in PTFE per prevenire perdite.Allevare le mosche su un mezzo standard a base di farina di mais. In un flacone standard, collocare 30 maschi e 30 femmine e lasciare che depongano le uova per cinque giorni a temperatura ambiente. Da tali flaconi, raccogliere le mosche appena schiuse.Per ogni coorte sperimentale, raccogliere 25 moscerini maschi e 25 femmine sotto breve anestesia con anidride carbonica e lasciare invecchiare la coorte su mezzo standard per moscerini per due o quattro giorni. Da 40 a 42 ore prima dell'esperimento, trasferire la coorte in una provetta contenente circa 10 millilitri di gel di agarosio all'uno percento per mantenere l'umidità senza cibo. La privazione alimentare aiuta ad aumentare il movimento generale e più del 90% dei moscerini dovrebbe sopravvivere al processo di digiuno.Se muore più del 10%, il che può accadere in un genotipo debole, provare a sottoporre tutte le mosche dell'esperimento a una privazione di cibo di un giorno. Almeno cinque minuti prima, accendere il controllore di temperatura e impostarlo a 25 gradi Celsius. Successivamente, collegare le camere dell'odorante all'arena tramite un tubo di plastica.Verificare la portata dell'aria in ciascun quadrante dell'arena utilizzando un flussimetro elettronico. Assicurarsi che i flussi d'aria di controllo e quelli con odorante siano entrambi regolati a 100 millilitri al minuto. Le mosche sono molto sensibili al flusso d'aria e risulta fondamentale verificare la portata in ogni quadrante prima di ciascun esperimento.Ora, pulire l'arena e le lastre di vetro utilizzando etanolo al 70%. Passare un panno su tutte le parti da due a tre volte e lasciarle asciugare completamente all'aria prima di procedere. Successivamente, fissare le lastre di vetro all'arena con delle mollette.Successivamente, trasferire le mosche nell'arena senza anestesia. Sfruttando la forza di gravità, lasciarle entrare attraverso il foro in una delle lastre di vetro e quindi coprire il foro con una rete circolare. A questo punto, posizionare l'arena contenente le mosche nella camera oscura.Quindi, collegare i quattro flussi d'aria di controllo a ciascun angolo dell'arena. Chiudere la porta della camera e lasciare che i moscerini si abituino al nuovo ambiente per 10-15 minuti. Al termine del periodo di acclimatazione, eseguire un esperimento di controllo della durata di cinque-dieci minuti, durante il quale i moscerini sono esposti a quattro flussi d'aria di controllo.È essenziale analizzare immediatamente i dati. Se i moscerini non sono distribuiti uniformemente nell'arena, quest'ultima deve essere reimpostata. È fondamentale verificare il comportamento dei moscerini di controllo esposti soltanto ad aria pulita.Questo verificherà rapidamente che tutte le condizioni di base siano normali. Perdite di luce, squilibrio termico, arena inclinata o contaminazione da odori possono causare problemi. Se necessario, scartare le mosche e pulire nuovamente l'arena.Se si sospetta una contaminazione da odorante, sostituire tutti i tubi. Continuare a ripetere il test di controllo con nuovi gruppi fino a quando gli animali non mostrano preferenza per nessuno dei quattro quadranti. Successivamente, collegare la camera dell'odorante di prova all'apparato utilizzando una valvola a tre vie, oppure ricollegare i tubi ed eseguire un esperimento di prova per cinque-dieci minuti.Per registrazioni sperimentali più lunghe, interrompere e riavviare rapidamente il programma di tracciamento ogni 20 minuti, altrimenti i file di dati diventeranno troppo grandi. Tra un test e l'altro, scartare i moscerini, pulire l'arena e le lastre di vetro con etanolo al 70% e sostituire i tubi di collegamento. Mantenere il flusso d'aria secca per lavare continuamente il sistema.Per maggiore efficienza, è consigliabile disporre di due arene in modo da poter effettuare la pulizia durante le prove. Se più esperimenti vengono eseguiti erroneamente nello stesso giorno, è necessario prestare la massima attenzione affinché nessun odore residuo di un'esecuzione precedente rimanga nel sistema. Normalmente questo non rappresenta un problema con basse concentrazioni di odorante o con CO2, ma per stimoli altamente concentrati potrebbe essere necessario un intervallo fino a 24 ore tra un'esecuzione e l'altra.Per l'analisi dei dati, utilizzare la routine personalizzata fornita in Matlab per convertire i dati in formato Matlab. Caricare il file di dati grezzi generato in tempo reale dal software di tracciamento e creare una maschera spaziale che segua i contorni dell'arena. Applicare la maschera ai dati grezzi per rimuovere tutti i punti dati che cadono al di fuori dell'arena, poiché rappresentano rumore.Quindi, rimuovere tutti i punti dati che si muovono a meno di 0,163 centimetri al secondo per più di tre secondi. Questi dati probabilmente corrispondono a rumore o a moscerini immobili. A questo punto, visualizzare i punti dati rimanenti tracciandoli tutti lungo i periodi di registrazione.I dati possono essere visualizzati anche come singole traiettorie. I limiti dell'odore possono essere stimati rapidamente in base ai dati comportamentali della mosca. Successivamente, calcolare l'indice di attrazione ed eseguire i test statistici come descritto nel protocollo del testo.25 moscerini maschi e 25 femmine sono stati testati nell'apparato comportamentale. In risposta all'aria secca, i moscerini hanno esplorato l'intera arena senza mostrare preferenza per alcun quadrante. La linea mostra la traiettoria registrata di un singolo moscerino.Quando l'aceto di mele è stato introdotto nel flusso d'aria del quadrante in alto a sinistra, la maggior parte delle mosche è stata attratta verso quel quadrante odoroso. Quando un odore repellente, il propionato di etile al 10%, è stato introdotto nel quadrante in alto a sinistra, tale quadrante è stato evitato. L'indice di attrattività di quel quadrante ha raggiunto un valore di 0,68.L'indice di attrattività è l'indice più utilizzato nella misurazione della risposta olfattiva. Un valore superiore o inferiore a zero indica rispettivamente attrazione o repulsione. Lo script ha compensato le lievi variazioni di posizione dell'arena tra i diversi tentativi.Sono stati rimossi i punti dati che potrebbero corrispondere a rumore o a moscerini immobili. Sebbene il test possa essere eseguito per qualsiasi durata, è interessante osservare le variazioni nei movimenti della coorte in intervalli di 10 secondi per apprezzare fenomeni come l'abituazione all'odore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire e analizzare efficacemente i comportamenti olfattivi in un saggio a quattro settori.Una volta acquisita padronanza, ogni esperimento olfattivo può essere completato in circa un'ora, e di routine eseguiamo da quattro a sei esperimenti durante una giornata.

olfactory-behaviors-assayed-computer-tracking-drosophila-four

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Neuroscienze

In questo articolo il video, si descrive un metodo nuovo che consente la costruzione di gradienti di odorizzante con geometrie stabili e controllabili. Abbiamo brevemente illustrare come questi gradienti possono essere usati per lo screening dei difetti olfattivi (anosmia totale e parziale) e di studiare le caratteristiche più sottili del comportamento chemiotassi.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Qui si descrivono come ottimizzare l'immagine video acquisiti per un olfattivo magnetico-legare (OMT) apparato. Ci descrivono anche due protocolli campione sperimentale per lo studio visuo-olfattiva fusione.

Visivamente monitoraggio Odore mediata durante il volo in Drosophila

I moscerini della frutta hanno un sistema olfattivo complesso, possono discriminare centinaia di odori e usano il loro senso dell'olfatto per indirizzare le decisioni comportamentali. Questo video descrive il test dell'olfattometro a quattro vie, un metodo per studiare le risposte comportamentali olfattive nei moscerini. La clip del protocollo in primo piano mostra come gestire le mosche di prova e quali sono i passaggi critici durante l'esecuzione del test.

Saggio dell'olfattometro a quattro vie: un metodo per valutare le risposte degli odori in Drosophila

Questo video descrive un metodo per testare il comportamento esplorativo olfattivo nel moscerino della frutta, chiamato labirinto a Y. La clip del protocollo in primo piano mostra come impostare ed eseguire il test.

drosofila Saggio del labirinto a Y: un metodo per valutare le risposte olfattive nelle mosche

In questo articolo video, descriviamo un test automatico per misurare l'effetto della fame o sazietà su olfattiva dipende comportamento di ricerca di cibo nel frutto adulto Drosophila melanogaster.

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in Drosophila

Vi presentiamo un test di scelta per rivelare l'influenza di odoranti sul comportamento Drosophila utilizzando un test Y-labirinto.

Test<em&gt; Drosophila</em&gt; Olfatto con un test Y-maze

Il Flywalk sistema automatizzato di monitoraggio è utilizzato per ad alta risoluzione quantificazione del comportamento odore guidati in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

Il disturbo dello spettro autistico (ASD) è associato a un comportamento sociale e comunicativo alterato e all'emergere di comportamenti ripetitivi. Per studiare l'interrelazione tra i geni ASD e i deficit comportamentali nel modello di Drosophila , in questo articolo vengono descritti cinque paradigmi comportamentali per valutare il distanziamento sociale, l'aggressività, il corteggiamento, l'adescamento e il comportamento di assuefazione.

Paradigmi per la valutazione comportamentale nel modello di Drosophila del disturbo dello spettro autistico

Procedure per la registrazione dei dati EEG e lo sguardo ad alta densità del computer durante compiti cognitivi basate su giochi sono descritti. Utilizzando un videogioco per presentare compiti cognitivi aumenta validità ecologica senza sacrificare il controllo sperimentale.

Computer Game-Based combinando esperimenti comportamentali ad alta densità tracking Gaze EEG e infrarossi

Scopri come analizzare i comportamenti olfattivi di Drosophila melanogaster utilizzando un olfattometro a quattro quadranti con software di tracciamento automatizzato. Questo metodo versatile consente di studiare i meccanismi neurali dell'olfatto.

Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di

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