Name: Affidabile e di alta efficienza di estrazione del rene cellule immunitarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Scopri un metodo affidabile per isolare cellule immunitarie renali con alta efficienza e basso costo rispetto alla digestione con collagenasi. Questa tecnica consente l'analisi mediante citometria a flusso multicolore per studiare le funzioni immunitarie nel rene.

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Questo lavoro è supportato da una sovvenzione di ricerca da Dialysis Clinics Inc. e dalla sovvenzione del consiglio di ricerca dell'Università del Missouri.

Tutte le fasi del protocollo eseguiti sono stati esaminati e approvati dalla University of Missouri cura degli animali e del Comitato uso (ACUC). Per questo protocollo, maschi C57BL / 6 topi di età compresa tra 15 settimane sono stati utilizzati anche se teoricamente qualsiasi roditore a qualsiasi età può essere utilizzato per gli esperimenti. Poiché questo è un intervento chirurgico non-sopravvivenza, l&#39;eutanasia si ottiene dissanguamento e pneumotorace bilaterale. 1. perfusione dei reni Nota: perfusione di organi come cuore, fegato e reni di rimuovere il sangue, che possono interferire con l&#39;interpretazione dei dati. Quindi, se possibile, abbiamo sempre perfusione degli organi. <ol><li> Posizionare il mouse in un isoflurano (3 ml / min) camera di induzione fino a che è immobile. Quindi, rimuovere il mouse fuori della camera, si trovava dorsalmente sul tavolo anatomico e posizionare il cono isoflurano sul naso mouse e spingere isoflurano alla velocità di 1,5 ml / min attraverso il regolatore. </li><li> Controllare i respons punta pinche con una pinzetta per valutare se l&#39;animale ha raggiunto un aereo chirurgico di anestesia. Pulire la parte ventrale con soluzione salina e tagliare aprire l&#39;addome con le forbici e spingere gli organi addominali (fuori del campo chirurgico) al lato sinistro del mouse. </li><li> Prelevare il sangue dalla vena cava inferiore con una calibro 25 ago fissato ad una siringa da 1 cc e aggiungerlo a una provetta da 1,5 ml contenente 10 ml di 0,5 M EDTA. Nota: raccolta di sangue è opzionale. Il plasma può essere utilizzato per misurazioni biochimiche. I leucociti possono essere utilizzati per le prove citometria di flusso. </li><li> Utilizzando le forbici, fare un piccolo taglio negli atri giuste per far uscire la miscela di sangue e PBS dal passo successivo. </li><li> Prendere una siringa da 50 cc e riempire con ghiacciata PBS (20-30 cc). Quindi, fissare un ago G 21-25 alla siringa, forare il ventricolo sinistro al suo apice (tenendo delicatamente cuore tra il forcipe) e profumato lentamente il ventricolo sinistro con tampone fosfato pH 7,4 (PBS) nel corsodi 1-2 min. Nota: Il cuore blanches immediatamente dopo i primi millilitri di perfusione. Osservare il fegato per scottare, in quanto questo indica che la perfusione sta prosciugando il sangue dal fegato attraverso ritorno venoso attraverso la vena cava. Inoltre, assicurarsi che i polmoni non sono in espansione durante l&#39;infusione, come indica la puntura del ventricolo destro. Se i polmoni erano per espandere, estrarre l&#39;ago leggermente indietro nel ventricolo sinistro e continuare la perfusione. Il tempo impiegato dalla prima incisione fino eutanasia viene raggiunto è inferiore a 2 min </li></ol> 2. La dissezione di reni <ol><li> Dopo la perfusione è completa, usare le forbici e pinze per sezionare il rene destro dai suoi allegati (i vasi sanguigni, grassi e dalle ghiandole surrenali) e accise. </li><li> Rimuovere delicatamente la capsula che copre il rene tagliando e sezionando con una pinza. Pesare il rene. Nota: Pesatura il rene è opzionale. Tuttavia, alcuni esperimentipuò provocare cambiamenti nella dimensione / peso che può essere utilizzato per normalizzare quantità di cellule per grammo di tessuto renale. </li><li> Dopo aver soppesato il rene, metterlo in 1 ml di RPMI-1640 contenente 0,5% FBS o citometria a flusso soluzione tampone colorazione (50 ml vite conica tubo cap) e posizionare il tubo in ghiaccio fino a un ulteriore uso. Nota: Per comodità di descrizione, si descriverà il resto l&#39;isolamento delle cellule immunitarie nella citometria a flusso soluzione tampone colorazione. Inoltre, descriveremo isolamento delle cellule immunitarie di singolo rene, anche se entrambi i reni o 1 + 1/3 ° dei reni possono essere utilizzate a seconda delle esperimenti a valle (opzionale). 1/3 del rene potrebbe essere congelato per proteine ​​esperimenti / RNA e 1/3 può essere collocato in buffer per la microscopia immunoistochimica o trasmissione di elettroni. </li></ol> 3. omogeneizzazione dei reni <ol><li> Etichettare un sacchetto capacità di omogeneizzazione 5-80 ml con informazioni di identificazione del campione,rimuovere il filtro interno (STR) e gettarlo. Riempire la borsa con 5 ml di soluzione ghiacciata Citometria a flusso di colorazione tampone e trasferire rene al buffer. Ripetere questa procedura per un secondo campione o più campioni che necessitano di trattamento. </li><li> Piegare il sacchetto omogeneizzazione a metà, in modo tale che una metà ha rene immerso nella soluzione citometria a flusso Staining Buffer e l&#39;altra metà è semplicemente ripiegato su di esso. </li><li> Accendere l&#39;omogeneizzatore tessuti e impostarlo su veloce (impostazione) rpm. Posizionare il sacchetto omogeneizzazione piegata con il rene fronte alla pala, in prossimità del bordo inferiore ma verificare che l&#39;estremità inferiore dei sacchi non sono scorrevoli sotto del bordo inferiore delle pale. <ol><li> Elaborare il secondo campione simultaneamente come ci sono 2 pale. Selezionare il tempo come 120 sec. Osservare le pale si muovono avanti e indietro per omogeneizzare i reni. Nota: Nel frattempo, questo tempo di inattività può essere utilizzato per preparare più 2 di rene (o di altri tessuti) campioni, mentre i primi due sono l&#39;elaborazione. </li></ol&gt; </li><li> Dopo aver completato con la prima serie di omogeneizzazione, trasferire i sacchi in ghiaccio e ricaricare l&#39;omogeneizzatore tessuto con il successivo gruppo di campioni, e così via. Visivamente in modo che i reni sono adeguatamente omogeneizzato e non pezzi di grandi dimensioni sono visibili. Nota: In generale, 2 min in omogeneizzatore tessuto a regime veloce è sufficiente per il rene. </li><li> Posizionare un colino cella di 100 micron in tubo da 50 ml su ghiaccio. Successivamente, pipetta la omogenato completamente al colino cella. Impostare una centrifuga pavimento a 50 xg per 1 min a 4 ° C e caricare i campioni nella centrifuga. Nota: La centrifugazione farà in modo che tutti i omogenato (contenenti cellule) è passato attraverso il filtro delle cellule. </li><li> Rimuovere i tubi dalla centrifuga e metterli di nuovo sul ghiaccio. Eliminare i filtri delle cellule e mantenere l&#39;omogeneizzato. Aggiungere volume uguale (~ 6 ml) di tampone di lisi 1x RBC al pellet / surnatante e pipetta su e giù diverse volte per fare una sospensione cellulare uniforme. Visually, osservare alcuni del colore rosso nella diminuzione della sospensione immediatamente. Lasciare i tubi in ghiaccio per 5 minuti per ottenere la massima lisi RBC. Nota: la fase di lisi RBC può essere saltato se il ricercatore è convinto della perfusione renale e meno manipolazione cellulare si desidera. Abbiamo osservato un significativo aumento della resa delle cellule renali non assoggettando la sospensione cellulare RBC lisi. </li><li> Spin le provette nella centrifuga che è stata impostata a 500 xg, a 4 ° C per 5 minuti per formare un pellet di cellule. Nota: Durante le fasi 3.6 e 3.7, prepararsi per silice colloidale (Percoll) basato gradiente di densità centrifugazione. <ol><li> Prendere 10 ml tondi tubi di polipropilene fondo e li etichetta con il numero di campioni corrispondenti e metterli in un rack tubo. Nota: La seguente descrive come rendere abbastanza reagenti gradiente di densità per i 4 campioni renali. </li><li> Prendere 7 ml di soluzione di Citometria a flusso di colorazione tampone e pipetta in un tubo da 15 ml. Aggiungere 1 ml di 2 M saccarosiopreparare 0,25 M di saccarosio. </li><li> Avanti, prendere 7,2 ml di reagente gradiente di densità e pipetta in un altro tubo da 15 ml. Aggiungere 1,55 ml di soluzione di Citometria a flusso di colorazione tampone e 1,25 ml di 2 M di saccarosio per preparare 72% del reagente gradiente di densità e 0,25 M di saccarosio. </li><li> Pipettare 1 ml di 72% di reagente gradiente di densità in un unico turno tubo di polipropilene fondo per ogni campione. </li></ol></li></ol> 4. centrifugazione in gradiente <ol><li> Dopo il punto 3.7, prendere i tubi fuori e delicatamente decantare il surnatante in un unico movimento fluido e anche decantare il prossimo goccia di liquido che si forma mentre il tubo viene tenuto a testa in giù. Nota: questo passaggio è importante poiché lasciando dietro di liquido in eccesso può cambiare il gradiente di densità sufficiente a creare variazioni dei rendimenti. Quando il tubo viene arretrato in posizione verticale, ~ 200-300 microlitri di liquido rimane con il pellet di cellule. </li><li> Pipettare 1 ml di 0,25 M di saccarosio sul pellet e delicatamente ma vigorosamente a pipetta su e giù per Bring le cellule ad una sospensione uniforme. Successivamente, aggiungere la sospensione cellulare a 1 ml 72% di reagente gradiente di densità (3.7.4) e ancora una volta pipettare energicamente per miscelare le cellule a formare un reagente gradiente di densità 36%. </li><li> Prendere 1 ml del reagente gradiente di densità 72% in un Pasteur (trasferimento) pipetta polipropilene. Con una pressione sul bulbo (mantiene la colonna di liquido nella punta e previene la formazione di bolle), inserire la pipetta Pasteur al fondo della sospensione cellulare (36% reagente gradiente di densità) delicatamente e scaricare il reagente gradiente di densità 72% per formare un distinta strato più pesante. </li><li> Raccogliere i tubi campione delicatamente e inserire nella centrifuga, che è a temperatura ambiente per questo passaggio. Spin per 20-30 minuti a 500 x g. </li><li> Nel frattempo, preparare un altro due serie di polipropilene rotondo provette da centrifuga inferiori con gli identificatori di esempio corrispondenti. </li><li> Dopo il punto 4.4, rimuovere il campione contenente tubi di polipropilene con delicatezza, con un minimo di agitazione e metterlo giùsul portaprovette. </li><li> Sollevare il primo tubo campione e il suo tubo vuoto corrispondente. Con una pipetta Pasteur in polipropilene, delicatamente ma accuratamente con aspirazione misurata, rimuovere il &quot;livello spazzatura&quot; superiore o &quot;materiale appiccicoso&quot; e metterlo nel tubo fondo centrifuga rotondo vuoto. <ol><li> Procedere rimuovendo la parte superiore del gradiente fino alla &quot;buffy coat&quot; viene raggiunto (potrebbe apparire off-bianco con una sfumatura rossastra [globuli rossi]). Arrestare l&#39;aspirazione se un&#39;altezza di ~ 3 mm, è raggiungibile dalla &quot;buffy coat&quot;. Nota: Assicurarsi che questa roba è completamente sparito dalla parte superiore della sfumatura prima di continuare a aspirazione. </li></ol></li><li> Prendere una pipetta Pasteur fresco e un tubo tondo fondo centrifuga fresca e rimuovere delicatamente il buffy coat. Continuare ad aspirazione 3 - 5 mm al di sotto del buffy coat, al fine di garantire che la maggior parte delle cellule sono raccolti e aggiunti al tubo 2 ° nuovo fondo tondo con identificativo campione adeguato. </li><li> Aggiungere 1-2 ml osoluzione f Citometria a flusso di colorazione tampone al tubo 2 ° e mescolare accuratamente pipettando su e giù. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Una fase di lavaggio 2 ° con la soluzione tampone di Citometria a flusso di colorazione è opzionale. Risospendere in 500 ml di soluzione di Citometria a flusso di colorazione tampone e procedere per contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li></ol> 5. Opzionale (Cell etichettatura) <ol><li> Aliqout ogni campione per lo stesso numero di celle. Aggiungere l&#39;anticorpo bloccante alla diluizione di 0,5 g per 10 6 cellule (anti CD16 / CD32 FcR) e incubare su ghiaccio per 15 min. </li><li> Aggiungere il cocktail desiderato di anticorpi primari (coniugati con fluorofori appropriate) che sono determinati a lavorare bene con l&#39;altro dallo sperimentatore, prima degli esperimenti attuali. Incubare in ghiaccio per 30 min. Lavare le cellule con PBS. Nota: Per la dimostrazione del rene etichettatura delle cellule immunitarie per questo manoscritto, abbiamo utilizzato una T-lymphocyte e un pannello a celle macrofagi / dendritiche. Il pannello di linfociti T consisteva fissabile vitalità Stain FVS510, anti-CD45 (clone: ​​30-F11) BV421, anti-Foxp3 (Clone: ​​FJK-16s) APC, anti-CD127 (Clone: ​​A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (clone: ​​IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (Clone: ​​RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Clone: ​​53-6,7) BV785. Il pannello era costituito da macrofagi fissabile vitalità Stain FVS510, anti-CD45 (clone: ​​30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Clone: ​​1A8) FITC, anti-CD11b (Clone: ​​M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- APC, anti-CD11c (Clone: ​​N418): / 80 (BM8 Clone) F4 BV785. </li><li> Aggiungere il fissabile Viabilità Stain e lasciare sul banco per 5 min. Lavare le cellule con una soluzione di Citometria a flusso di colorazione tampone per rimuovere l&#39;eccesso del fissabile Viabilità Stain. </li><li> Aggiungere Fixation / reagenti permeabilizzazione ed incubare una notte a 4 ° C. Lavare in soluzione permeabilizzazione. </li><li> Per macchia intracellulare, bloccare di nuovo con l&#39;anti-CD16 / 32 FcR per 10 minuti. Aggiungere le macchie intracellulari e incubare per 20-30 minuti. Lavare 2x in PEsoluzione rmeabilization. </li><li> Risospendere in campioni di soluzioni ed eseguire Citometria a flusso di colorazione buffer tramite FACS macchina 3,9. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo presentato qui un metodo per ottenere cellule immunitarie dal rene in modo affidabile ed efficiente. La modifica principale al passaggio digestione collagenasi ampiamente utilizzato (rottura meccanica del tessuto) risparmiare circa 30 min e l&#39;isolamento di un gran numero di cellule immunitarie vitali richiede meno di due ore per 4 campioni renali. Inoltre, a seconda della nostra domanda di ricerca, ora usiamo un solo rene (l&#39;altro rene può essere utilizzato per l&#39;analisi delle proteine ​​da Western b...

Attivazione del sistema immunitario si verifica in molteplici malattie renali e processi fisiopatologici 6,10,11,13. Potenziali aree di ricerca attiva comprendono vari inneschi per l&#39;attivazione del sistema immunitario, vari tipi cellulari coinvolti, il pattern di citochine / chemochine in una particolare impostazione di malattia, la modulazione di tutti i processi sopra menzionati un particolare farmaco ecc Per esemplificare, in ischemia-riperfusione lesioni (un modello di danno renale acuto), vi è un aumento delle cellule immuni o di midollo osseo derivate cellule ematopoietiche o cellule CD45 + in poche ore, che è sostenuto attraverso il periodo di riparazione o fibrosi (6 settimane dopo) 5, 12. Queste cellule immunitarie secernono entrambe le citochine e chemochine pro-infiammatorie e anti-infiammatori per orchestrare il processo di riparazione 5,12. Attualmente, la possibilità di utilizzare più fluorofori contemporaneamente etichettare popolazioni di cellule in una sospensione singola cella è aumentata con l&#39;annunciosfiato di flusso moderna citometria a macchine con quattro o cinque laser. Ciò ha sostanzialmente aggiunto alla capacità di discriminare le popolazioni cellulari in base al loro stato funzionale 3,7. Ad esempio, per etichettare con precisione un macrofago come F4 / 80 basso alto alto CD206 CD11b Ly6b basso, almeno altre 3 fluorofori sarebbe necessaria nello stesso volume del campione alla porta per le cellule vive, CD45 + (leucociti) e Ly6G- (neutrofili) e questo è molto possibile con il più recente flusso Citometri 3. Tuttavia, i saggi a valle per la secrezione di citochine, proliferazione cellulare, citotossicità, attivazione dei macrofagi e la quantificazione del numero di vari sottoinsiemi di linfociti e monociti non ha bisogno solo di buona qualità (cellule vive, canottiere) ma un numero adeguato di cellule. Il sistema immunitario nel rene è costituito da due componenti adattivi e innate e più tipi di cellule 1,7,13. Ad esempio, nei topi due kidneys insieme sono segnalati per contenere 2-17% (28,000-266,000) CD45 + cellule delle cellule immunitarie renali totale isolate (1,4 x 10 6 cellule) e circa il 5-15% (1,400-4,200) di queste sono cellule CD4 + 1 , 5,12. Una piccola percentuale (5-15%, 70-630) di queste cellule CD4 + sono FOXP3 cellule + (Figura 1) 1. A causa di queste passo saggio riduzioni percentuali di cellule, a volte la popolazione di cellule (in questo caso CD45 + CD4 + FoxP3 + cellule) è rappresentato da una semplice ~ 100 cellule. Il piccolo numero di FOXP3 cellule CD45 + CD4 + + rende imperativo che un gran numero di cellule totali sono isolati e le cellule sono di buona qualità per gli studi a valle, come test di secrezione di citochine. Inoltre, può essere necessario combinare reni da 2-3 topi poiché le sottopopolazioni non sono rappresentati in numero sufficientemente elevate per eseguire saggi quantificabili. Pertanto, l&#39;isolamento affidabile ed efficiente di popolazioni di cellule mononucleate rene è auspicabile per vite prigionieray lo spettro immunologica associata a malattie renali. Tradizionalmente, per l&#39;isolamento delle cellule mononucleari del rene, i ricercatori hanno utilizzato una varietà di digestioni enzimatiche quali 1A collagenasi o II compreso DNasi 1 1,5,12. È ben noto che collagenasi hanno attività enzimatica che varia con numeri di lotto e per società di produzione, che richiede la titolazione per la concentrazione ottimale e durata dell&#39;incubazione 4,14,15. Inoltre, la digestione con collagenasi aggiunge tempo per tritare il rene in piccoli pezzi, necessita incubazione dei pezzi rene in un bagno riscaldato (37 ° C) ed il tempo supplementare per incubazione in EDTA per fermare la reazione. Inoltre, meno sterilità può essere ottenuto ad alcune procedure valle necessitano coltura cellulare. Ancora più importante, a seconda del ricercatore e tutte le variabili coinvolte, porta alla variabilità dei dati e l&#39;interpretazione di tutti i laboratori. Recentemente, con lasviluppo di meccanici tessuto Disgregatori / omogeneizzatori 16, la fase di collagenasi digestione viene completamente evitato e sostituito da un semplice distruzione meccanica dei reni 2. Qui, dimostriamo un metodo semplice ma efficace per l&#39;isolamento delle cellule immunitarie di rene per tutti i giorni estrazioni cellule immunitarie. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattato ad altri tessuti molli e non fibrose come il fegato e il cervello 16.

<table><tbody><tr><td>Stomacher 80 Biomaster sistema di laboratorio</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 sacche classiche</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>O attrezzatura equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Emocitometro Microscopia</td><td>elettronica Scienze</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso analitico</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polipropilene, senza tappo</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>FVS510,&nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (clone: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&nbsp; BV421&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LY6G (Clone: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11C (Clone: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtro&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubi 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>O attrezzatura equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubi 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>O attrezzatura equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher chimico</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento punta fine</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>O attrezzatura equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione tampone per colorazione per citometria a flusso</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>O apparecchiatura equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>1x tampone di lisi RBC</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>o attrezzatura equivalente&nbsp;</td></tr></tbody></table>

affidabile e di alta efficienza di estrazione del rene cellule immunitarie



Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

L'attivazione del sistema immunitario avviene in molteplici malattie renali e processi fisiopatologici. Il sistema immunitario è costituito da componenti adattativi e innati e da più tipi di cellule. A volte, il tipo di cellula di interesse è presente in numero molto basso tra il gran numero di cellule totali isolate dal rene. Pertanto, l'isolamento affidabile ed efficiente delle popolazioni di cellule mononucleate renali è importante per studiare i problemi immunologici associati alle malattie renali. Tradizionalmente, l'isolamento tissutale delle cellule mononucleate renali è stato eseguito tramite digestioni enzimatiche utilizzando diverse varietà e forze di collagenasi/DNAsi, producendo un numero variabile di cellule immunitarie vitali. Recentemente, con lo sviluppo degli interferenti tissutali meccanici per l'isolamento di singole cellule, la fase di digestione della collagenasi è stata evitata e sostituita da una semplice interruzione meccanica dei reni dopo l'estrazione dal topo. In questo articolo, dimostriamo un metodo semplice ma efficace per l'isolamento di cellule mononucleate renali per l'estrazione quotidiana di cellule immunitarie. Dimostriamo inoltre un esempio di analisi di sottogruppi di cellule immunitarie nel rene. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattata ad altri tessuti molli e non fibrosi come il fegato e il cervello.

Il numero di pannelli che possono essere eseguiti dipende dal numero di cellule immunitarie che possono essere estratti in modo affidabile dai reni. Qui, dimostriamo la capacità di eseguire 2 pannelli, uno per i linfociti T e uno per i macrofagi / cellule dendritiche. Sul pannello dei linfociti T, dobbiamo prima guardare al forward scatter (FSC) e side scatter modello (SSC) e delineare la popolazione di interesse come mostrato in Figura 1 (dot plot in alto a sinistra). Q...

Per le applicazioni a valle sono necessarie tecniche affidabili ed efficienti per l'isolamento delle cellule immunitarie renali. Ciò richiede la marcatura degli anticorpi di superficie di un piccolo numero di cellule immunitarie renali. Qui, descriviamo un metodo conciso per l'isolamento delle cellule immunitarie renali che sembra raggiungere questo obiettivo.

Affidabile e di alta efficienza di estrazione del rene cellule immunitarie

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di isolamento delle cellule immunitarie renali è ottenere sospensioni cellulari singole vitali di cellule immunitarie renali in numero sufficiente per analisi successive mediante citometria a flusso multicolore. Il principale vantaggio di questa tecnica, rispetto alla digestione con collaghenasi, è la capacità di isolare in modo affidabile ed economico un elevato numero di cellule immunitarie renali per analisi sperimentali successive. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunobiologia renale.Ad esempio, quale sottoinsieme di cellule immunitarie renali regola la secrezione di citochine o chemochine in una specifica malattia renale. Questo metodo viene illustrato per l'isolamento delle cellule immunitarie dal rene. Tuttavia, può essere facilmente adattato per isolare le cellule da altri sistemi, come fegato o cervello.Oggi dimostreremo una procedura per il prelievo di cellule immunitarie renali. La procedura sarà illustrata da Alex Meuth, specialista della mia unità di ricerca. Dopo aver verificato l'assenza di risposta alla pressione sulle dita dei piedi, utilizzare etanolo al 70% per pulire l'addome ventrale di un topo anestetizzato.Quindi, utilizzare le forbici per aprire la cavità addominale ed esporre gli organi addominali sul lato sinistro dell'animale. Utilizzando una siringa da 1 cc dotata di un ago curvo da 25 gauge, raccogliere il sangue dalla vena cava inferiore in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente 10 microlitri di EDTA potassico. Successivamente, praticare un piccolo taglio nell'atrio destro ed usare una pinzetta per afferrare delicatamente il cuore.Quindi, inserire un ago da 21 a 25 gauge collegato a una siringa da 50 cc riempita con 20-30 millilitri di PBS ghiacciato nel ventricolo sinistro al suo apice, e procedere alla perfusione lenta del ventricolo per uno o due minuti. Il cuore diventerà pallido dopo i primi millilitri di PBS. L’imbiancamento del fegato indica che il sangue sta venendo espulso attraverso il fegato tramite il ritorno venoso attraverso la vena cava.Al termine della perfusione, utilizzare forbici e pinze per dissezionare il rene destro dai vasi sanguigni, dal tessuto adiposo e dalle ghiandole surrenali a cui è attaccato. Successivamente, rimuovere delicatamente la capsula renale con le pinze e pesare il rene secondo le esigenze sperimentali. Quindi, trasferire il rene in un tubo conico da 50 millilitri contenente un millilitro di buffer per citometria a flusso posto sul ghiaccio.Etichettare un sacchetto di omogeneizzazione con capacità da cinque a 80 millilitri con le informazioni di identificazione del campione appropriate e scartare il filtro interno. Riempire il sacchetto con cinque millilitri di tampone di marcatura per citometria a flusso freddo su ghiaccio e inserire il rene nel sacchetto. Piegare il sacchetto di omogeneizzazione a metà, in modo che una metà contenga il rene immerso nel tampone e l’altra metà sia ripiegata sopra.Posizionare il sacchetto per l'omogeneizzazione piegato con il rene rivolto verso la pala, vicino al bordo inferiore, avendo cura che l'estremit&agrave; inferiore del sacchetto non scivoli al di sotto del bordo inferiore delle pale. Quindi, verificare visivamente che i reni siano adeguatamente omogeneizzati e che non siano visibili pezzi di grandi dimensioni. Se i reni non sono sufficientemente frantumati dall'apparecchio, avvicinare le pale alla parete dell'omogeneizzatore.Quindi, posizionare un filtro cellulare da 100 micron in un tubo conico da 50 millilitri per campione su ghiaccio e filtrare completamente gli omogenati attraverso i filtri. Una volta che tutti i campioni sono stati dissociati, centrifugare i tubi con i filtri per assicurare un completo filtraggio dei tessuti, quindi rimettere i tubi sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere a ciascun campione un volume equivalente di buffer per la lisi dei globuli rossi e pipettare su e giù diverse volte per ottenere sospensioni cellulari uniformi.Dopo cinque minuti, centrifugare per formare il pellet cellulare e rimuovere con attenzione il soprannatante da ogni provetta con un unico movimento fluido, versando anche l'ultima goccia di liquido che si forma mentre ogni provetta è ancora capovolta. Per isolare le cellule immunitarie renali, aggiungere un millilitro di reagente per gradiente di densità al 72% in una provetta con fondo rotondo in polipropilene per ogni campione. Successivamente, triturare delicatamente ma energeticamente un millilitro di saccarosio 0,25 molare in ciascun pellet per ottenere sospensioni cellulari singole, quindi aggiungere le cellule alle soluzioni di gradiente di densità.Quindi, stratificare delicatamente un millilitro di reagente per gradiente di densità al 72% sotto ciascuna sospensione cellulare per formare strati pesanti distinti. Verificare che le cellule renali siano sospese in modo uniforme nel gradiente al 36% di Percoll in ogni provetta. Successivamente, stratificare con attenzione il Percoll al 72% al di sotto di quello al 36% per formare strati distinti al 36% e al 72%.Posizionare con attenzione i tubi nella centrifuga per la separazione tramite gradiente di densità. Successivamente, utilizzare una pipetta Pasteur in polipropilene per trasferire delicatamente ma completamente tutti gli strati superiori di detriti, tranne circa gli ultimi tre millimetri, in tubi centrifuga sferici vuoti individuali. A questo punto, utilizzare una pipetta Pasteur nuova per trasferire delicatamente i buffy coat in nuovi tubi centrifuga sferici, fino a quando non sono stati rimossi tre-cinque millimetri al di sotto del buffy coat, assicurandosi così di aver raccolto la maggior parte delle cellule da ciascun campione.Quindi, aggiungere uno-due millilitri di buffer per la colorazione in citometria a flusso nei buffy coat ed eseguire la centrifugazione delle cellule. Sospendere i pellet in 500 microlitri di buffer per la colorazione in citometria a flusso per il conteggio ed dividere uniformemente i campioni in una piastra a 96 pozzetti, rotonda e al buio. Incubare i campioni con l'anticorpo bloccante per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi, preparare un cocktail di anticorpi per ogni tipo di cellula immunitaria da testare. Ad esempio, linfociti, macrofagi e cellule dendritiche, e incubare le cellule nel rispettivo cocktail di anticorpi per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver selezionato la popolazione di interesse mediante diffusione anteriore e laterale, escludere le cellule non vitali.Da due all'18% delle cellule immunitarie totali del rene esprime tipicamente CD45. Per isolare le cellule T effettrici e citotossiche, ad esempio, queste cellule ematopoietiche di origine midollare possono essere quindi selezionate in base a CD4 e CD8 rispettivamente. Un'ulteriore caratterizzazione delle cellule positive per CD4 rivela una popolazione di circa otto-quattordici per cento di cellule T regolatorie positive per FoxP3, che possono essere suddivise in popolazioni che esprimono CD44 e CD127.Per valutare il pannello delle cellule mieloidi, le cellule positive per CD45 possono essere selezionate in base all'espressione di Ly6G per escludere inizialmente i neutrofili. CD11b e F4/80 possono quindi essere utilizzati per suddividere ulteriormente le cellule positive per Ly6C nelle popolazioni di macrofagi infiltranti e di cellule dendritiche. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in uno o due ore.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire esperimenti successivi, come l'isolamento di cellule positive per CD11b o CD4, per rispondere a domande relative alla secrezione di citochine da parte di questo specifico sottoinsieme di cellule. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come perfondere i reni, generare una sospensione di cellule renali vitali, isolare le cellule immunitarie renali mediante centrifugazione su gradiente di densità ed etichettare le cellule renali per l'analisi mediante citometria a flusso.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo video, descriviamo la procedura per l'estrazione del rene dallo spazio retroperitoneale del topo. Il rene estratto può essere ulteriormente sezionato per ottenere un rene intatto senza capsula renale e lo strato di grasso circostante.

Estrazione di rene intatto dal topo: una tecnica per ottenere rene senza capsula renale da modelli murini

Cellule DNabT sono rari tra cellule T periferiche; tuttavia, sono abbondanti in alcuni tessuti non linfoidi. Difficoltà di isolare le cellule T DN dal tessuto linfoide non ostacola la loro analisi funzionale, nonostante l'aumento riconosciuto significato fisiopatologico. Descriviamo un nuovo protocollo per l'isolamento di cellule altamente purificate DN T di rene murino.

Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene

Questo protocollo descrive la decellularizzazione dei reni di ratto Sprague Dawley mediante perfusione anterograda di detergenti attraverso il sistema vascolare, producendo matrici extracellulari renali acellulari che fungono da modelli per il ripopolamento con cellule epiteliali renali umane. La ricellularizzazione e l'uso del saggio di perfusione della resazurina per monitorare la crescita vengono eseguiti all'interno di bioreattori di perfusione appositamente progettati.

Ripopolamento cellule epiteliali e preparazione di roditori matrice extracellulare Ponteggi per lo sviluppo del tessuto renale

Qui presentiamo un metodo di isolamento e coltura di romanzo grado clinico per rene perivascolare di cellule stromali (kPSCs) basato sulla perfusione d'organo intero con gli enzimi digestivi e arricchimento NG2-cella. Con questo metodo, è possibile acquisire il numero di celle sufficiente per una terapia cellulare.

Un metodo di isolamento di romanzo Clinical Grade per rene umano perivascolari cellule stromali

L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di isolare in modo efficiente culture vitale primaria glomeruli con contaminanti minimale per l'uso in una varietà di applicazioni a valle. Glomeruli isolati mantengono relazioni strutturali tra tipi di componenti delle cellule e possono essere coltivate ex vivo per un breve periodo.

Un metodo efficiente di setacciatura per isolare i Glomeruli intatti dal rene di ratto adulto.

La combinazione di etichettatura anticorpale, compensazione ottica e microscopia luminosa avanzata consente l'analisi tridimensionale di strutture o organi completi. Descritto qui è un metodo semplice per combinare l'etichettatura di fette renali spesse, la compensazione ottica con il cinnamate etilico e l'imaging confocale che consente la visualizzazione e la quantificazione delle strutture renali tridimensionali.

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

I microRNA sono coinvolti nella patogenesi della nefropatia da IgA. Abbiamo sviluppato un metodo affidabile per rilevare i livelli di espressione di microRNA nei reni di un modello murino di nefropatia IgA (topi HIGA). Questo nuovo metodo faciliterà il coinvolgimento dei miRNA nella nefropatia da IgA.

Rilevazione dell'espressione di microRNA nei reni di topi nefropatici con immunoglobuline A

A seguito di infezione virale, il rene ospita un numero relativamente elevato di cellule CD8+ T e offre l'opportunità di studiare le cellule T RM nonmucose. Qui descriviamo un protocollo per isolare i linfociti renali del topo per l'analisi della citometria del flusso.

Isolamento delle cellule CD8 + T residenti neireni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Qui, presentiamo un protocollo per isolare nuclei di alta qualità da reni di topo congelati che migliorano la rappresentazione dei tipi di cellule renali midollari ed evitano gli artefatti di espressione genica dalla dissociazione enzimatica del tessuto.

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

Qui si riporta un protocollo per l'ablazione selettiva dei macrofagi renali per studiarne la rigenerazione utilizzando lo strumento di ablazione cellulare umana CD59/intermedisina. Questo metodo è applicabile anche per studiare la funzione e la rigenerazione delle altre popolazioni cellulari nei reni, nel fegato e nel tessuto adiposo.

Deplezione rapida dei macrofagi renali utilizzando lo strumento di ablazione cellulare CD59/intermedisina umana

Questo studio ha sviluppato un protocollo ottimizzato per l'isolamento di cellule mesangiali murine (MC) e la loro coltura cellulare ex vivo . Queste cellule possono essere fatte passare più volte, congelate, rianimate e coltivate senza compromettere la crescita cellulare o l'espressione proteica.

Ottimizzazione dell'isolamento e della purificazione delle cellule mesangiali glomerulari murine

Scopri un metodo affidabile per isolare cellule immunitarie renali con alta efficienza e basso costo rispetto alla digestione con collagenasi. Questa tecnica consente l'analisi mediante citometria a flusso multicolore per studiare le funzioni immunitarie nel rene.

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