Fluorescence Activated di separazione delle cellule (FACS) e Gene Expression Analisi di Fos-esprimono neuroni da freschi e congelati Rat tessuto cerebrale

L'obiettivo generale di questa procedura è dissociare i neuroni che esprimono Fos dal tessuto cerebrale di ratto adulto fresco o congelato per il successivo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, o FACS. Questo metodo può essere utilizzato per isolare le cellule neuronali di interesse per identificare il neuroadattamento molecolare unico dei neuroni attivati comportamentali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'uso di tessuto congelato, facilitando l'isolamento di cellule da più aree cerebrali in giorni diversi.

Per elaborare questo tessuto cerebrale fresco, inserire due o più lame di rasoio preraffreddate nelle fessure di una matrice di affettatura del cervello ghiacciata per tagliare fette coronali di uno o due millimetri contenenti le regioni cerebrali di interesse, posizionando le sezioni su una lastra di vetro raffreddato mentre vengono tagliate. Per prima cosa, seziona la regione del cervello di interesse, scarta le altre aree e rimuovi la sostanza bianca. Per congelare il tessuto, trasferire i campioni in una microprovetta e immergere la provetta in isopentano a -40 gradi Celsius per 20 secondi per la conservazione a -80 gradi Celsius fino a ulteriore elaborazione.

Per tritare il tessuto, lasciare scongelare i campioni su una lastra di vetro fredda per non più di un minuto prima di coprirli con una o due gocce di soluzione tampone A. Quindi, tenendo una lama di rasoio completamente verticale rispetto alla piastra, tritare il tessuto 100 volte in ciascuna direzione ortogonale. Per tritare accuratamente il tessuto, è fondamentale mantenerlo umido con il tampone A e seguire i tempi e le indicazioni di macinazione specificati.

È fondamentale rimuovere la maggior parte della sostanza bianca durante la dissezione del tessuto e mantenere il tessuto coperto dal tampone A per migliorare l'efficienza della macinazione e mantenere la salute delle cellule. Quando il tessuto è stato accuratamente lavorato, utilizzare la lama di rasoio per trasferire i pezzi in una provetta da microcentrifuga contenente un millilitro di tampone A freddo e capovolgere la provetta da tre a cinque volte per immergere tutto il tessuto tritato nella soluzione. Per dissociare i frammenti di tessuto in una sospensione unicellulare, pellettare i campioni mediante centrifugazione.

Scartare il surnatante. Quindi, aggiungere lentamente un millilitro di soluzione enzimatica fredda appena scongelata lungo la parete interna della microprovetta. Utilizzare una pipetta con puntale di grande diametro per aspirare e dosare immediatamente l'intero pellet quattro volte per disperdere i pezzi di tessuto tritati.

Quindi, capovolgere rapidamente la microprovetta per evitare che i pellet si attacchino al fondo della provetta e incubare il campione con miscelazione end-over-end per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della digestione, centrifugare nuovamente la provetta e aggiungere 0,6 millilitri di Buffer A freddo alle cellule. Utilizzando lo stesso puntale della pipetta, aspirare ed erogare immediatamente i pellet cinque volte.

Quindi, selezionare una pipetta di vetro da 1,3 millimetri e utilizzarla per triturare delicatamente i campioni 10 volte. Posizionare il campione sul ghiaccio per due minuti per consentire ai detriti e alle cellule non dissociate di depositarsi sul fondo della provetta. Quindi, trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 15 millilitri.

Quindi, aggiungere 600 microlitri di soluzione di Buffer A al pellet rimanente e utilizzare una pipetta di 0,8 millimetri di diametro per triturare il campione altre 10 volte. Dopo aver lasciato sedimentare i tessuti come appena dimostrato, raggruppare il surnatante con la prima sospensione cellulare e aggiungere altri 600 microlitri di tampone al pellet. Quindi, utilizzare una pipetta da 0,4 millimetri per triturare il campione e posizionare la provetta sul ghiaccio per due minuti per consentire ai tessuti di depositarsi.

Seguire le fasi di triturazione meccanica del protocollo è importante per una selezione di successo. Successivamente, raggruppare il surnatante con le cellule dissociate. Quindi, aggiungere 600 microlitri di tampone A al campione e ripetere la triturazione della pipetta da 0,4 millimetri altre tre volte.

Metti le provette sul ghiaccio per due minuti per consentire alle cellule di depositarsi. E poi, raccogli il surnatante in un secondo tubo da 15 millilitri. Ripetere il processo di triturazione altre tre volte, utilizzando la pipetta di vetro più piccola, aumenta significativamente la resa delle cellule per la successiva cernita.

Dopo che tutti i surnatanti sono stati raccolti, aggiungere 800 microlitri di etanolo al 100% negativo a 20 gradi Celsius a quattro mirotubi su ghiaccio. Quindi, trasferire 800 microlitri di cellule dalla prima provetta di surnatante raccolto in ciascuna delle prime due provette di etanolo e 800 microlitri di cellule dalla seconda provetta di surnatante in ciascuna delle ultime due provette di etanolo. Capovolgere le provette per mescolare i campioni.

Quindi, posizionare i campioni sul ghiaccio per 15 minuti, mescolando per inversione ogni cinque minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule. Quindi, toccando solo la parete del microtubo, utilizzare una micropipetta per rimuovere lentamente tutti i microlitri di ciascun surnatante tranne gli ultimi 50 litri.

Filtrare ciascuna delle due sospensioni cellulari separatamente utilizzando due diverse coppie di filtri cellulari. Le cellule sono quindi pronte per la marcatura con anticorpi contro i marcatori cellulari di interesse e per lo smistamento mediante citometria a flusso. L'analisi di campioni di tessuto cerebrale fresco e congelato rivela la presenza di piccole popolazioni omogenee di cellule neuronali con dimensioni e granularità simili.

Le piccole popolazioni omogenee possono essere gated per escludere qualsiasi aggregato cellulare e i neuroni possono essere identificati dalla loro positività NeuN e DAPI. Sia nei campioni di tessuto fresco che in quelli congelati, i livelli di mRNA di NeuN sono significativamente maggiori nelle popolazioni NeuN-positive rispetto alle popolazioni NeuN-negative. Al contrario, i livelli di mRNA del marcatore delle cellule gliali e olidogodendrocitarie sono maggiori nella popolazione NeuN-negativa rispetto alla popolazione NeuN-positiva.

Una tendenza simile a livelli più elevati di mRNA del marcatore delle cellule microgiali è osservata nella popolazione NeuN-negativa, sebbene ciò non fosse statisticamente significativo. Inoltre, i livelli di mRNA di Fos sono maggiori nei neuroni fos-positivi che nei neuroni fos-negativi, con un aumento di tre volte dell'mRNA di Fos nei neuroni fos-positivi da tessuto fresco e un aumento di undici volte dell'mRNA di Fos nei neuroni fos-positivi da tessuto congelato, confermando la validità del metodo per identificare geni specifici di interesse da cellule selezionate a flusso sia in condizioni di tessuto fresco che congelato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di seguire i passaggi critici di prevenzione della lisi cellulare.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, per isolare i sottoinsiemi cellulari di interesse per ulteriori analisi molecolari a valle. L'uso di tessuti congelati consente di smistare i campioni in giorni separati, il che è fondamentale per gli esperimenti che comportano procedure di raccolta e preparazione dei tessuti lunghe e complicate. Questa tecnica può essere utilizzata anche per preparare campioni di cervello umano congelato post mortem, conservati per diversi mesi o anni, per lo smistamento mediante citometria a flusso.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i meccanismi molecolari alla base del comportamento dei neuroni che esprimono Fos o di altre cellule di tipo selvatico immunomarcate di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come dissociare le cellule dal tessuto cerebrale di ratto fresco o congelato per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza di neuroni o tipi di cellule di interesse.