Layered alginato costrutti: Una piattaforma per la cooperazione culturale delle popolazioni cellulari eterogenee

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare in modo riproducibile dischi di alginato idrogel bistrato per studiare le relazioni tra diverse popolazioni cellulari durante la co-coltura 3D. Questo metodo facilita lo studio delle interazioni tra più popolazioni cellulari in colture 3D spazialmente eterogenee, che possono aiutare a rispondere a domande chiave nell'ingegneria tissutale e nella fisiologia dei tessuti portanti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre un modo semplice, economico e riproducibile per costruire idrogel di alginato multistrato con semi cellulari che sono strutturalmente favorevoli alla stimolazione meccanica.

A dimostrare questa procedura sarà Poonam Sharma, uno studente laureato del mio laboratorio. Per formare i dischi di alginato, impilare prima un pezzo di carta da filtro spessa sopra una piastra terminale di tre x tre pollici, seguita da una membrana a microsetaccio cellulare. Utilizzare una spatola sterile per appiattire la membrana e la carta da filtro.

Quindi, capovolgi la pila su una pila di carta assorbente e comprimi i materiali per rimuovere la soluzione di cloruro di calcio in eccesso. Quindi, posizionare uno stampo per la formazione di gel con pozzetti cilindrici sopra la membrana del microsetaccio e utilizzare le clip per legare per fissare delicatamente lo stampo alla piastra terminale sui lati sinistro e destro. Ora, impila un pezzo di carta da filtro spessa su una piccola piastra terminale, seguito da un pezzo di membrana del microsetaccio, e capovolgi la pila per rimuovere l'eccesso di cloruro di calcio, come appena dimostrato.

Quando entrambe le metà dello stampo sono pronte, risospendere una volta da 10 a un sesto di cellule di interesse per millilitro di terreno di alginato sterile. La miscela apparirà omogeneamente torbida quando le cellule sono opportunamente disperse. Quindi, trasferire 130 microlitri di cellule goccia a goccia in singoli pozzetti di sei millimetri di diametro per tre millimetri di altezza nella metà inferiore della costruzione dello stampo.

Un leggero menisco convesso dovrebbe essere visibile sopra il bordo di ogni pozzetto. Quando tutte le cellule sono state seminate, utilizzare una spatola sterile per levigare accuratamente la metà superiore del costrutto dello stampo. Quindi, capovolgere lo stampo in modo che la membrana del microsetaccio sia sopra i pozzetti, e posizionare lo stampo sopra i pozzetti, avendo cura di coprire completamente i pozzetti contenenti le miscele di cellule e alginato.

Quando lo stampo è in posizione, sollevare il costrutto dello stampo caricato e, premendo con decisione sul centro, posizionare le clip del raccoglitore sui due lati rimanenti del costrutto per fissare le metà superiore e inferiore dello stampo. Le soluzioni cellulari di alginato devono essere inserite in modo sicuro nei pozzetti. Successivamente, immergere l'intero costrutto dello stampo in un bagno di cloruro di calcio da 102 millimolari in una cappa di coltura cellulare a temperatura ambiente per 90 minuti.

Al termine dell'incubazione, trasferire il costrutto su una pila di carta assorbente e rimuovere le due clip per legante che fissano la piastra terminale superiore allo stampo. Separa le due metà del costrutto. Gli idrogel formati nei pozzetti non dovrebbero avere bolle e dovrebbero riempire completamente i pozzetti.

Rimuovere le due clip per legante rimanenti e separare lo stampo contenente idrogel dalla piastra terminale rimanente. Usando una spatola, traccia con cura il bordo dei pozzetti contenenti gli idrogel per allentare accuratamente i gel. Quindi, trasferire gli idrogel direttamente in un bagno di DPBS con cloruro di calcio e cloruro di magnesio.

Dopo uno-cinque minuti, trasferire gli idrogel nei singoli pozzetti di una piastra a sei pozzetti contenente una soluzione di terreno di crescita di basilico sufficiente per immergere completamente i gel per almeno un'ora a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2. Durante gli ultimi 30 minuti dell'incubazione, utilizzare clip per legante per fissare lo stampo con pozzetti a metà dell'altezza dello stampo per la formazione del gel alla piastra terminale in alluminio da tre per tre pollici o tre per 1,5 pollici sui lati sinistro e destro per creare uno stampo da taglio. Quindi creare la modalità di ricottura tagliando lo stampo con pozzetti di diametro maggiore di tre millimetri rispetto allo stampo per la formazione del gel a piastre terminali in alluminio da tre pollici per tre pollici sui lati sinistro e destro.

Ora, trasferisci gli idrogel nei pozzetti dello stampo da taglio. Ogni gel dovrebbe adattarsi perfettamente al pozzetto con metà del gel che sporge sopra lo stampo. E usa un bisturi per tagliare lungo la superficie dello stampo per tagliare l'idrogel a metà.

Capovolgere la metà superiore del gel e metterla in uno stampo aperto. Il pezzo di gel dovrebbe adattarsi perfettamente al pozzo, ma ora entrambe le metà dovrebbero essere all'altezza dello stampo, con la superficie interna tagliata visibile. Quindi, posizionare un pezzo di membrana di microsetaccio a cellule secche sopra i pozzetti, assicurandosi che la membrana sia a contatto con tutte le metà del gel da ricuocere, e coprire la membrana con un pezzo di carta da filtro spessa.

Quando i gel sono completamente coperti, saturare la carta da filtro con citrato di sodio integrato con EDTA e incubare i gel a temperatura ambiente. Dopo un minuto, scartare la membrana del microsetaccio cellulare e la carta da filtro spessa e rimuovere le clip del legante. Quindi, aprire lo stampo e trasferire una metà di gel in uno stampo di ricottura preparato con la superficie tagliata rivolta verso l'alto.

Utilizzando una spatola, trasferire un secondo mezzo gel trattato sul primo gel, in modo che la superficie tagliata sia a contatto con la superficie tagliata del primo gel. Quando tutti i gel sono stati posizionati, utilizzare una spatola per premere delicatamente sui gel per rimuovere eventuali bolle e immergere con cura lo stampo di ricottura nel bagno di cloruro di calcio. Dopo 30 minuti, trasferire lo stampo di ricottura su una pila di carta assorbente e rimuovere le clip di rilegatura.

Quindi, separare lo stampo dalla piastra terminale e trasferire brevemente i gel in un bagno DPBS, seguito dalla loro immersione nel terreno di coltura cellulare appropriato. I gel a doppio strato completati mostrano una separazione iniziale totale delle popolazioni cellulari, come osservato in questa immagine di 293 cellule FT marcate con coloranti traccianti per globuli verdi o rossi. La vitalità delle cellule staminali mesenchimali umane incorporate dopo la ricottura è elevata all'interno degli idrogel stratificati, simile alla vitalità cellulare osservata negli idrogel di massa.

Dopo aver isolato il picco di stress da ciascun ciclo per una compressione ciclica non confinata di quattro ore, gli idrogel stratificati privi di cellule mostrano una risposta allo stress alla compressione ciclica che è significativamente inferiore in entità rispetto agli idrogel privi di cellule non stratificati, anche se entrambi i tipi di idrogel rimangono intatti dopo sette giorni in coltura. Una volta padroneggiata, questa tecnica, compresa la preparazione di tutti i materiali, può essere completata in meno di quattro ore e mezza se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavorare deliberatamente e lentamente per evitare errori e per tenere più facilmente traccia dei diversi campioni.

Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la stimolazione meccanica e l'immunocolorazione per rispondere a ulteriori domande riguardanti le interazioni tra le diverse popolazioni cellulari nelle matrici extracellulari che possono formarsi. Questa tecnica consentirà ai ricercatori nel campo della meccanobiologia e dell'ingegneria tissutale di studiare più facilmente la relazione tra diverse popolazioni cellulari, come le cellule staminali mesenchimali, i condrociti e le cellule del nucleo polposo. Non dimenticare che lavorare con oggetti taglienti, materiali biologici e in particolare cellule umane può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare indumenti protettivi personali appropriati.