Name: Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Scopri la fusione mediata da SNARE tra proteoliposomi singoli e bilayers supportati in cella microfluidica con microscopia TIRF polarizzata. Questo metodo permette di osservare eventi di fusione con risoluzione temporale di 15 ms.

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Ringraziamo Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) per la progettazione e la costruzione del microscopio TIRF polarizzato, David Baddeley (Yale University) per l'aiuto con la strumentazione di rilevamento a due colori, e James E. Rothman (Yale University) e Ben O'Shaughnessy (Columbia University) e i membri dei loro gruppi per le stimolanti discussioni. EK è supportato da un Kavli Neuroscience Scholar Award della Kavli Foundation e dalla sovvenzione NIH 1R01GM108954.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il successo dell&#39;attuazione del saggio di fusione SUV-SBL qui descritto dipende criticamente diversi passaggi chiave, come ad esempio la ricostituzione funzionale delle proteine ​​nei liposomi, ottenendo SBLs di buona qualità, e scegliendo i parametri di imaging giusti per rilevare singole molecole. Anche se può richiedere un certo tempo e fatica per avere successo, una volta che il test viene implementato con successo, fornisce una serie di informazioni sul processo di fusione non disponibile da qualsiasi altro tes...

Fusione della membrana è un processo biologico universale necessario per il traffico intracellulare di lipidi e proteine, la secrezione, la fecondazione, lo sviluppo, e avvolto entrata del virus in organismi ospiti 1-3. Per la maggior parte delle reazioni di fusione intracellulare, tra cui il rilascio di ormoni e neurotrasmettitori tramite esocitosi, l&#39;energia per fondere due doppi strati lipidici è fornito dalla formazione di un fascio di quattro elica tra cognate solubile N-ethylmaleimide sensibile proteina recettore attaccamento fattore (militare) proteine, ancorato a la vescicola (v-militare) e la membrana di destinazione (t-SNARE) 4, rispettivamente. Sinaptica vescicole esocitosi è la reazione di fusione più strettamente regolata e si verifica all&#39;interno di un millisecondo dopo l&#39;arrivo di un potenziale 1,4,5 azione. Il poro di fusione, la connessione iniziale tra i due comparti di fusione, può sfarfallio aperto e chiuso più volte prima di richiudere o espandere in maniera irreversibile 5-7. Gli ex risultatinel transitorio, &quot;kiss &amp; run&quot; di fusione, mentre il secondo porta alla piena fusione. I fattori che regolano l&#39;equilibrio tra queste due modalità di fusione e dei meccanismi che regolano pori sfarfallamento non sono ben compresi 5,8. proteine ​​SNARE sono necessari per esocitosi; sinaptica fusione delle vescicole è abolita sulla scissione di insidie ​​da neurotossine 9. Esperimenti di fusione di massa utilizzando piccole vescicole unilamellari (SUV) ha mostrato che SNAREs non solo sono necessari, ma anche sufficiente per guidare membrana fusione 10. In questo saggio rinfusa, SUV ricostituiti con v-SNARE (v-SUV) sono stati drogato con fosfolipidi fluorescenti (N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) -phosphoethanolamine (NBD-PE) e ( N -. (lissamina rodamina B sulfonil) -phosphoethanolamine (LR-PE) e mescolato con vescicole non etichettati contenenti t-SNARE (t-SUV) Inizialmente la fluorescenza di NBD-PE in V-SUV si spegne da Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET ) a LR-PE. Come laboratorioELED v-SUV fondono con etichettati t-SUV, la densità della superficie fluoroforo nella membrana ora combinato si riduce e il conseguente aumento della fluorescenza NBD-PE riporta la portata di lipidi miscelazione 10. Come il saggio di massa è facile da configurare e analizzare, è stato ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi di SNARE mediata fusione 10-14. Tuttavia, ha diverse limitazioni, come la bassa sensibilità e risoluzione temporale poveri. Ancora più importante, come una misura insieme, è in media risultati per tutti gli eventi che fanno discriminazione tra attracco e la fusione, così come il rilevamento di intermedi hemifusion difficili. Negli ultimi dieci anni diversi gruppi, compreso il nostro, hanno sviluppato nuovi metodi per monitorare gli eventi di fusione a singolo livello di vescicole 15-27. Ha e colleghi hanno utilizzato v-SUV impastoiati su una superficie e monitorato la loro fusione con i libero t-SUV 18,19. Lipid miscelazione è stata monitorata utilizzando FRET tra una coppia di fluorofori lipidi-bound emletti nel V e t-SUV, rispettivamente, utilizzando la microscopia totale 18 di riflessione a fluorescenza interna (TIRF). Più tardi, il laboratorio di Brunger utilizzato una singola specie di lipidi-label insieme con un pennarello contenuti per la rilevazione simultanea di lipidi e contenuti miscelazione 20,28. Sia i lipidi e gli indicatori contenuti sono stati inclusi a concentrazioni elevate, auto-spegnimento; fusione con SUV senza etichetta portato a fluorescenza dequenching 20,28. Altri hanno fuso v-SUV di doppi strati planari ricostituiti con t-SNARE 15-17,21-27,29. La geometria planare del target (t-SNARE contenente) imita doppio strato meglio il processo di fusione fisiologica di piccole vescicole molto curve con una membrana piatto al plasma. Il gruppo Steinem impiegato membrane poro-spanning ricostituiti con t-SNARE, sospesi su un substrato di nitruro di silicio poroso e rilevata la fusione con i singoli v-SUV con laser confocale microscopia a scansione di 23. altri Fusato v-SUV a doppi strati planari ricostituiti con t-SNARE, supportati su un substrato di vetro 15-17,21,22,24-27,29. Il grande vantaggio di utilizzare bistrati supportati (SBLs) è che microscopia TIRF può essere utilizzato per rilevare attracco e fusion eventi con un eccellente rapporto segnale-rumore e senza interferenze da trasporto V-SUV, anche se con microfluidica offre anche la risoluzione single-evento utilizzando standard di campo lontano epifluorescenza 24. Una delle principali preoccupazioni è se e come le interazioni substrato-doppio strato incidere supportati qualità doppio strato e il processo di fusione. I primi lavori ha fatto uso di SBLs planari che sono stati direttamente supportati su un substrato di vetro o quarzo 15-17. Queste SBLs sono state fatte da adsorbimento, di rottura, la diffusione e la fusione delle membrane t-SUV sul substrato. E &#39;stato ben presto si rese conto, tuttavia, che omettendo una componente chiave t-SNARE, SNAP25, da SBLs preparati in questo modo portato a v-SUV di docking e fusion cinetica indistinguisHable da quelli ottenuti con il completo t-SNARE 17. Perché SNAP25 è assolutamente necessaria per la fusione in vivo 30,31, la rilevanza fisiologica di questi primi tentativi è stata messa in discussione. Il gruppo di Tamm ha superato questa sfida utilizzando la formazione di doppio strato controllato meglio supportato 21. Ha usato la deposizione Langmuir-Blodgett per il libero di proteine ​​prima illustrativo del SBL, seguita dalla fusione di che monostrato con t-SUV 21. Ciò ha provocato la fusione SNAP25-dipendente. Per evitare potenziali artefatti associati con un doppio strato supportato direttamente su un substrato di vetro, senza necessità di utilizzare metodi di Langmuir-Blodgett, Karatekin et al. Introdotto un poli idrato (glicole etilenico) morbido cuscino, (PEG) tra il doppio strato e il substrato 24. Questa modifica ha portato anche in SNAP25-dipendente fusione 24. Doppi strati imbottiti su uno strato di polimero morbido erano stati conosciuti per meglio conservare transmembranala mobilità e la funzione delle proteine ​​32, ed erano stati utilizzati negli studi di fusione con i virus 33. Inoltre, doppi strati PEG sembrano mantenere una certa capacità di auto-guarigione e sono molto robusti 34,35. Innanzitutto, una frazione di catene lipidiche PEG-linked disponibili in commercio sono inclusi nella membrana t-SUV. Quando queste t-SUV scoppiano e formano un doppio strato planare su un substrato di vetro, una spazzola PEG riguarda sia volantini del doppio strato planare. Perché la formazione planare doppio strato è guidato dalla adesione delle catene PEG circostanti t-SUV sulla superficie di vetro idrofila, liposomi scoppio e la formazione di doppio strato planare sono relativamente insensibili alla composizione lipidica utilizzata. Tuttavia, quando sono compresi grandi quantità di colesterolo, aumentando le proprietà coesive dei SUV, SUV non possono scoppiare spontaneamente. Se questo è il caso, osmotici ioni d&#39;urto o bivalenti possono essere impiegati per aiutare a planare formazione doppio strato 25. Come accennato in precedenza, in questa approccio un pennello PEG copre entrambi i lati della planare, bistrato supportato. La spazzola di fronte al canale di flusso microfluidica aiuta a prevenire l&#39;adesione non specifica del v-SUV in arrivo che sono di solito ricoperti da uno strato PEG. La formazione di complessi V- e t-SNARE inizia dalla membrana-distale N-Termini e procede a tappe verso i domini di membrana-prossimale 36. Per il V-SUV di interagire con il t-SBL, il V- e necessità t-SNARE N-termini a sporgere al di sopra delle spazzole PEG, che sembra essere il caso nelle condizioni del saggio. Altezza spazzola può essere adattato per studiare proteine ​​diverse dalle SNAREs variando la densità di lipidi peghilato e la lunghezza della catena PEG 37,38. Un altro vantaggio delle spazzole PEG che coprono le superfici prossimali dei doppi strati di fusione è che imitano l&#39;ambiente affollato delle membrane biologiche, che sono ricchi di 30.000-40.000 proteine ​​integrali di membrana per quadrato micron 39. Proprio come le catene di PEG in questo saggio, la Repustrato proteico lsive copre membrane biologiche deve essere messo da parte per consentire il contatto tra le due doppi strati fosfolipidi per la fusione a verificarsi. canali di flusso microfluidica sono utilizzati in questo test, in quanto offrono vantaggi unici. In primo luogo, il flusso microfluidica consente più la deposizione uniforme delle t-SUV a diffondersi e si fondono per formare il t-SBL. In secondo luogo, il volume del canale piccolo (&lt;1 ml) minimizza il consumo campione. In terzo luogo, i piccoli volumi necessari consentono l&#39;intero esperimento possa essere condotto sotto flusso costante. Flusso rimuove debolmente, presumibilmente non specifico, aderito v-SUV dal SBL 16. Mantiene inoltre una densità costante di v-SUV sopra la t-SBL, semplificando l&#39;analisi cinetica 17. Infine, vescicole attraccate sono facilmente distinguibili da quelli gratuiti effettuate dal flusso 25. Quarto, diversi canali microfluidici possono essere utilizzati sullo stesso vetrino, ognuna sondando una condizione diversa. Ciò permette il confronto delle condizioni during stesso periodo sperimentale. Un approccio simile è stato utilizzato dal gruppo van Oijen per studiare la fusione tra il virus influenzale e SBLs imbottiti 33. In microscopia TIRF, il decadimento esponenziale del campo evanescente (con una costante di decadimento ~ 100 nm) limita eccitazione di fluorescenza a quelle molecole che sono in stretta vicinanza dell&#39;interfaccia di vetro-buffer. Questo minimizza il contributo di molecole fluorescenti che sono più lontani, aumenta il rapporto segnale-rumore, e permette sensibilità singola molecola con tempi di esposizione telaio di 10-40 msec. Il campo evanescente comporta anche un aumento del segnale dopo la fusione: il trasferimento lipidi etichettata SUV nel SBL, si trovano, in media, in un campo di eccitazione più forte. Questo aumento della fluorescenza è più forte per liposomi grandi. Se la luce polarizzata viene utilizzato per generare il campo evanescente, effetti aggiuntivi contribuiscono a variazioni nella fluorescenza upon transfer di etichette dal SUV nella SBL. Alcuni coloranti lipidi hanno un dipolo di transizione orientato con un angolo medio preferito rispetto al doppio strato in cui sono inserite. Questo crea una differenza nella quantità di fluorescenza emessa da fluorofori quando sono in SUV rispetto al SBL, poiché il fascio polarizzato ecciterà coloranti nei due membrane diverso. Per il primo, il fascio di eccitazione interagirà con dipoli di transizione orientate in tutto il SUV sferica, mentre per il secondo, orientamenti dipolo saranno limitati dalla geometria SBL piatta. Ad esempio, quando si utilizza s-polarizzata luce incidente (polarizzata normale al piano di incidenza), eccitazione è più efficace quando il colorante è nella SBL rispetto al SUV per un colorante lipidi transizione dipolo orientato parallelamente alla membrana 29,40 (come quella di DII o DID 41-43). Un SUV drogato con una tale fluoroforo appare scura quando esso si fissa su l&#39;SBL (Figura 7, Representat<html> ive risultati). Come un poro di fusione apre e collega le membrane SUV e SBL, sonde fluorescenti diffondono nel SBL e diventano più probabilità di essere eccitato dal campo evanescente s-polarizzati 25,27,29. Di conseguenza, il segnale di fluorescenza integrato intorno al sito di fusione aumenta bruscamente durante il trasferimento di colorante dal SUV nella SBL 27 (Figura 3 e Figura 7). Un ulteriore fattore che contribuisce alle variazioni del segnale che accompagnano la fusione è dequenching di etichette fluorescenti come vengono diluiti quando trasferito nella SBL. Il contributo di dequenching è generalmente minore rispetto al campo di decadimento e di polarizzazione effetti evanescenti nel test qui descritto, perché solo una piccola frazione ( <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) Dei lipidi sono etichettati. L&#39;aumento del segnale dopo fusione può essere sfruttata per dedurre proprietà poro di fusione confrontando il tempo,1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, richiesto per un lipide di fuggire attraverso un poro che è liberamente permeabile ai lipidi per il tempo di rilascio effettivo, <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . Se i due scale temporali sono comparabili, sarebbe concludere che il poro presenta poca resistenza al flusso dei lipidi. Tuttavia, se il tempo di rilascio effettivo è notevolmente più lungo del tempo di immissione a diffusione limitata, ciò indica un processo, come pori sfarfallio, ritardando il rilascio dei lipidi. Il tempo di rilascio di diffusione limitata, <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> , Dipende dalle dimensioni del liposoma fusione e lipidi diffusività; la stima richiede questi due parametri da quantificare. Il singolo sensibilità molecola del test permette di lipidi diffusività da misurare, monitorando diversi fluorofori singolo lipidi dopo la loro immissione in SBL per ogni evento di fusione 26. Le dimensioni di ogni vescicole fusionepuò essere stimato 27 combinando (i) l&#39;intensità di un singolo colorante lipidi, (ii) la variazione di fluorescenza totale circa una docking sito dopo tutti fluorofori sono trasferiti nel SBL sulla fusione, (iii) la nota densità etichettatura dei SUV lipidi, e (iv) la superficie per lipidica. Per molti eventi di fusione, l&#39;attuale tempi di rilascio dei lipidi sono risultati essere molto più lento di quanto previsto dal rilascio diffusione controllato 27, come è stato notato in precedenza assumendo dimensioni SUV uniforme 44. Assumendo il ritardo del rilascio di lipidi è dovuta a pori sfarfallio, un modello quantitativo permette di stimare &quot;apertura dei pori&quot;, la frazione di tempo poro rimane aperta durante la fusione 27. Ogniqualvolta pratica, è importante testare meccanismi di fusione utilizzando sia lipidi e contenuto solubili etichette. Ad esempio, il rilascio dei lipidi potrebbe essere ritardato con metodi diversi da pori tremolante, come la restrizione di lipidi diffusione dalle proteine ​​SNARE che circondano tegli poro. Se così fosse, quindi rilasciare dei contenuti sarebbe precedere supporto di etichette lipidi, purché il poro è sufficientemente grande da consentire il passaggio di sonde solubili. Un difetto più fondamentale in approccio potrebbe essere nella ipotesi che il trasferimento dei lipidi etichettati al SBL avviene attraverso uno stretto poro di fusione collega la SBL ad una vescicola che ha sostanzialmente mantenuto la sua forma pre-fusione. Trasferimento dei lipidi nel SBL potrebbe anche derivare da una rapida dilatazione del poro di fusione con un concomitante, estremamente rapido collasso del SUV nella membrana SBL, come suggerito in precedenza sulla base dei dati di rilascio dei lipidi solo 29. Monitoraggio sia lipidi e contenuto rilasciare contemporaneamente, si è constatato che molti pori richiuse dopo aver rilasciato tutte le loro etichette di lipidi, ma mantenuto alcune delle loro carico solubile 27. Questo indica che almeno alcuni liposomi non collassano nel SBL dopo la fusione, e che il trasferimento di colorante dei lipidi nel SBL avviene attraverso un poro di fusione. Inoltre, lIPID e contenuto liberazione è avvenuta contemporaneamente 27, il che rende improbabile che il ritardo del rilascio di lipidi è dovuto alla impedimento di lipidi diffusione dalle proteine ​​SNARE che circondano il poro 45. Un protocollo di fusione SUV-SBL che non monitorare il rilascio contenuti solubili è stato precedentemente pubblicato da Karatekin e Rothman 25. Qui, gli sviluppi più recenti sono incluse, il monitoraggio e cioè simultaneo di lipidi e contenuti rilascio e la stima delle proprietà SUV, lipidi, e poro di fusione 27. Il protocollo inizia con le istruzioni per la preparazione delle cellule microfluidica, realizzati da incollaggio un poli (dimetil silossano) (PDMS) elastomero blocco contenente scanalature con un vetrino di vetro 25. Successivamente, la preparazione di v-SUV con sia lipidi e contenuto marcatori è spiegato. Sezioni 4 e 5 forniscono istruzioni per l&#39;assemblaggio delle celle microfluidica, formando le SBLs in situ e il controllo di difetti e la fluidità, l&#39;introduzione di vSUVS nelle celle di flusso e il rilevamento degli eventi di fusione. Sezione 6 fornisce le istruzioni per l&#39;analisi dei dati.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Milli-Q (MQ) acqua</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 190 Proof</td><td>Decon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Chemical</td><td>A416P4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cholride (KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-idrossietil] piperazina-N'-[acido 2-etansolfonico] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>tampone HEPES-KOH (pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH, 140&nbsp; mM KCl, 100&nbsp; &mu; M EGTA, 1&nbsp; mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4">Solvents</td></tr><tr><td>Cloroformio&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>in flacone di vetro, ATTENZIONE, indossare DPI</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-03</td><td>in flacone di vetro, ATTENZIONE, indossare DPI</td></tr><tr><td colspan="4">Preparazione dei liposomi</td></tr><tr><td>Siringa Hamilton a tenuta di gas</td><td>Hamilton</td><td>var. dimensioni</td><td>utilizzare solo sringe di vetro con solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)Tubi</td></tr> <tr><td>di vetro Pyrex Vista 11 ml, tappo a vite 16x100 mm provetta per coltura</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>70825-16</td><td>pulire accuratamente, sciacquare con cloroformio</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleyl-sn-glicero-3-fosfocolina, 16:0-18:1 PC (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td>Lipids vengono disciolti in CHCl3 o come polvere lifilizzata in fiale sigillate. Aliquotare all'apertura. Conservare in eccesso sotto forma di film lipidici essiccati in atmosfera inerte a -20 °C. Conservare le scorte in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) a -20 °C. lasciare arrivare a RT prima di aprire</td></tr><tr><td>1,2-dieoleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sale sodico), 18:1 PS (DOPS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td>Come sopra.</td></tr><tr><td>1-stearoil-2-arachidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850804</td><td>Come sopra.</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (cervello, suino) (sale di ammonio), cervello PI(4,5)P2</td><td>Avanti Lipidi polari</td><td>840046</td><td>Come sopra.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(7-nitro-2-1,3-benzossadiazol-4-il) (sale di ammonio), 18:1 NBD PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145</td><td>Come sopra.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio), 18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880130</td><td>Come sopra.</td></tr><tr><td>colesterolo (lana ovina, >98%)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>Come sopra.</td></tr><tr><td>Olio DiD'; Olio DiIC18(5) (1,1'-Diottadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindodicarbocianina Perclorato)</td><td>Sonde molecolari</td><td>D-307</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor R-210</td><td>Buchi</td><td>R-210</td><td>bagno di calore sopra Tm di lipidi utilizzati</td></tr><tr><td>OG n-Octyl-&beta;-D-Glucopyranoside</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td><td>conservare a -20 &deg; C, lasciare venire a RT prima di aprire</td></tr><tr><td>l'agitatore - Eppendorf Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze Cassette per dialisi, 20k MWCO, 3&nbsp; ml</td><td>life technologies</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbenti</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&nbsp; Gradiente di densità medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per ultracentrifugazione, parete sottile, ultra trasparente, 13,2&nbsp; ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>rotore</td><td></td><td></td><td></td>Beckman SW41 Ti</tr><tr><td>SuflorhodamineB</td><td>Sonde molecolari</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column&nbsp; Colonne per cromatografia, 2,5 & 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange Protein Gel</td><td>Stain Molecular Probes</td><td>S-6650</td><td>5.000x Concentrato in DMSO</td></tr><tr><td colspan="4">PDMS block</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit di elastomero siliconico, PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri in vetro Pyrex, 150 x 20 mm, completa di coperchio</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>Perforatrice - Perforatrice per biopsia riutilizzabile, 0,75&nbsp; mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Punzonatrice manuale per fori&nbsp;</td><td>Trapano SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>.035 x .026 x 1,5 304 SS Punzone rotondo rivestito in TiN</td> Diametro del trapano <td>SYNEO</td><td>CR0350265N20R4</td><td>: 0,9 mm, dimensione del foro del punzone: 0,74 mm</td></tr><tr><td>Tygon Microbore tubo, 0,25 mm ID, 0,76 mm OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-00</td><td>0,010" ID, 0,030"</td></tr><tr><td>OD Tubi in silicone (0,51 mm ID, 2,1 mm OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>95802-00</td><td>0,020" ID, 0,083" OD</td></tr><tr><td colspan="4">Vetro di copertura - camera bianca pulita</td></tr><tr><td>Schott Nexterion vetrino coprioggetto D</td><td>Schott</td><td>1472305</td><td></td></tr><tr><td>pulitore al plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pTIRF configurazione e accessori</td></tr><tr><td>IX81 corpo del microscopio</td> Fotocamera CCD <td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>EM</td><td>Andor</td><td>ixon-ultra-897</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate, tavolino per microscopio riscaldato</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U52RA26</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe in vetro Hamilton da 1 ml (4x)</td>Pompa a siringa <td>Hamilton</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td></td><td>kd Scientific</td><td>KDS-230</td><td></td></tr></tbody></table>

fusion snare-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers tethered supportati in una cella di flusso microfluidic monitorati da polarizzata microscopia tirf

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Nel processo onnipresente di fusione della membrana l&#39;apertura di un poro di fusione stabilisce il primo collegamento tra due compartimenti precedentemente separate. Durante neurotrasmettitore o il rilascio di ormoni tramite esocitosi, il poro di fusione può transitoriamente aprire e chiudere più volte, che regolano carico cinetica di rilascio. la dinamica dei pori determinano anche la modalità di riciclo delle vescicole; risultati richiusura irreversibili nella fusione transitoria, &quot;kiss-and-run&quot;, mentre la dilatazione porta alla completa fusione. Per capire meglio quali fattori governano la dinamica dei pori, abbiamo sviluppato un test per monitorare la fusione delle membrane mediante microscopia polarizzata riflessione interna totale in fluorescenza (TIRF) con sensibilità singola molecola e ~ 15 msec risoluzione temporale in una biochimica ben definito sistema in vitro. Fusione di fluorescente piccole vescicole contenenti proteine ​​unilamellari v-SNARE (v-SUV) con un cuscinetto doppio strato planare t-SNARE, appoggiato su un cuscino di polimero morbido (t-SBL, doppio strato t-supportato), È monitorata. Il test utilizza canali di flusso microfluidica che assicurano il consumo di campione minimo mentre fornisce una densità costante di SUV. Sfruttando il potenziamento del segnale rapida al momento del trasferimento di etichette lipidi dal SUV per la SBL durante la fusione, la cinetica di trasferimento della tintura dei lipidi è monitorato. La sensibilità di microscopia TIRF permette il monitoraggio etichette lipidici fluorescenti singoli, da cui lipidi diffusività e la dimensione SUV possono essere dedotte per ogni evento di fusione. Lipidi tempi di rilascio di colorante può essere molto più lungo del previsto per il passaggio senza ostacoli attraverso i pori permanentemente aperti. Utilizzando un modello che assume il ritardo del rilascio di lipidi è dovuta a pori sfarfallio, un poro &quot;apertura&quot;, la frazione di tempo poro rimane aperto durante la fusione, può essere stimato. Un marcatore solubile può essere incapsulato in SUV per il monitoraggio simultaneo di lipidi e il rilascio del carico solubile. Tali misurazioni indicano alcuni pori possono richiudere dopo aver perso una frazione del carico solubile.

Qualità SBL È fondamentale verificare la qualità e la fluidità del SBL prima dell&#39;esperimento di fusione. La fluorescenza sul lato inferiore, il vetro di un canale microfluidico deve essere uniforme, senza difetti evidenti. Se una bolla d&#39;aria passa attraverso il canale, di solito lascia cicatrici visibili sulla SBL. Se ci sono così grandi cicatrici scala / difetti, non utilizzare quel canale. A volte ...

Qui, vi presentiamo un protocollo per rilevare, eventi di fusione singoli SNARE-mediata tra liposomi e bistrati supportati in canali microfluidica utilizzando TIRFM polarizzata, con sensibilità singola molecola e ~ 15 risoluzione temporale msec. Lipidi e il rilascio del carico solubili possono essere rilevati simultaneamente. dimensioni liposomi, diffusività dei lipidi, e poro di fusione proprietà sono misurate.

Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

L'obiettivo generale di questo saggio è osservare singoli eventi di fusione della membrana mediati dalle proteine SNARE neuronali ed esocitotiche per comprendere i meccanismi fondamentali del rilascio di neurotrasmettitori e ormoni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande chiave nel campo della fusione delle membrane, come ad esempio come avvenga il rilascio del carico attraverso un poro di fusione dinamico e quale sia la sorte del poro dopo la fusione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che stadi distinti dell'ancoraggio delle vescicole, della fusione per l'apertura e della cinetica del rilascio del carico possono essere osservati per singoli eventi all'interno di ambienti biochimicamente definiti.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'esocitosi, può essere applicato anche ad altre reazioni di fusione delle membrane, come la fusione dei virus con involucro con le membrane delle cellule bersaglio durante l'infezione. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica incontreranno difficoltà poiché molti passaggi diversi devono essere padroneggiati, dalla microfabbricazione alla purificazione delle proteine e all'analisi mediante imaging. Per iniziare, preparare un modello maestro in silicone utilizzando tecniche standard di fotolitografia e il modello mostrato qui.Successivamente, aggiungere 100 millilitri di base PDMS e 10 millilitri dell'agente indurente in un bicchiere di plastica monouso e mescolare bene la miscela. Poi, posizionare il bicchiere in un essiccatore sotto vuoto. Applicare il vuoto, ma sorvegliarlo attentamente per evitare che la miscela trabocchi.Dopo aver eliminato i gas, versare una goccia abbondante della miscela di PDMS disgasata in una piastra di Petri di vetro e premere il calco sul PDMS con il lato del modello rivolto verso l'alto, per evitare di intrappolare bolle d'aria sotto la wafer. A questo punto, versare il PDMS disgasato sul modello fino a ricoprirlo con uno strato di cinque-otto millimetri di polimero. Se si forma una bolla d'aria, rimuoverla delicatamente con la punta di una pipetta.Posizionare il modello rivestito in PDMS su una superficie livella di un forno e cuocere per tre ore a 60 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare una nuova lama di bisturi per ritagliare un blocco di PDMS contenente le strutture dei canali modellati. Si noti che il blocco ritagliato deve essere adatto a essere posizionato su un vetrino coprioggetto.Successivamente, posizionare il lato con le scanalature del canale rivolto verso l'alto e utilizzare un perforatore per forare il blocco con un movimento continuo. Assicurarsi di rimuovere il pezzo espulso da ciascuna delle otto posizioni dei fori. Al termine, attaccare le scanalature del blocco rivolte verso il basso su un pezzo pulito di carta d'alluminio.Ora, tagliare il tubo in modo che abbia una leggera inclinazione a un'estremità e utilizzare una pinzetta per inserire il tubo all'interno dei fori perforati per circa un terzo della sua lunghezza. Tagliare i tubi in modo che siano in grado di raggiungere il serbatoio del tampone e la pompa a siringa. Per collegare i tubi alle siringhe della pompa a siringa, tagliare un breve tratto da un tubo di silicone più grande e inserire da un lato il tubo più sottile.Questo blocco di PDMS pronto all'uso può essere conservato per alcuni mesi. Inizialmente, posizionare il blocco di PDMS sotto vuoto spinto per almeno 20 minuti per rimuovere i gas disciolti e ridurre il rischio di formazione di bolle d'aria nei canali microfluidici durante l'esperimento di fusione. Successivamente, assicurarsi che l'area del palchetto del microscopio sia impostata alla temperatura desiderata.Mentre la temperatura si stabilizza, preparare le vescicole unilamellari piccole marcate con NBD-PE contenenti proteine t-SNARE, oppure i controlli privi di proteine, diluendo 30 microlitri delle vescicole con 60 microlitri di tampone. Successivamente, aspirare la soluzione in una siringa da tre millilitri. Espellere la maggior parte dell'aria sopra il campione tenendo la siringa in posizione verticale.Quindi, sigillare la punta utilizzando una pellicola di paraffina e creare un vuoto tirando lo stantuffo. Mentre si crea il vuoto, battere leggermente sul corpo della siringa per accelerare la degasificazione della soluzione. Ripetere questo procedimento alcune volte fino a quando non compaiono più bolle d'aria applicando il vuoto.Successivamente, utilizzare un ago ipodermico con un diametro leggermente superiore a quello del tubicino microfluidico per praticare un foro nel tappo di una provetta da microcentrifuga. Riempire la provetta da microcentrifuga con vescicole unilamellari piccole degassate, posizionarla nel supporto sul palchetto del microscopio e lasciare che la soluzione raggiunga l'equilibrio alla temperatura impostata. Posizionare un coprioggetto pulito in un pulitore al plasma e sottoporlo a plasma d'aria per circa cinque minuti.Quindi, rimuovere il vetrino e posizionarlo, con il lato trattato rivolto verso l'alto, su alcuni fazzoletti privi di lanugine che fungono da cuscino. Successivamente, posizionare il blocco in PDMS, con il lato stampato rivolto verso il basso, sopra il vetrino. Utilizzare una pinzetta per premere delicatamente sul blocco, senza esercitare una pressione eccessiva che potrebbe rompere il vetro.Posizionare la cella a flusso assemblata sul palchetto del microscopio. Successivamente, collegare i tubi ai serbatoi di vescicole unilamellari piccole e alla pompa a siringa. Iniziare l'aspirazione delle vescicole unilamellari piccole a tre microlitri al minuto fino a quando la soluzione riempie completamente i canali.Quando le soluzioni in tutti i canali iniziano a muoversi verso l'alto lungo il tubo sul lato di uscita, ridurre il flusso a 0,5 microlitri al minuto e incubare per 30-45 minuti. L'intervallo di tempo tra il trattamento al plasma del vetrino di vetro e il passaggio delle SUV all'interno del canale non deve superare i 10 minuti, poiché l'effetto del trattamento al plasma è transitorio. Verificare la presenza di perdite nei canali mediante imaging a fluorescenza con un obiettivo a basso ingrandimento, quindi risciacquare tutti i canali con tampone disgassato per rimuovere le vescicole non legate.Quindi, passare all'obiettivo ad immersione in olio ad alto ingrandimento per la microscopia TIRF e fissare la cella a flusso applicando del nastro sulla piastra del microscopio. Chiudere il diaframma del campo a circa 40 micrometri di diametro e regolare l'intensità della luce di eccitazione a 488 nanometri mediante il software, in modo da sbiancare in modo significativo, ma non completo, la fluorescenza nell'area esposta. L'intensità della fluorescenza al centro dell'area esposta dovrebbe essere inferiore rispetto ai bordi, poiché le molecole intatte di NBD-PE entrano e diffondono per una certa distanza prima di essere sbiancate.Tuttavia, se le SUV aderenti alla superficie non si rompono, tutti i fluorofori nell'area esposta dovrebbero sbiancarsi. Per verificare i risultati delle misurazioni dello stato dello studio, interrompere l'illuminazione e riavviarla alcuni minuti dopo per verificare se la fluorescenza si è ripristinata. Degasare il buffer di riconstituzione e utilizzarlo per diluire la soluzione madre di vescicole unilamellari piccole recostituite con v-SNARE, in modo che la soluzione risultante produca da 10 a 100 eventi di fusione nel campo visivo nell'arco di 60 secondi.Troppi eventi di fusione aumentano la fluorescenza di fondo e rendono difficile il rilevamento e l'analisi degli eventi. Al contrario, una frequenza di fusione troppo bassa può portare a scarse statistiche. Far fluire le vescicole unilamellari piccole reconstituite con v-SNARE nel canale a una portata di due microlitri al minuto e passare alle opportune impostazioni di eccitazione ed emissione per monitorare il mescolamento lipidico.Quindi, regolare l'angolo e la polarizzazione TIRF come descritto nel protocollo testuale allegato. Eccitare continuamente e monitorare la fluorescenza delle vescicole utilizzando un laser a 561 nanometri. Quando le vescicole raggiungono il canale di flusso e si ancorano alla bicella supportata fondendosi con essa, il segnale di fluorescenza di fondo inizia ad accumularsi.Regolare l'intensità del laser di eccitazione tramite il software in modo da sbiancare continuamente la fluorescenza di fondo, in modo che nuovi eventi di aggancio e fusione possano essere facilmente osservati. Acquisire diversi filmati in posizioni differenti all'interno di un determinato canale. Verificare la fluorescenza di NBD-PE per assicurarsi che il bilayer supportato non presenti difetti in queste posizioni.Il recupero della fluorescenza dopo il fotoblesciamento è mostrato qui per un bilayer sostenuto reconstituito con t-SNARE relativamente privo di difetti e fluido. L'area viene immaginata con esposizione alla luce bassa per seguire il recupero della fluorescenza mediante diffusione dei lipidi marcati con NBD. È più facile osservare gli eventi di aggancio e fusione monitorando la fluorescenza proveniente esclusivamente dai marcatori lipidici.Nella sequenza di immagini mostrata qui, un fotogramma è stato registrato ogni 18 millisecondi. Al momento della fusione, i marcatori lipidici si trasferiscono nel bilayer supportato e diffondono lontano dal sito di fusione. In alcuni casi, è utile monitorare contemporaneamente il mescolamento dei lipidi e il rilascio del carico solubile.Un evento rappresentativo che descrive il mescolamento simultaneo dei lipidi e il rilascio del carico solubile è mostrato qui. Alle alte concentrazioni utilizzate per l'incapsulamento, la fluorescenza del contenuto solubile rappresentata in rosso è inizialmente auto-quenched. Un brusco aumento della fluorescenza lipidica, rappresentata in blu, indica il mescolamento dei lipidi dovuto a un evento di fusione, come nel monitoraggio monocromatico delle etichette lipidiche mostrato in precedenza.L'apertura del poro rilascia il colorante contenuto solubile e allevia il quenching iniziale del colorante all'interno della cavità della vescicola. Questo porta a un aumento del segnale del carico solubile, rappresentato in rosso. In modo interessante, la fluorescenza del carico ha raggiunto una fase di plateau stabile.Ciò indica che il poro si è richiuso dopo aver rilasciato tutti i marcatori lipidici e una frazione del carico solubile. Alla fine, il segnale del contenuto solubile, rappresentato in rosso, diminuisce molto rapidamente. Ciò è probabilmente dovuto a una rapida fusione completa o alla rottura del liposoma.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare una cella di flusso microfluidica a partire da un bilayer sostenuto reconstituito con proteine t-SNARE, e di come monitorare e analizzare singoli eventi di fusione di vescicole mediante microscopia TIRF. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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