Eccitazione esterna dei neuroni Usando campi elettrici e magnetici in mono e culture bidimensionali

L'obiettivo generale di questo protocollo per la stimolazione elettrica e magnetica di colture monodimensionali e bidimensionali è quello di utilizzare le colture neuronali in modo efficiente come modello ridotto per la stimolazione cerebrale da cui possiamo estrarre informazioni e parametri importanti. L'utilizzo del nostro protocollo di stimolazione elettrica con colture unidimensionali ci consente di misurare parametri specifici relativi all'eccitazione neurale, ad esempio la cronoassia e la reobase in diversi compartimenti del neurone. La tecnica di stimolazione magnetica ci permette di confrontare l'effetto dei campi magnetici rispetto a quelli elettrici sulle colture neuronali.

Questo modello ci consente anche di diagnosticare e trattare meglio i disturbi cerebrali. Proponiamo un metodo efficace e semplice per la coltura di reti neuronali in qualsiasi modello di progettazione, anche reti unidimensionali. Possiamo quindi orientare campi magnetici elettrici e variabili nel tempo rispetto a queste reti per separare e osservare i contributi provenienti da diversi compartimenti del neurone.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede soggetti umani o modelli animali, consentendo una ricerca estesa ed esaustiva dei parametri giusti per la stimolazione neuronale. A dimostrare la procedura saranno Yuri Burnishev, un tecnico del mio laboratorio e Ami Eisen, uno studente di dottorato in laboratorio. Per iniziare, preparare colture neuronali modellate seminando cellule neurali su vetrini coprioggetti parzialmente pre-rivestiti con uno strato di biorigetto.

Per fare ciò, pulire i vetrini coprioggetti da 25 millimetri. E usando una macchina sputtering, rivestire il vetrino coprioggetti con uno strato di biorigettamento. Regolare i parametri per il processo di deposizione per creare uno strato costituito da un sottile film di cromo da sei a 10 angstrom, che garantisce la stabilità del rivestimento e uno strato d'oro spesso 30 angstrom che fornisce al rivestimento la reattività tiolica.

Una volta completato il processo, rimuovere il vetrino coprioggetti dalla Sputtering Machine ed esaminare il rivestimento ottenuto. Quindi, assembla un sistema di plotter a penna modificato sostituendo la punta dell'inchiostro di una penna plotter con un ago da incisione in metallo affilato. Posizionare un foglio di gomma incollato su una piastra rigida nel plotter in modo da garantire una superficie robusta e ad alto attrito durante l'incisione.

Quindi, regolare la posizione del foglio premendo i pulsanti forniti sul plotter. Una volta posizionato il foglio di gomma, pipettare una piccola goccia d'acqua sulla sua superficie e posizionare il vetrino coprioggetti pre-rivestito sopra la goccia. Successivamente, utilizzando il plotter, incidi gli strati metallici mediante graffi ripetitivi generando linee spesse 200 micrometri per creare i modelli desiderati.

Prima di una stimolazione elettrica, posizionare il vetrino coprioggetti seminato in una camera di imaging. Per stimolare le cellule con un campo elettrico di direzione costante, utilizzare due elettrodi paralleli separati da 11 millimetri e situati ai lati opposti della coltura placcata sui vetrini coprioggetti da 13 millimetri. Quindi, assemblare la camera di imaging della coltura e il supporto dell'elettrodo corrispondente in modo che gli elettrodi a filo siano immersi nel terreno extracellulare e posizionati un millimetro sopra la coltura.

Quindi, collegare la singola coppia di elettrodi all'amplificatore operazionale che amplifica il segnale proveniente dal generatore. Applicare un singolo impulso di onda quadra bipolare con un ciclo di lavoro del 50% e un'ampiezza di 22 volt. Utilizzare un'onda bipolare senza componenti CC per evitare l'elettrolisi che può verificarsi sugli elettrodi.

Applicare l'impulso della durata da 10 microsecondi a quattro millisecondi per garantire una stimolazione efficace ma prevenire lesioni cellulari. Per stimolare le celle con campi elettrici di direzione variabile, utilizzare due coppie di elettrodi perpendicolari. Assicurarsi che le due coppie di elettrodi e i relativi terminali di alimentazione e monitoraggio siano completamente isolati elettricamente l'uno dall'altro e che siano flottanti da terra.

Per modificare l'orientamento del campo elettrico, variare l'ampiezza della tensione applicata alle due coppie di elettrodi. Quindi, determinare l'intensità e la direzione del campo risultante mediante l'addizione vettoriale. Per generare un campo rotante di ampiezza fissa, applicare un'onda sinusoidale a una coppia di elettrodi mentre si alimenta l'altra coppia con un'onda coseno.

Per iniziare la stimolazione magnetica, posizionare al microscopio una coltura neuronale, coltivata in uno schema di forma circolare. Stimolare la coltura utilizzando una bobina di stimolazione magnetica circolare standard e uno stimolatore di supporto, disponibili in commercio. Per stimolare le colture con intensità di campo magnetico non standard, collegare una bobina di stimolazione magnetica su misura allo stimolatore costruito su misura.

Quindi, con l'aiuto di un puntatore laser, allineare il centro della coltura al centro della bobina per garantire una stimolazione di successo. Regolare le posizioni della bobina in modo che rimanga a circa cinque millimetri sopra il centro della coltura. Una volta posizionata correttamente la bobina di stimolazione, caricare lo stimolatore a un potenziale fino a cinque kilovolt.

Quindi, utilizzando un interruttore ad alta corrente e alta tensione, scaricare l'alta corrente di voltaggio attraverso la bobina di stimolazione per generare un impulso magnetico che stimola l'attività dei neuroni in coltura. Infine, montare una bobina di raccolta nella stessa posizione della coltura neuronale e misurare l'intensità del campo magnetico generato. Questo schema mostra che applicando diverse ampiezze di impulsi di tensione alle due coppie di elettrodi, i campi elettrici possono essere orientati ad ogni angolo senza la necessità di ruotare manualmente la coltura.

Ecco le registrazioni di esempio di transitori di calcio con stimolazione elettrica a tensioni applicate differenti. Quando si applica una durata costante del campo elettrico, il numero di neuroni che si attivano e rispondono al campo elettrico mostra una distribuzione gaussiana cumulativa in funzione dell'ampiezza della tensione. E questo è un esempio di una curva forza-durata ottenuta utilizzando questo protocollo.

Per le colture ad anello che rispondono al campo magnetico, il tasso di successo della stimolazione cresce con il raggio di coltura. Questo grafico mostra la relazione tra la dimensione dell'anello e l'intensità del campo magnetico. La maggior parte delle eccitazioni di successo delle colture risiede nella sovrapposizione tra lo spazio della fase sperimentalmente accessibile e la regione ad alta probabilità.

Una volta padroneggiata, la preparazione delle colture unidimensionali può essere eseguita entro tre o quattro ore. Quando si esegue la stimolazione elettrica e magnetica, è importante ricordare di consentire il pieno recupero della coltura dalla fase di stimolazione e di assicurarsi che tutte le apparecchiature siano galleggianti rispetto alla terra elettrica. Seguendo questa procedura, si possono affrontare altre domande come la coltura di neuroni da diverse aree del cervello, la misurazione delle statistiche, ad esempio, dei neuroni corticali.

Un'altra possibilità è quella di misurare i parametri di qualsiasi neurone modello di malattia. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada all'ottimizzazione della forza e della durata necessarie per una stimolazione cerebrale efficace e sicura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare qualsiasi modello desiderato di colture neuronali e di essere in grado di stimolarle elettricamente o magneticamente per lo studio delle interazioni dei neuroni con i campi elettromagnetici.