Name: Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il tumore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte da linfociti infiltranti il melanoma umano. Questo metodo avanzato permette di produrre T cellule tumor-specifiche per l'immunoterapia oncologica.

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Ringraziamo la signora Deborah Postiff e la signora Jackline Barikdar del Tissue Procurement Core e la dottoressa Cindy DeLong del Pluripotent Stem Cell Core Laboratory dell'Università del Michigan per la sua assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato dai finanziamenti per l'avvio dell'Università del Michigan e dalle sovvenzioni della Central Surgical Association, dell'American College of Surgeons, della Melanoma Research Alliance e del NIH/NCI (1K08CA197966-01) a F. Ito.

NOTA: I pazienti devono dare il consenso informato a partecipare al Institutional Review Board e pluripotenti umane staminali Comitato cellulare ha approvato lo studio. 1. Isolamento e la coltura di TIL <ol><li> Ottenere materiale tumorale che non è necessario per la diagnosi istopatologica dal nucleo di appalto del servizio di patologia / tessuto. Posizionare 20-100 g di campioni tumorali in una provetta da 50 ml con 30 ml supporti tumorali raccolta (Tabella 1). </li><li> Sezionare solido, fermo, tessuto normale del campione di tumore da aree necrotiche fragili e / o con sangue con le forbici. Dopo aver rimosso il tessuto necrotico, utilizzare le forbici per sminuzzare il campione più piccolo possibile. </li><li> Dissociare il campione tritato in una cella singola sospensione usando un dissociatore e tumore kit di dissociazione (umana) secondo le istruzioni del produttore. Filtrare la sospensione con un colino cella di 70 micron che è impostato su un tubo da 50 ml e lavare il filtro 2 volte con2 ml di RPMI 1640. </li><li> Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 10 ml di mezzi di cellule T (Tabella 1). </li><li> Preparare una soluzione sfumatura a due fasi come Ficoll (soluzione gradiente) in una provetta da 50 ml, con un gradino più basso di 10 ml di soluzione di pendenza 100% ed una fase di mezzo di 30 ml di soluzione di pendenza 75% diluito con fosfati di Dulbecco salina tamponata, senza calcio, senza magnesio (D-PBS (-)). </li><li> Strato di sospensione cellulare (dal punto 1.4) sulla soluzione gradiente (dal punto 1.5). Centrifugare a 400 xg a 20 ° C per 45 min. </li><li> Raccogliere il livello contenente le TIL arricchite all&#39;interfaccia tra la soluzione di pendenza 100% e la soluzione pendenza 75% in una provetta da 50 ml. Diluire il livello della soluzione con i TIL arricchiti aggiungendo 20-30 ml di D-PBS (-). </li><li> Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere la frazione TIL arricchita in 10 mldei mezzi di comunicazione delle cellule T. </li><li> Culture la frazione (dal punto 1.8) con 2 ml di mezzi di cellule T e 6.000 UI / ml ricombinante umana (rh) IL-2 in una piastra da 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Modificare la metà della media su giorno 5 dopo la cultura iniziazione e ogni 2-3 giorni successivi. </li><li> Dividere le celle con un rapporto di 1: 2 senza tripsinizzazione dopo dolcemente sospensione, raddoppiando il numero di pozzetti quando raggiunge 80-90% di confluenza. Aggiungere un volume metà (1 ml) di supporto delle cellule T freschi e rhIL-2 a 6.000 UI / ml. </li></ol> 2. Preparazione di Mitomicina-C-trattati SNL Feeder zolla delle cellule <ol><li> Culture cellule feeder BN in 10 ml di SNL supporti cella alimentatore (Tabella 1) su una gelatina rivestita 10 centimetri piatto 0,1% fino al 80-90% di confluenza (3-4 x 10 6 cellule) viene raggiunto. </li><li> Aggiungere 310 ml di 0,4 mg / ml soluzione mitomicina C direttamente nel piatto di coltura cellulare alimentatore BN e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 ore e 15 min. Aspirare il supporto di unnd lavare le cellule due volte con 5 ml di D-PBS (-). </li><li> Aggiungere 0,5 ml di 0,25% tripsina / 1 mM EDTA e incubare a temperatura ambiente per 1 min per dissociare le cellule. Aggiungere 4,5 ml di mezzi di cellule di alimentazione SNL per neutralizzare e risospendere le cellule in una sospensione singola. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 min. Aspirare media e contare le cellule con un emocitometro dopo la ri-sospensione in 10 ml di SNL mezzi cellule alimentatore. </li><li> Piatto 1,5 x 10 6 cellule per pozzetto di cellule feeder SNL su un piatto 10 cm e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. Utilizzare le cellule di alimentazione SNL entro 3 giorni. </li></ol> 3. Generazione di iPSCs Uso del virus di Sendai (SeV) Vector <ol><li> Raccogliere il TIL (dal punto 1.11) e attivare 5 x 10 5 cellule TIL con il mouse piastriforme vincolato CD3 anti-umano (1 ug / ml) e mouse solubile CD28 anti-umano (5 mg / ml), con rhIL-2 (6.000 UI / ml) in 2 ml di mezzi di cellule T in una piastra da 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 per 5 giorni. </li><li> Raccogliere il TIL (dal punto 3.1) in un tubo da 15 ml con una pipetta e contare il numero di cellule con un emocitometro. </li><li> Riattivare 1 x 10 5 cellule TIL con il mouse piastra-bound CD3 anti-umano (1 ug / ml) e topo solubile anti-human CD28 (5 mg / ml), con rhIL-2 (60 UI / ml) in 500 microlitri di mezzi di riprogrammazione (Tabella 1) per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. Preparare 3 pozzi per l&#39;infezione SeV: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc (1 bene); infezione SeV (GFP: proteina fluorescente verde) (1 bene); e conta delle cellule (1 bene). </li><li> Dopo 24 ore (dal punto 3.3), contare il numero di cellule con un emocitometro e determinare il volume di ogni virus per diversi (3-20) molteplicità di infezione (MOI). Rimuovere una serie di tubi vettore virus Sendai dal -80 ° C di stoccaggio. Scongelare i vettori Sev rapidamente in un bagno d&#39;acqua (37 ° C) e disporli sul ghiaccio. Volume del virus (ml)= MOI (CIU / cella) x numero di cellule / titolo del virus (CIU / ml) × 10-3 (ml / ml) </li><li> Aggiungere i volumi calcolati di ciascuno dei quattro tubi vettore virus Sendai che portavano singolarmente Oct3 / 4, SOX2, Klf4, e c-MYC aggiungendo una miscela di vettori SEV al 10-20 MOI in media, compresa attivato TIL. </li><li> Per determinare l&#39;efficienza di trasduzione, aggiungere i volumi calcolati di SEV-GFP in un pozzo di TIL attivati. </li><li> Collocare la capsula (dal punto 3.5 e punto 3.6) in incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. Dopo 24 ore, valutare l&#39;efficienza di infezione con TIL infettati con SEV-GFP in microscopia a fluorescenza. </li><li> Raccogliere le cellule (dal punto 3.5) in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di mezzi hESC con Primate ES cellulare medio e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml). </li><li> Trasferire la sospensione in un 10 centimetri piatto che CONTAins mitomicina-C-trattata cellule di alimentazione SNL in 10 ml di hESC supporti. Modificare i media hESC a giorni alterni fino a quando le colonie sono cresciuti. </li><li> Intorno al giorno 18 al 21, rimuovere le cellule di alimentazione SNL intorno alle colonie sotto un microscopio con una punta di 10-microlitri nel banco pulito. </li><li> Raschiare le colonie con una punta di 10-microlitri e trasferirli con una punta di 200 microlitri in 100 ml di iPSCs mezzi per pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti. Pipettare su e giù a 2-3 volte di rompere le colonie in piccoli grumi con una dimensione media di 50-100 micron. </li><li> Trasferire i piccoli ciuffi in 6 pozzetti piastre di coltura dei tessuti con cellule di alimentazione SNL mitomicina-C-trattati (dal passaggio 2) in 2 ml per pozzetto di iPSCs supporti con il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml). Cambiare i media iPSCs ogni giorno. </li><li> Trasferire le iPSCs a 6 pozzetti di coltura tissutale con cellule feeder BN mitomicina-C-trattati fresche con 1 mg / ml di collagenasi IV ogni 5-6 giorni. Preparare 2 pozzi per piatti di ogni clone per immunostaining. </li><li> Determinare la completa riprogrammazione di ogni clone dalla colorazione immunoistochimica di marcatori pluripotenza (SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, TRA-1-81, e Oct3 / 4) 1. NOTA: Per ulteriori valutazione del potenziale pluripotenza, confermano che le linee IPSC completamente riprogrammate possono differenziarsi in tre foglietti embrionali da una formazione del corpo embrioide e saggio di differenziazione o di un saggio di formazione teratoma 16. </li><li> Verificare che le linee IPSC completamente riprogrammati dimostrano un cariotipo normale analisi citogenetica. </li><li> Per la formazione teratoma, iniettare una indifferenziata TIL derivato COPSI (1 x 10 6) sospensione in 100 ml di DMEM contenente 10% FCS nel tessuto sottocutaneo di 6-8 settimane topi NOD / SCID vecchi femminili. sezioni teratoma macchia con ematossilina ed eosina. </li></ol> 4. immunofluorescenza colorazione di iPSCs per SSEA3, SSEA4, TRA1-60 e TRA1-81 <ol><li> Lavare iPSCs con 1 ml di PBS e fissare i iPSCs con 1 ml di 4% annuosoluzione raformaldehyde per 10 minuti. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e lavare le iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte. NOTA: Fare attenzione quando si utilizza paraformaldeide perché è tossico. </li><li> Pretrattare le iPSCs con tampone di bloccaggio (Tabella 1) per 30 minuti. Nel frattempo, diluire gli anticorpi primari (ratto anti-umano SSEA3, topo anti-umana SSEA4, topo anti-umano TRA1-60 e mouse TRA1-81 anti-umano) soluzione di capra siero 1:50 in 1,5% diluiti con PBS e TritonX -100 (volume totale: 1 ml). </li><li> Rimuovere il tampone di bloccaggio (Tabella 1). Aggiungere la soluzione diluita anticorpo primario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Nel frattempo, diluire l&#39;anticorpo secondario (IgG anti-topo e IgM o anti-topo IgM) 1:50 in 1,5% soluzione di capra siero. </li><li> Rimuovere la soluzione diluita anticorpo primario e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ciascuno per 5 min. Aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito e incubare per 45 min a temperatura ambiente in una stanza buia. </li&gt; <li> Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario diluito e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Osservare le iPSCs con microscopia a immunofluorescenza. </li></ol> 5. immunofluorescenza colorazione di iPSCs per Oct3 / 4 <ol><li> Lavare iPSCs con 1 ml di PBS e fissare i iPSCs con 1 ml di soluzione di paraformaldeide al 4% per 10 min. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e lavare le iPSCs con PBS 3 volte. </li><li> Aggiungere tampone di permeabilizzazione (Tabella 1) ed incubare a temperatura ambiente per 10 min. Rimuovere il buffer di permeabilizzazione e aggiungere tampone di bloccaggio (Tabella 1). </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 30 min. Nel frattempo, diluire l&#39;anticorpo primario (del mouse Oct3 / 4 anti-umano) 1:50 in tampone di bloccaggio. </li><li> Aggiungere la soluzione diluita anticorpo primario e incubare a 4 ° C durante la notte. </li><li> Rimuovere la soluzione diluita anticorpo primario e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Nel frattempo, dilute l&#39;anticorpo secondario (capra anti-topo IgG / IgM) 1: 100 in tampone di bloccaggio. </li><li> Aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito ed incubare a temperatura ambiente in una stanza buia per 45 min. </li><li> Rimuovere la soluzione secondaria diluita e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Osservare le iPSCs al microscopio immunofluorescenza. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8%28%2B%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Wakao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+functional+human+mucosal-associated+invariant+T+cells+via+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor-infiltrating+lymphocyte+cultures+for+use+in+adoptive+transfer+therapy+for+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients.</a> J Immunother. 26, 332-342 (2003).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+identifies+the+patient-specific+CD8%28%2B%29+tumor-reactive+repertoire+infiltrating+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.</a> J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+Complete+Responses+in+Heavily+Pretreated+Patients+with+Metastatic+Melanoma+Using+T-Cell+Transfer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Melanoma+Tumor-Infiltrating+Lymphocytes+to+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 11(2016).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Fujie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Type+of+Sendai+Virus+Vector+Provides+Transgene-Free+iPS+Cells+Derived+from+Chimpanzee+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood.</a> PLoS One. 9, e113052(2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui, abbiamo dimostrato un protocollo per la riprogrammazione TIL melanoma a iPSCs da trasduzione SEV-mediata dei quattro fattori di trascrizione Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Questo approccio, utilizzando un sistema SeV per riprogrammare cellule T, offre il vantaggio di un metodo non integrare 7. Uno studio precedente ha mostrato che un sistema riprogrammazione SeV era altamente efficiente e affidabile per riprogrammare fibroblasti non solo, ma anche le cellule T del sangue peri...

La tecnologia di riprogrammazione cellulare che permette la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mediante la sovraespressione di un insieme definito di fattori di trascrizione promette grandi sviluppi nel campo delle terapie a base di cellule 1,2. Queste iPSCs presentano caratteristiche trascrizionali ed epigenetici e hanno la capacità di auto-rinnovamento e pluripotenza, analogamente alle cellule staminali embrionali (ESC) 3-5. Notevoli progressi realizzati nella tecnologia di riprogrammazione negli ultimi dieci anni ci ha permesso di generare iPSCs umani anche da cellule terminalmente differenziate, come le cellule T 6-8. IPSCs derivati dalle cellule T (TiPSCs) mantengono la stessa configurazione riarrangiato di recettore delle cellule T (TCR) geni catena come le celle originali T, che permette la rigenerazione delle cellule T antigene-specifiche da TiPSCs 9-11. Quasi l&#39;80% dei linfociti melanoma infiltranti (TIL) ottenuto da tumore di un paziente specificamente riconoscere tumore-antigeni associati aND mantenere la citotossicità contro le cellule tumorali originali 12. In particolare, l&#39;espressione della morte cellulare programmata proteina-1 (PD-1) sul TIL è stato trovato per identificare il repertorio tumore-reattiva autologo, compresi mutato specifico neoantigene CD8 + linfociti 13. Trasferimento adottivo di ex-vivo TIL autologhe espanse in combinazione con regimi lymphodepleting di preparazione e somministrazione sistemica di Interleuchina-2 (IL-2) può causare sostanziale regressione del melanoma metastatico in sottogruppi di pazienti 14. Nonostante gli incoraggianti risultati in modelli preclinici e nei pazienti, scarsa sopravvivenza delle cellule T infuse e l&#39;esistenza di percorsi immunosoppressivi sembrano compromettere il pieno potenziale della terapia con cellule T adottiva. Protocolli clinici attuali richiedono ampie ex vivo manipolazione di cellule T autologhe per ottenere grandi numeri. Il risultato è la generazione di cellule terminalmente differenziate T che hanno scarsa sopravvivenza, ridotto Prolla capacità iferative, e alti livelli di PD-1 15. Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superato utilizzando iPSCs che possono fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l&#39;immunoterapia. Abbiamo recentemente riportato la riprogrammazione del melanoma TIL esprimere alti livelli di PD-1 dal virus di Sendai (SeV) trasduzione mediata dei quattro fattori di trascrizione, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc 16. Mentre vettori retrovirali richiedono l&#39;integrazione in cromosomi di accoglienza per esprimere geni riprogrammazione, vettori Sev sono non-integrazione e sono poi eliminati dal citoplasma. La riprogrammazione efficienza è molto più alto con un sistema SeV rispetto lentivirus o retrovirus vettori 6-8. Inoltre, SeV possono specificatamente riprogrammare le cellule T nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), mentre alcuni cloni IPSC generati da lentivirus o vettori retrovirali possono essere da lignaggi nonlymphoid 6-8. Qui, abbiamo dettagliole procedure implementate per l&#39;isolamento e l&#39;attivazione di melanoma umano TIL e per la generazione di iPSCs TIL derivati ​​utilizzando un sistema di riprogrammazione SeV.

<table><tbody><tr><td>delicato MACS C Tubi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>delicato Dissociatore MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione tumorale, umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Tecnologie di vita</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml Tubi conici per cntrifugi</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>siero AB umano</td> Life <td>technologies</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina (200mM)</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo (1000x, 55mM)</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina&nbsp;</td><td>Tecnologie di vita</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Tecnologie di vita</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Tecnologie di vita</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>umano ricombinante (rh) IL-2</td><td>Aldesleuchina, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purificato NA/LE Topo Anti-Umano CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Purificato NA/LE Topo Anti-Umano CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetilcisteina</td><td>Cumberland Prodotti farmaceutici Inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali Falcon (6 pozzetti)</td><td>Piastre</td> per colture tissutali Corning <td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon (24 pozzetti)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Vettore virale Sendai</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL Cellule feeder</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>mitomicina C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>solubile in acqua (0,5 mg/ml)</td></tr><tr><td>gelatina</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF)</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano linfociti infiltranti il ​​tumore

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Trasferimento adottivo di ex vivo ampliato linfociti tumore-infiltranti autologhe (TIL) possono mediare le risposte durature e completi in sottogruppi significativi di pazienti con melanoma metastatico. I principali ostacoli di questo approccio sono la ridotta vitalità delle cellule T trasferiti, causate da accorciamento dei telomeri, e il numero limitato di TIL ottenuti da pazienti. Le cellule T Meno dissociati con telomeri lunghi sarebbe un sottoinsieme di cellule T ideale per la terapia delle cellule T adottiva, tuttavia, generando un gran numero di queste cellule T meno dissociati è problematico. Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superata dalle cellule utilizzando indotte pluripotenti staminali (iPSCs) che l&#39;auto-rinnovarsi, mantenere i telomeri pluripotenza, si sono allungati, e di fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l&#39;immunoterapia. Qui, vi presentiamo un protocollo per generare iPSCs utilizzando vettori di virus Sendai per la trasduzione di fattori di riprogrammazione in TIL. Questo protocollo generas completamente riprogrammati, cloni libero da vettori. Questi iPSCs TIL-derivati ​​potrebbero essere in grado di generare cellule T-paziente e tumore-specifici meno dissociati per la terapia delle cellule T adottiva.

La Figura 1 mostra la descrizione della procedura che coinvolge l&#39;espansione iniziale del melanoma TIL con rhIL-2, che è seguita da attivazione con anti-CD3 / CD28 e trasferimento genico Oct3 / 4, Klf4, SOX2, e c-MYC per TIL per la generazione di iPSCs. Di solito, TIL sulla cultura con rhIL-2 cominciano a formarsi le sfere 21-28 giorni dopo l&#39;inizio della cultura. A questo punto, TIL sono pronti per essere attivato con anti-CD3 / CD28. La figura 2A</stron...

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare il protocollo per la riprogrammazione dei linfociti infiltranti il tumore del melanoma in cellule staminali pluripotenti indotte.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è generare cellule staminali pluripotenti indotte, o iPSC, da linfociti infiltranti il melanoma. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia tumorale, in particolare per l'immunoterapia anticancro. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la possibilità di generare cellule staminali iPS umane da linfociti infiltranti il tumore potrebbe fornire un numero illimitato di linfociti T specifici per il tumore, meno differenziati, da utilizzare nella terapia immunologica.Questa tecnica potrebbe avere applicazioni nel trattamento del melanoma metastatico poiché attualmente la scarsa sopravvivenza dei linfociti T in ambito clinico rappresenta il principale limite della terapia adattiva con linfociti T. Questo metodo potrebbe inoltre risultare utile nello studio del repertorio di recettori per i linfociti T nel microambiente tumorale. A illustrare la procedura sarà la dottoressa Kumiko Iwabuchi, ricercatrice post dottorato del mio laboratorio.Dopo aver ottenuto il materiale tumorale, selezionare da cinque a venti grammi di campioni tumorali e utilizzare le forbici per dissezionare il tessuto normale, solido e compatto dalle aree fragili e/o necrotiche emorragiche dei campioni tumorali. Tritare i campioni dissezionati nel modo più fine possibile, quindi utilizzare un dissociatore e un kit di dissociazione tumorale umano per disperdere i frammenti tumorali in una sospensione monocellulare, seguendo le istruzioni del produttore. Al termine della dissociazione, filtrare le cellule attraverso un filtro da 70 micron in un tubo da 50 millilitri e lavare il filtro due volte con due millilitri di RPMI 1640.Quindi, centrifugare le cellule per formare un pellet e risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo fresco per linfociti T. Per separare le cellule mediante gradiente di densità, stratificare prima 30 millilitri di soluzione al 75% di gradiente, seguiti da 10 millilitri di soluzione al 100% di gradiente in DPBS senza calcio o magnesio, in un nuovo tubo da 50 millilitri. Successivamente, sovrapporre con attenzione le cellule sulla soluzione di gradiente avendo cura di non alterare i livelli e centrifugare il campione.Al termine della separazione, trasferire i linfociti T infiltranti il tumore arricchiti o TILs all'interfaccia tra le soluzioni gradientali in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e lavare le cellule con 20-30 millilitri di DPBS fresco. Ri-sospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo fresco per linfociti T, quindi aggiungere due millilitri di TILs per pozzetto a cinque pozzetti di una piastra a sei pozzetti e integrare le colture di TILs con IL-2 umano ricombinante per cinque giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al quinto giorno, sostituire metà del mezzo in ogni pozzetto e successivamente ogni due o tre giorni.Quando le colture raggiungono una confluenza dell'80-90%, utilizzare una pipetta per risospendere delicatamente le cellule in ciascun pozzetto e suddividere le colture in un rapporto uno a due in un millilitro di mezzo fresco per linfociti T integrato con IL-2 umana ricombinante. Per preparare le piastre con cellule di supporto SNL trattate con mitomicina C, coltivare innanzitutto le cellule di supporto SNL in 10 millilitri di mezzo per cellule di supporto SNL su una piastra da 10 centimetri rivestita con gelatina allo 0,1%. Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, trattare le cellule di supporto con mitomicina C per due ore e 15 minuti a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con cinque millilitri di DPBS. Quindi staccare i feeder con Trypsin-EDTA a temperatura ambiente. Dopo un minuto, neutralizzare la reazione di dissociazione con 4,5 millilitri di mezzo fresco per feeder SNL e trasferire la sospensione di cellule singole in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione.Risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo fresco per cellule nutritizie SNL per il conteggio. Quindi piastrare 1,5 × 10⁶ cellule nutritizie SNL per pozzetto in piastre da 10 centimetri e coltivare le cellule a 37 °C in un’atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica per un massimo di tre giorni. Per generare le iPSC mediante virus di Sendai, trasferire 5 × 10⁵ TIL per pozzetto in una nuova piastra a sei pozzetti rivestita con anticorpo murino anti-umano CD3, in due millilitri di mezzo fresco per linfociti T integrato con IL-2 umano ricombinante e anticorpo murino solubile anti-umano CD28.Attivare i LIT nell'incubatrice per colture cellulari per cinque giorni. Successivamente, utilizzare una pipetta per raccogliere le colture in un tubo conico da 15 millilitri per il conteggio. Trasferire quindi 1 × 10⁵ LIT per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti rivestita con CD3 anti-umano in 500 microlitri di mezzo di riprogrammazione integrato con CD28 anti-umano murino solubile e IL-2 umano ricombinante.Dopo 24 ore nell'incubatore per colture cellulari, numerare le cellule in ogni pozzetto e preparare diversi volumi di virus alle appropriate molteplicità di infezione. Quindi aggiungere una miscela di vettori virali di Sendai a un MOI compreso tra 10 e 20 nel volume appropriato di mezzo e aggiungere il mezzo contenente il virus a ciascun pozzetto di TIL. Per la determinazione dell'efficienza di trasduzione, aggiungere il volume calcolato di virus di Sendai GFP in un pozzetto di TIL attivati e reinserire le colture nell'incubatore per 24 ore.Il giorno successivo, osservare le cellule infette con il virus Sendai GFP mediante microscopia a fluorescenza per stimare l'efficienza di trasduzione. Raccogliere le cellule infette da ogni pozzetto in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione e risospendere il pellet in 0,5 millilitri di mezzo per cellule staminali embrionali umane integrato con mezzo per cellule staminali embrionali di primate e fattore di crescita fibroblastico basico. Successivamente, aggiungere 9,5 millilitri di mezzo fresco per cellule staminali embrionali umane alle cellule e trasferire la sospensione su una piastra di cellule feeder SNL trattate con mitomicina C.In questa immagine sono mostrati i LIT al giorno 21 di coltura con IL-2 umana ricombinante, pronti per essere attivati con anti-CD3 e CD28. I LIT possono essere trasfettati con il virus Sendai a una multiplicità di infezione di 20. Qui viene mostrato un tipico clone pluripotente su cellule di supporto SNL da 18 a 21 giorni dopo l'infezione da virus Sendai.Come osservato in questo cariogramma rappresentativo, le iPSC derivate da LIT mostrano un cariotipo normale. La colorazione mediante immunofluorescenza per confermare l'espressione dei marcatori di pluripotenza sulle iPSC derivate da LIT dimostra che queste cellule esprimono livelli attesi dei tipici marcatori di pluripotenza. Inoltre, le iPSC derivate da LIT di melanoma sono in grado di formare teratomi che contengono una varietà di cellule appartenenti ai tre strati germinativi.Inoltre, le iPSC derivate da TIL hanno mantenuto le loro riarrangiamenti del recettore per cellule T, come valutato mediante elettroforesi capillare. Questa nostra prima realizzazione apre la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per esplorare terapie immunologiche antitumorali più efficaci per i pazienti con melanoma metastatico. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale verificare la proliferazione e la vitalità delle cellule T prima dell'infezione con il virus di Sendai e valutare l'efficienza dell'infezione attraverso l'espressione contornata di GFP.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare cellule TIL umane da TIL derivati dal melanoma.

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