Ingegneria genetica di un lievito non convenzionale per i biocarburanti rinnovabili e produzione biochimica

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare metodi efficaci di ingegneria genetica per una specie di lievito non convenzionale, inclusa la costruzione del DNA da trasformare, la trasformazione del DNA, la selezione dei trasformanti e l'eliminazione mirata di geni mediante ricombinazione omologa. Abbiamo messo a punto una tecnica altamente efficiente di eliminazione genica nel ceppo Yarrowia lipolytica PO1G, con possibili applicazioni nella produzione di biocarburanti e prodotti biochimici. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'interruzione genica mediata da PCR, è rappresentato dalla disponibilità di elevate quantità di costrutti per l'eliminazione genica e di un'ampia gamma di marcatori selezionabili.

In questo studio, riportiamo il protocollo di trasformazione genetica per il ceppo Yarrowia lipolytica PO1G, che risulta efficiente, semplice, affidabile e riproducibile. Il ceppo di Yarrowia lipolytica PO1G con delezione del gene KU70 costruito in questo studio mostra una frequenza di ricombinazione omologa molto elevata, che permette schermature più rapide e semplici delle delezioni geniche mirate. Il primo passaggio di questa procedura consiste nell'amplificare, mediante PCR, il cassetto espressivo LEU2 da un vettore di espressione di Y. lipolytica e nell'introdurre siti LoxP alle estremità 5-primo e 3-primo del cassetto LEU2.

Un sito di restrizione BamHI viene inoltre introdotto nel primo primer per i passaggi successivi del processo di clonaggio. Dopo la purificazione della cassetta costituita dal promotore LoxP, dal termine LEU2 e dal terminatore LoxP, vengono aggiunti tre sbalzi 3'-A al prodotto PCR purificato. Il prodotto PCR con coda poli-A viene quindi ligato in un vettore di clonaggio TA per ottenere il plasmide T-LEU2.

Il secondo passaggio della PCR consiste nell'amplificare la sequenza a monte di un chilobase del gene KU70 utilizzando i primer tre e quattro sul DNA genomico di Y.lipolytica PO1G. Successivamente, eseguire una doppia digestione del prodotto PCR purificato e del plasmide T-LEU2 con gli enzimi SacII e BamHI, quindi legare il prodotto PCR purificato e digerito ai siti SacII e BamHI del plasmide T-LEU2 per ottenere il plasmide T-LEU2-5E. Il terzo passaggio della PCR consiste nell'amplificare la sequenza a valle di un chilobase del gene KU70 utilizzando i primer cinque e sei sul DNA genomico di Y.lipolytica PO1G.

Quindi, digerire due volte sia il prodotto PCR purificato che il plasmide T-LEU2-53 con gli enzimi NotI e NdeI e legare il prodotto PCR purificato e digerito ai siti NotI e NdeI del T-LEU2-5E per ottenere il plasmide T-KO. Infine, digerire il plasmide T-KO con gli enzimi SacII e NdeI per produrre la cassetta di interruzione. Iniziare questa procedura preparando cellule Y.lipolytica PO1G competenti.

Inoculare una colonia del ceppo Y.lipolytica PO1G da una piastra fresca di estratto di lievito, peptone, destrosio o mezzo YPD in 10 millilitri di mezzo YPD in un matraccio da 100 millilitri. Incubare in un incubatore agitato a 30 gradi Celsius a 225 giri al minuto per 20 ore fino a saturazione. Il giorno successivo, raccogliere le cellule centrifugando per cinque minuti a 5000 × g a temperatura ambiente.

Lavare le cellule con 20 millilitri di tampone TE e ricentrifugare le cellule. Dopo aver rimosso il sopranatante, risospendere le cellule in un millilitro di acetato di litio 0,1 molare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dividere le cellule competenti in aliquote da 100 microlitri in provette sterili da 1,5 millilitro.

Procedere immediatamente con la procedura di trasformazione mescolando delicatamente 10 microlitri di DNA di sperma di salmone denaturato e da uno a cinque microgrammi del cassete di interruzione purificato insieme a 100 microlitri di cellule competenti. Incubare a 30 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere 700 microlitri di polietilene glicole al 40% per 1000.

Mescolare bene e incubare in un incubatore agitato a 30 gradi Celsius a 225 giri al minuto per 60 minuti. Successivamente, riscaldare il campione di trasformazione posizionando il tubo in un bagno d'acqua a 39 gradi Celsius per 60 minuti. Trascorsi 60 minuti, aggiungere un millilitro di mezzo YPD al tubo e lasciare riposare le cellule per due ore a 30 gradi Celsius a 225 giri al minuto.

Centrifugare a 9000 ×g per un minuto a temperatura ambiente. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di tampone TE. Centrifugare nuovamente le cellule e scartare il soprannatante.

Risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone TE e seminare su una piastra priva di leucina. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius per due o tre giorni. Prima di eseguire il recupero del marcatore mediato dalla ricombinasi CRE, il plasmide di espressione della CRE viene costruito come descritto nel protocollo testuale.

Alcune delle caratteristiche di questo plasmide che si replica in modo episomale includono un gene della ricombinasi CRE, un marcatore di resistenza all'igromicina B e un gene di resistenza all'ampicillina. Per iniziare questa procedura, trasformare il plasmide esprimente CRE in cellule competenti della linea knock-out per KU70 seguendo il protocollo di trasformazione mostrato in precedenza. Seminare le cellule trasformate su piastre di YPD aggiunto di igromicina B e incubare a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.

Dopo aver eseguito la PCR su colonie, come descritto nel protocollo testuale per identificare le colonie positive, selezionare una colonia positiva per inoculare due millilitri di mezzo YPDH e incubare in un incubatore agitato a 30 gradi Celsius a 225 giri al minuto durante la notte fino alla saturazione. Il giorno successivo, misurare l'OD 600 della coltura con uno spettrofotometro. Quando le cellule raggiungono un OD 600 di circa 15, raccoglierle mediante centrifugazione a 5000 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere il soprannatante, aggiungere due millilitri di acqua sterile e centrifugare nuovamente. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in mezzo YPD. Reinnestare le cellule in due millilitri di mezzo YPD con un OD iniziale a 600 nm di 0,1 e lasciare crescere le cellule in un incubatore a 30 gradi Celsius a 225 giri al minuto durante la notte.

Il giorno seguente, effettuare lo striato della coltura cellulare notturna su piastre YPD per isolare singole colonie. Incubare a 30 gradi Celsius fino alla comparsa delle colonie. Eseguire il replica plating delle colonie su piastre YPD, YPDH e piastre carenti di leucina.

Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due giorni. Viene mostrato uno schema del plasmide di knockout di KU70. La digestione del plasmide con gli enzimi SacII e NdeI produce la cassetta di interruzione.

L'elettroforesi su gel conferma la presenza di una banda di 4,3 kilobasi, che corrisponde alla dimensione prevista per il cassette di interruzione. La delezione del gene KU70 in Y.lipolytica PO1G è confermata mediante PCR. Le corsie da 1 a 10 contengono prodotti di PCR amplificati dal DNA genomico di ceppi trasformati, mentre la corsia 11 contiene prodotti di PCR ottenuti dal ceppo di tipo selvatico.

La corsia sette illustra un knock-out positivo, mentre la corsia uno mostra un falso positivo. Il gene marcatore di selezione nella ceppa knock-out di KU70 è stato successivamente eliminato mediante l'espressione della ricombinasi CRE. I trasformanti positivi privi di marcatore sono stati verificati in base alla loro crescita su una sola piastra YPD.

Per verificare l'aumento del tasso di delezione genica, dopo l'eliminazione del gene KU70, 11 geni bersaglio sono stati eliminati singolarmente utilizzando la stessa procedura nella ceppa priva di KU70. Ogni interruzione genica è stata confermata mediante PCR e qui viene mostrato un risultato rappresentativo, con le corsie una, due e quattro identificate come knockout positivi. La ceppa di Yarrowia lipolytica PO1G con delezione KU70 Platinum fornisce un sistema più efficiente e una scelta migliore per applicazioni nell'ingegneria di percorsi metabolici e nell'ottimizzazione di ceppi durante la costruzione di altri mutanti con delezione cromosomica.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una comprensione completa della strategia di delezione mirata di un singolo gene mediante ricombinazione omologa nelle cellule yarrowia lipolytica PO1G.