Name: Protocollo per isolare il circolo di Willis mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Impara un protocollo riproducibile per isolare il circolo di Willis murino senza alterarne la struttura. Questo metodo facilita lo studio dell'espressione genica cerebrovascolare in modelli di malattie neurodegenerative.

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Questo lavoro è stato sostenuto da Parigi VI University e una borsa di Pierre Fabre innovazione.

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le normative della Comunità Europea per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio, con l&#39;approvazione del comitato etico locale per la sperimentazione animale (Ile de France-Paris-Comitato, Autorizzazione 4270). 1. Anestesia <ol><li> Infondere una dose letale di pentobarbital (fino a 1 mg / 10 g di peso corporeo) (ago calibro 27 e la siringa da 1 ml) per via intraperitoneale in topi adulti prima dell&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 2. Vessel Perfusione NOTA: Non vi è alcuna necessità di applicare veterinario pomata per gli occhi durante la perfusione del vaso. Questa procedura è rapida (5-10 minuti) e si conclude con la morte dell&#39;animale. Confermare la mancanza di risposta con un pizzico punta. <ol><li> Utilizzando forbici iris, fare un&#39;incisione, lungo circa 4 cm, nella parete addominale e del peritoneo, appena sotto la gabbia toracica. </li><li> Effettuare una piccola incisione (lunga pochi millimetri) nel diaframma e poi continue l&#39;incisione della membrana lungo l&#39;intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica. </li><li> Sollevare lo sterno distanza e bloccare la punta dello sterno con il hemostat; posizionare la pinza emostatica sul collo. Rifilare con cura il tessuto adiposo che collega lo sterno al cuore. </li><li> Passare il perfusione ago 15-gauge attraverso il ventricolo sinistro nella punta del cuore. </li><li> Infine, usare le forbici per tagliare uno dei lobi epatici per creare una presa. NOTA: uno sbocco alternativo può essere creato utilizzando forbici iris per creare un&#39;incisione per l&#39;atrio destro. </li><li> Profumato l&#39;animale con da 25 a 50 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con una pompa funzionante a una velocità di 2,5 ml / min. Il fegato deve scottare come il sangue viene sostituito con PBS. </li><li> Dopo circa cinque minuti, una volta che il fluido dal fegato è completamente chiaro, interrompere la perfusione. </li><li> Se è prevista immunocolorazione o colorazione normale, profumato l&#39;animale con 50 ml di paraformaldeide(PFA, 4% in PBS) per 15 min. NOTA: Attenzione, fumi PFA sono tossici. Perfusione dell&#39;animale con PFA deve essere eseguita in una cappa aspirante ventilata. </li></ol> 3. Isolamento del cervello e il circolo di Willis <ol><li> Isolamento del cervello <ol><li> Rimuovere la testa con un paio di forbici chirurgiche. </li><li> Effettuare una incisione sulla linea mediana con forbici iris, lungo la pelle dal collo al naso. </li><li> Tagliare la pelle per esporre il cranio e rimuovere eventuali residui dei muscoli e dei tessuti adiposi con le forbici iris. </li><li> Posizionare la punta delle forbici iris nel foro occipitale su un lato e con cura scorrere lungo la superficie interna del cranio al meato uditivo esterno (noto anche come il canale uditivo). </li><li> Riprodurre l&#39;incisione descritto in 3.1.4 sul lato controlaterale e fare una linea mediana tagliare lungo la superficie interna dell&#39;osso inter-parietale all&#39;inizio della sutura sagittale. </li><li> Piantare l&#39;irideforbici in l&#39;osso frontale, in mezzo agli occhi, nella sutura sagittale e poi aprire per dividere il cranio in due. </li><li> Estrarre il cervello, afferrando i bulbi olfattivi e utilizzando le iris forbici per tagliare le connessioni nervose sulla sua superficie ventrale. </li><li> Rimuovere il cervello e collocarlo in una 60 mm piastra di Petri contenente ghiacciata PBS per l&#39;isolamento mucca. Completamente immergere il cervello in PBS. Se il cervello è stato fissato con 4% PFA (per il successivo sezionamento e immunocolorazione o colorazione normale), mantenerlo in un bagno di 4% PFA a 4 ° C per 24 ore. </li></ol></li><li> Isolamento del circolo di Willis NOTA: è necessario un microscopio da dissezione per l&#39;isolamento mucca. Il cervello deve essere conservato a 4 ° C durante tutta la procedura. <ol><li> Mettere il cervello a testa in giù (vale a dire, sulla sua superficie dorsale) per visualizzare la mucca. </li><li> Utilizzare una piccola pinza per afferrare le arterie cerebrali anteriori (ACA) alla base dei lobi olfattivi ( <strong&gt; a, figura 1) ed esercitare una pressione dissociare loro dal continuum recipiente. Utilizzare la stessa procedura per tagliare le arterie cerebrale media (MCA) a B (figura 1). </li><li> Utilizzare le estremità taglienti delle pinze per sollevare e rimuovere le principali arterie che formano la mucca dalla corteccia. </li><li> Sollevare l&#39;inizio delle arterie comunicante posteriore (PCA) per staccarli dal cervello, afferrando le arterie cerebrali medie (MCA) con le pinze. Raccogliete le arterie anteriore (ACA e MCA) e tirare delicatamente sopra il chiasma ottico in senso antero-dorsale. Per evitare di disturbare la mucca, interrompere la procedura per affrontare le altre arterie. </li><li> Ripetere i punti 3.2.2 e 3.2.3 per le arterie cerebellare superiore e posteriore (SCA) / (PCA) (c, Figura 1) e per l&#39;arteria basilare (BA) (d, Figura 1), tirando in un dorso- direzione anteriore. Arresto al termine della procedura descritta in 3.2.4. </li><li> Rimuovere la mucca intera tirando delicatamente con le pinze. Posizionare la mucca in un 60 mm piastra di Petri pieno di ghiaccio PBS freddo e rimuovere qualsiasi tessuto cerebrale collegata rimanendo con due pinze, tenendo la mucca in posizione con piccoli perni. </li><li> Mantenere la mucca raccolto a -80 ° C per la successiva elaborazione di purificazione dell&#39;RNA (rese di estrazione RNA grandi quantità di RNA - circa 500 ng) o estrazione delle proteine. Nota: la mucca può essere mantenuta ex vivo per 24 ore, adattando il sistema bagno per organi sviluppato per isolato mouse arteria olfattiva 7. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> Figura 1: Schema di una ventrale Vista del cervello di topo Evidenziando la mucca La mucca è formato da due arterie carotidi interne (MCA), che sono derivati da due arterie cerebrali anteriori (ACA);. il basilaredelle arterie (BA) filiali nel posteriore (PCA) e superiore (SCA) arterie cerebrali, e due arterie vertebrali (VA).

<ol><li>Beckmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cerebrovascular+abnormalities+and+blood+flow+disturbances+in+APP23+mice+modeling+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo qui un protocollo riproducibile per l&#39;isolamento del circolo di Willis. I disturbi cerebrovascolari più comuni che coinvolgono la mucca sono vasculopatie CAA-associata, aterosclerosi intracranica e aneurisma intracranico, i quali incidono le pareti dei vasi arteriosi. I fattori di rischio sono ben noti, ma la patogenesi molecolare di questi disturbi cerebrali rimane poco compresa e marcatori biologici specifici per predire il loro verificarsi sono carenti. Vi è un notevole interesse per i metodi per isol...

Il circolo cerebrale arteriosa (Circulus arterioso cerebrale), noto anche come il circolo di Willis (vacca), ciclo di Willisor Willis poligono) è stato descritto da Thomas Willis nel 1664. Si tratta di una anastomosi circolatorio situata intorno al chiasma ottico e l&#39;ipotalamo che possono essere considerato come un mozzo centrale fornitura di sangue al cervello e strutture circostanti. Il sangue entra in questa struttura tramite carotide interna e arterie vertebrali e scorre fuori dal cerchio tramite mezzo interni e arterie cerebrali posteriori. Ognuna di queste arterie è a sinistra ea destra rami su entrambi i lati del cerchio. La basilare, posta comunicare, e comunicante anteriore arterie completa il cerchio (Figura 1 e Figura 2). Il rischio di flusso di sangue alterata in qualsiasi delle arterie deflusso è minimizzato dalla fusione di sangue che entra nel cerchio dalla carotide e arterie cerebrali, garantendo così che il sangue sufficiente viene fornito al bpioggia. Tale struttura serve anche come la via principale per il flusso di sangue collaterale in gravi malattie occlusive dell&#39;arteria carotide interna. Diversi tipi di disturbi cerebrovascolari hanno la loro origine nella mucca. I più comuni sono angiopatia amiloide (CAA) vasculopatie -associated, aterosclerosi intracranica e aneurismi intracranici. 1, 2, 3 Questi disturbi possono portare a ipoperfusione a causa della vasodilatazione, e intracerebrali e / o subaracnoidea emorragie in ultima analisi, si traduce in ictus ischemici o emorragici o , nella migliore delle ipotesi, un attacco ischemico transitorio. I recenti progressi nelle procedure diagnostiche, tra neuroimaging, eventualmente combinato con angiografia, hanno permesso di diagnosticare tali principali malattie cerebrovascolari clinicamente, senza la necessità di una biopsia cerebrale. Tuttavia, trattamenti efficaci e specifici (farmacologici o endovascolare) sono attualmente mancano e non vi è quindi la necessità di definire nuovibersagli molecolari. L&#39;identificazione di nuovi bersagli farmacologici per la prevenzione di queste malattie negli esseri umani richiederà modelli animali e modi di isolare il cerebro-vascolare compresa la mucca. Tali modelli dovrebbero fornire la prova di indizi e ai cambiamenti specifici, tra cui alterazioni infiammatorie, che si verificano nelle pareti dei grandi vasi in modelli animali di aneurisma dell&#39;arteria intracranica, CAA o aterosclerosi intracranica. 4, 5, 6 Abbiamo stabilito un metodo per l&#39;isolamento del mouse mucca per facilitare gli studi di infiammazione dei vasi nella malattia di Alzheimer (AD) e relative patologie, come la CAA. Questo metodo per isolare la mucca mouse è stato sviluppato per la valutazione dell&#39;espressione genica cerebrovascolare infiammatoria durante la progressione della malattia. Insieme con il rilevamento di deposizione di beta amiloide all&#39;interno delle pareti delle arterie piale leptomeningee e, questo metodo potrebbe rendere più facile per scoraggiaremia la possibile relazione tra l&#39;espressione genica infiammatoria nella parete cerebro-vascolare e l&#39;accumulo A?-peptide. La rete vascolare del cervello, compreso il leptomeningeo e pial nello spazio subaracnoideo, è un&#39;estensione delle grandi arterie che formano il cerchio di Willis. Il metodo qui descritto potrebbe essere utilizzato per isolare la mucca di qualsiasi lignaggio mouse e potrebbe essere utilizzato per tutti i tipi di controlli (ad esempio, l&#39;espressione genica, la produzione di proteine e le modifiche delle proteine posttranslational) sui grandi vasi del mouse cerebro-vascolare.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a iride fine temprate&nbsp;</td><td>Forbici Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>- Dritte / Affilate / Affilate&nbsp; &nbsp; 16,5 cm</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Pincipe&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio zoom stereoscopico</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Superficie 60mm Piatto di coltura</td><td>Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protocollo per isolare il circolo di willis mouse

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

Il circolo cerebrale arteriosa (Circulus arterioso cerebrale) o un cerchio di Willis (COW) è una anastomosi circolatorio che circonda il chiasma ottico e l&#39;ipotalamo che fornisce sangue al cervello e le strutture circostanti. E &#39;stato coinvolto in diverse malattie cerebrovascolari, tra cui angiopathy cerebrale amiloide (CAA) vasculopatie -associated, aterosclerosi intracranica e aneurismi intracranici. Gli studi dei meccanismi molecolari alla base di queste malattie per l&#39;identificazione di nuovi bersagli farmacologici per la loro prevenzione richiedono modelli animali. Alcuni di questi modelli possono essere transgenico, mentre altri coinvolgeranno isolamento del cerebro-vascolare, compreso il metodo CoW.The qui descritto è adatto per l&#39;isolamento mucca in qualsiasi lignaggio del mouse e ha un notevole potenziale per lo screening (espressione dei geni, produzione di proteine, modifiche delle proteine post-traduzionali, analisi secretoma, ecc) studi sui grandi vasi del cerebro del mousevascolarizzazione. Può essere utilizzato anche per studi ex vivo, adattando il sistema bagno per organi sviluppato per arterie del mouse olfattivi isolati.

<html> Il mouse PBS-perfuso viene ucciso e la mucca è isolato come descritto nella sezione 3.2 del protocollo. Quando la dissezione viene eseguita correttamente, il vaccino deve uscire in un unico pezzo e dovrebbe essere leggermente trasparente per l&#39;assenza di sangue residuo nel sistema vascolare. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> Figura 2: La mucca mouse dopo ...

Descriviamo qui un protocollo riproducibile per isolare la cerchia dei topi di Willis.

Protocollo per isolare il circolo di Willis mouse

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

L'obiettivo generale di questa procedura di dissezione è isolare il poligono di Willis murino per facilitare lo studio dei vasi sanguigni di grandi dimensioni della cerebrovascolarizzazione del topo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio dell'espressione genica cerebrovascolare in varie malattie che colpiscono i vasi cerebrali, come la malattia di Alzheimer e l'angiopatia amiloide cerebrale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i vasi di grandi dimensioni possono essere isolati rapidamente e facilmente senza alterarne la struttura.Iniziare utilizzando forbici da iridectomia per praticare un'incisione lunga quattro centimetri nella parete addominale e nel peritoneo di un topo letalmente anestetizzato, appena al di sotto della gabbia toracica. Successivamente, effettuare un'incisione lunga alcuni millimetri nel diaframma, proseguendo l'incisione per tutta la lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica. Sollevare lo sterno e bloccarne l'estremità con una pinza emostatica, appoggiando la pinza sulla nuca.Quindi rimuovere con attenzione il tessuto adiposo che collega lo sterno al cuore. Ora inserire un ago da perfusione di calibro 15 dal ventricolo sinistro fino all'apice del cuore e utilizzare le forbici per tagliare uno dei lobi del fegato, creando così un'uscita per il liquido di perfusione. Perfondere l'animale con 25-50 millilitri di PBS a una velocità della pompa di 2,5 millilitri al minuto per circa dieci minuti.Il fegato dovrebbe schiarirsi man mano che il sangue viene sostituito con PBS. Quando il liquido proveniente dal fegato è completamente limpido, interrompere la perfusione. Per isolare il cervello, utilizzare forbici ad iris per eseguire un'incisione mediana lungo la cute dal collo fino al naso.Tagliare la pelle con le forbici ad iris per esporre il cranio ed eliminare qualsiasi tessuto muscolare e adiposo residuo. Successivamente, inserire le punte delle forbici ad iris da un lato del forame magno e far scorrere con attenzione le punte lungo la superficie interna del cranio fino al condotto uditivo esterno. Eseguire un'incisione simile sull'altro lato del forame magno, seguita da un'incisione mediana lungo la superficie interna dell'osso interparietale fino all'inizio della sutura sagittale.Piantare le forbici per iridectomia chiuse nell'osso frontale tra gli occhi, lungo la sutura sagittale, e aprire le lame per dividere il cranio in due parti. Utilizzando la pinzetta, afferrare i bulbi olfattivi e usare le forbici per iridectomia per recidere le connessioni nervose sulla superficie ventrale del cervello. Successivamente immergere il cervello in una piastra Petri da 60 millimetri contenente PBS ghiacciato.Per isolare il circolo di Willis, trasferire la piastra su un pacchetto di ghiaccio sotto un microscopio stereoscopico e ruotare il cervello in modo da esporre la sua superficie dorsale per visualizzare il circolo di Willis. Utilizzare la pinzetta fine per afferrare le arterie cerebrali anteriori alla base dei lobi olfattivi ed esercitare una pressione per dissociare le arterie dal sistema vascolare. Tagliare le arterie cerebrali medie nello stesso modo.Quindi utilizzare le estremità appuntite della pinzetta per afferrare le arterie cerebrali medie e sollevare l'inizio delle arterie comunicanti posteriori, staccando entrambi i gruppi di arterie dal cervello. Successivamente, sollevare le arterie anteriori, tirandole delicatamente sopra il chiasma ottico in direzione anteriore e dorsale. Rimuovere le arterie cerebellari superiori e posteriori nello stesso modo, seguito dallo spostamento dell'arteria basilare.Infine, utilizzare la pinzetta per trasferire delicatamente l'intero poligono di Willis in una piastra di Petri da 60 millimetri contenente PBS freddo su ghiaccio e fissare i vasi al loro posto con piccoli perni, utilizzando due pinzette per rimuovere con attenzione qualsiasi tessuto cerebrale residuo. Il poligono di Willis dovrebbe essere prelevato in un unico pezzo ed essere leggermente trasparente a causa dell'assenza di sangue residuo nella vascolarizzazione. Il poligono di Willis pulito dovrebbe esprimere specificamente marcatori delle cellule muscolari lisce vascolari, come l'Actina del Muscolo Liscio, la Catena Pesante della Miosina del Muscolo Liscio e la Smoothelin.I marcatori neuronali, come la glicoproteina oligodendrocitica della mielina o la proteina 2 associata ai microtubuli, al contrario, dovrebbero essere appena rilevabili nel circolo di Willis. Inoltre, l'espressione del marcatore endoteliale E-Selectina nei tessuti neurali non appartenenti al circolo di Willis è molto simile a quella ottenuta nei campioni del circolo di Willis, il che potrebbe riflettere l'esist游戏副本enza di una rete di capillari cerebrali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due ore se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che i vasi cerebrali del topo sono molto sottili e si rompono facilmente. Pertanto, la dissezione deve essere eseguita con grande attenzione, senza fretta, per garantire che l'intera struttura venga prelevata in un unico pezzo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle malattie neuroinfiammatorie per esplorare i disturbi vascolari cerebrali nel modello murino di Alzheimer e in malattie correlate come l'angiopatia amiloide cerebrale.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare il poligono di Willis da un topo.

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Questo video mostra la procedura di isolamento delle cellule immunitarie dai plessi coroidi di topo. Questa procedura viene utilizzata nella ricerca neuroimmunologica per capire come le cellule immunitarie nei plessi coroidei influiscono sulla salute del cervello e su varie malattie neurologiche.

Isolamento delle cellule immunitarie dai plessi coroidi di topo

Si introduce un metodo chirurgico per indurre sperimentale ischemia / riperfusione (I / R) pregiudizio per simulare infarto del miocardio (MI) in modelli murini che consente una maggiore chiarezza posizionamento della legatura sulla discendente anteriore sinistra (LAD) per migliorare la riproducibilità di esperimenti MI nei topi.

Un modello murino di ischemia miocardica e riperfusione lesioni da legatura della arteria discendente anteriore sinistra

L'infiammazione gioca un ruolo centrale nella patogenesi dell'ictus ischemico. Prove crescenti suggeriscono che agisce come un'arma a doppio taglio che esacerba le lesioni cerebrali precoci, ma contribuisce anche alla riparazione successiva. Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule immunitarie dal cervello ischemico e la loro successiva fenotipizzazione citofluorimetrica.

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Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare l'isolamento e coltura tecniche di cellule muscolari murine primarie lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica. Una volta VSMC sono stati isolati, essi possono essere utilizzati per vari tecniche di coltura standard.

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

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En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento degli epatociti primari del topo sano e funzionale. Istruzioni per la rilevazione sintesi epatica delle proteine nascenti dal substrato di etichettatura non radioattivo erano fornite per aiutarvi a comprendere i meccanismi alla base della sintesi proteica nel contesto dell'omeostasi del metabolismo energetico nel fegato.

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Qui è presentato un protocollo per l'isolamento e l'amplificazione di batteri commenali congiuntivali anaerobici aerobici e facultativi del topo utilizzando un tampone oculare unico e una fase di arricchimento basata sulla coltura con successiva identificazione con metodi microbiologici basati e spettrometria di massa MALDI-TOF.

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Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali murine dai capillari linfatici dermici. Le cellule endoteliali linfatiche isolate possono essere utilizzate per esperimenti in vitro a valle e per l'analisi dell'espressione proteica.

Isolamento di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine

Impara un protocollo riproducibile per isolare il circolo di Willis murino senza alterarne la struttura. Questo metodo facilita lo studio dell'espressione genica cerebrovascolare in modelli di malattie neurodegenerative.

Protocollo per isolare il circolo di Willis mouse

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