Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di Drosophila In un Olfattometro quattro quadranti

L'obiettivo generale di questa configurazione è quello di analizzare i comportamenti olfattivi delle mosche in un olfattometro a quattro quadranti utilizzando uno script software di tracciamento automatico delle mosche fornito. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come i sistemi neurali olfattivi rilevano il mondo esterno e su come il cervello decodifica e dirige le decisioni comportamentali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è versatile e robusta e consente di testare ripetutamente le risposte olfattive da parte di una popolazione di mosche in un'ampia arena sperimentale.

Per questo protocollo, prepara cinque camere odorizzanti costituite da un contenitore esterno in plastica, un contenitore interno in vetro e un inserto del coperchio in PTFE su misura. L'inserto è un coperchio originale del contenitore con la parte centrale rimossa e due valvole unidirezionali collegate. Utilizzare quattro delle camere degli odori per i controlli del solvente e una camera per un test dell'odorizzante.

Assicurati che ogni camera sia pulita, quindi carica un contenitore di odorizzante con un millilitro di solvente o diluizione odorizzante. Quindi, controllare la posizione del contenitore nella camera di plastica e assicurarsi che non sia stato versato alcun liquido. Fissare il coperchio utilizzando il tappo a vite e un O-ring sull'inserto in PTFE per evitare perdite.

Allevare le mosche su un terreno di farina di mais standard. In una bottiglia standard, mettere 30 maschi e 30 femmine e lasciare deporre le uova per cinque giorni a temperatura ambiente. Da tali bottiglie, raccogli le mosche appena chiuse.

Per ogni coorte sperimentale, raccogliere 25 moscerini maschi e 25 femmine sotto breve anestesia con anidride carbonica e lasciare che la coorte invecchi su un terreno di coltura standard per due o quattro giorni. Da 40 a 42 ore prima dell'esperimento, trasferire la coorte in una fiala con circa 10 millilitri di gel di agarosio all'uno per cento per l'umidità senza cibo. La fame aiuta ad aumentare l'intero movimento e oltre il 90% delle mosche dovrebbe sopravvivere al processo di fame.

Se più del 10% muore, cosa che può accadere in un genotipo debole, prova a usare un giorno di fame per tutte le mosche nell'esperimento. Almeno cinque minuti prima, accendere il regolatore di temperatura e impostarlo a 25 gradi Celsius. Quindi, collegare le camere degli odori all'arena tramite un tubo di plastica.

Controllare la portata d'aria in ogni quadrante dell'arena utilizzando un flussometro elettronico. Assicurati che i flussi d'aria di controllo e odorosi funzionino entrambi a 100 millilitri al minuto. Le mosche sono molto sensibili al flusso d'aria ed è fondamentale che il flusso d'aria per ogni quadrante sia verificato prima di ogni esperimento.

Ora, pulisci l'arena e le lastre di vetro usando il 70% di etanolo. Pulisci tutte le parti due o tre volte e lasciale asciugare completamente all'aria prima di procedere. Quindi, fissa le lastre di vetro all'arena.

Quindi, trasferisci le mosche nell'arena senza anestesia. Usando la gravità, lasciali entrare attraverso il foro in una delle lastre di vetro, quindi copri il foro con una rete circolare. Ora, posiziona l'arena caricata con la mosca nella camera a tenuta di luce.

Quindi, collega i quattro flussi d'aria di controllo a ciascun angolo dell'arena. Chiudi lo sportello della camera e lascia che le mosche si acclimatino al nuovo ambiente per 10-15 minuti. Dopo il periodo di acclimatazione, eseguire un esperimento di controllo da cinque a 10 minuti in cui le mosche sono esposte a quattro flussi d'aria di controllo.

Ora è essenziale analizzare immediatamente i dati. Se le mosche non sono distribuite uniformemente nell'arena, l'arena deve essere ripristinata. È fondamentale testare il comportamento delle mosche di controllo per pulire l'aria.

In questo modo si verificherà rapidamente che tutte le condizioni di sfondo siano normali. Perdite di luce, squilibrio di temperatura, arena inclinata o contaminazione da odori possono causare problemi. Se necessario, scarta le mosche e pulisci di nuovo l'arena.

Se si sospetta una contaminazione da odore, sostituire tutti i tubi. Continuare a ripetere il test di controllo con nuove coorti fino a quando gli animali non mostrano alcuna preferenza per nessuno dei quattro quadranti. Quindi, collegare la camera dell'odorizzante di prova alla configurazione utilizzando una valvola a tre vie, oppure ricollegare il tubo ed eseguire un esperimento di prova per cinque-10 minuti.

Per registrazioni sperimentali più lunghe, arrestare e riavviare rapidamente il programma di tracciamento ogni 20 minuti, altrimenti i file di dati saranno troppo grandi. Tra un test e l'altro, scartare le mosche, pulire l'arena e le lastre di vetro con etanolo al 70% e sostituire i tubi di connessione. Mantenere il flusso d'aria secca in modo da lavare continuamente il sistema.

Per l'efficienza, è bene avere due arene in modo che la pulizia possa essere eseguita durante le corse. Se diversi esperimenti sono sbagliati nello stesso giorno, prestare la massima attenzione per assicurarsi che non rimanga alcun odore nel sistema da una corsa precedente. Questo normalmente non è un problema con basse concentrazioni di odorizzante o con CO2, ma per stimoli altamente concentrati, potrebbe essere necessario un intervallo di 24 ore tra le esecuzioni dell'esperimento.

Per l'analisi dei dati, utilizzare la routine Matlab personalizzata fornita per convertire i dati in un formato Matlab. Carica il file di dati grezzi realizzato in tempo reale dal software di tracciamento, e crea una maschera spaziale che segua i contorni dell'arena. Applicare la maschera ai dati non elaborati per rimuovere tutti i punti dati che si trovano al di fuori dell'arena, in quanto rappresentano disturbo.

Quindi, rimuovi tutti i punti dati che si muovono a meno di 0,163 centimetri al secondo per più di tre secondi. È probabile che questi dati siano rumore o mosche in movimento. A questo punto, è possibile visualizzare i punti dati rimanenti tracciandoli tutti attraverso i periodi di registrazione.

I dati possono anche essere visualizzati come singole traiettorie. I confini degli odori possono essere stimati rapidamente in base ai dati comportamentali della mosca. Quindi, calcola l'indice di attrazione ed effettua test statistici come descritto nel protocollo di testo.

Nell'apparato comportamentale sono stati testati 25 moscerini maschi e 25 femmine. In risposta all'aria secca, le mosche hanno esplorato l'intera arena senza preferenze per nessun quadrante. La linea mostra la traiettoria tracciata di una mosca.

Quando l'aceto di sidro di mele è stato introdotto nel flusso d'aria del quadrante in alto a sinistra, la maggior parte delle mosche è stata attratta da quel quadrante dell'odore. Quando un odorante repellente, il propionato di etile al 10%, è stato introdotto nel quadrante in alto a sinistra, quel quadrante è stato evitato. L'indice di attrattiva di quel quadrante ha ottenuto un punteggio di 0,68.

Un indice attraente è l'indice più utilizzato nella misurazione della risposta olfattiva. Un valore superiore o inferiore a zero indica attrazione o repulsione. La sceneggiatura compensava le lievi variazioni nella posizione nell'arena tra le prove.

I punti dati che avrebbero potuto essere rumore o mosche ferme sono stati rimossi. Sebbene il test possa essere eseguito per qualsiasi durata, è interessante osservare i cambiamenti nei movimenti della coorte attraverso contenitori di 10 secondi per apprezzare l'assuefazione agli odori e altri fenomeni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire e analizzare efficacemente i comportamenti olfattivi in un test a quattro campi.

Una volta padroneggiato, ogni esperimento olfattivo può essere completato in circa un'ora e di solito eseguiamo da quattro a sei esperimenti in un giorno.