Protocollo per isolare il circolo di Willis mouse

L'obiettivo generale di questa procedura di dissezione è quello di isolare il circolo murino di Willis per facilitare lo studio dei grandi vasi della cerebrovascolarizzazione del topo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio dell'espressione genica cerebrovascolare in varie malattie che colpiscono i vasi cerebrali come il morbo di Alzheimer e l'angiopatia ameloide cerebrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i grandi vasi possono essere isolati rapidamente e facilmente senza alterare la struttura del vaso.

Inizia usando le forbici dell'iride per praticare un'incisione lunga quattro centimetri nella parete addominale e nel peritoneo di un topo anestetizzato letale appena sotto la gabbia toracica. Successivamente, praticare un'incisione lunga alcuni millimetri nel diaframma, continuando l'incisione lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica. Sollevare lo sterno e bloccare la punta con un emostato, appoggiando l'emostatico sul collo.

Quindi tagliare con cura il tessuto adiposo che collega lo sterno al cuore. Ora passa un ago a profusione calibro 15 attraverso il ventricolo sinistro fino all'apice del cuore e usa le forbici per tagliare uno dei lobi del fegato per creare uno sbocco per il perfusato. Perfondere l'animale con 25-50 millilitri di PBS a una velocità di pompa di 2,5 millilitri al minuto per una decina di minuti.

Il fegato dovrebbe sbiancare quando il sangue viene sostituito con PBS. Quando il liquido dal fegato è completamente limpido, fermare la perfusione. Per isolare il cervello, usa le forbici dell'iride per praticare un'incisione sulla linea mediana lungo la pelle dal collo al naso.

Taglia via la pelle con le forbici dell'iride per esporre il cranio e rimuovere eventuali residui muscolari e tessuto adiposo. Quindi, posiziona le punte delle forbici dell'iride su un lato del forame magno e fai scorrere con cura le punte lungo la superficie interna del cranio fino al meato uditivo esterno. Praticare un'incisione simile sull'altro lato del forame magno, seguita da un taglio della linea mediana lungo la superficie interna dell'osso interparietale fino all'inizio della sutura sagittale.

Pianta le forbici dell'iride chiuse nell'osso frontale tra gli occhi nella sutura sagittale e apri le lame per dividere il cranio in due. Usando una pinza, afferra i bulbi olfattivi e usa le forbici dell'iride per tagliare le connessioni nervose sulla superficie ventrale del cervello. Quindi immergi il cervello in una capsula di Petri da 60 millimetri di PBS ghiacciato.

Per isolare il cerchio di Willis, trasferisci il piatto su un impacco di ghiaccio al microscopio da dissezione e gira il cervello sulla sua superficie dorsale per visualizzare il cerchio di Willis. Usa la piccola pinza per afferrare le arterie cerebrali anteriori alla base dei lobi olfattivi ed esercita una pressione per dissociare le arterie dal continuum del vaso. Taglia le arterie cerebrali medie allo stesso modo.

Quindi usa le estremità affilate della pinza per afferrare le arterie cerebrali medie e sollevare l'inizio delle arterie comunicanti posteriori, scollegando entrambi i gruppi di arterie dal cervello. Quindi, sollevare le arterie anteriori, tirandole delicatamente sopra il chiasma ottico in direzione dorsale anteriore. Rimuovere allo stesso modo le arterie cerebellari superiore e posteriore, seguite dallo spostamento dell'arteria basilare.

Infine, usa la pinza per trasferire delicatamente l'intero cerchio di Willis in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente PBS ghiacciato e fissa i vasi in posizione con piccoli spilli, usando due pinze per rimuovere con cura il tessuto cerebrale rimanente. Il cerchio di Willis dovrebbe uscire in un unico pezzo, e dovrebbe essere leggermente trasparente a causa dell'assenza di sangue residuo nel sistema vascolare. Il cerchio pulito di Willis dovrebbe esprimere specificamente i marcatori delle cellule muscolari lisce vascolari, come l'actina muscolare liscia, la catena pesante muscolo-miosina liscia e la liscia elina.

I marcatori neuronali, come la glicoproteina degli oligodendrociti della mielina o la proteina 2 associata ai microtubuli, al contrario, dovrebbero essere appena rilevabili nel circolo di Willis. Inoltre, l'espressione del marcatore endoteliale, E-Selectina, nel non-circolo del tessuto neurale di Willis, è molto simile a quella ottenuta per il cerchio di campioni di Willis, riflettendo probabilmente l'esistenza di una rete cervello-capillare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i vasi cerebrali del topo sono molto sottili e si rompono facilmente. Pertanto, la dissezione deve essere eseguita con molta attenzione, senza fretta, per garantire che l'intera struttura venga raccolta in un unico pezzo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle malattie neurali infiammatorie per esplorare il disturbo vascolare cerebrale in un modello murino di Alzheimer e malattie correlate come l'angiopatia amiloide cerebrale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare il cerchio di Willis da un topo.