Name: Layered alginato costrutti: Una piattaforma per la cooperazione culturale delle popolazioni cellulari eterogenee (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Scopri come creare dischi di idrogel di alginato bi-strato per studiare le interazioni tra popolazioni cellulari eterogenee in co-coltura 3D. Questo metodo economico e riproducibile facilita la ricerca nell'ingegneria tissutale.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. Preparazione per la Formazione di alginato di dischi <ol><li> Preparare un 4% (w / v) soluzione di alginato a 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline senza cloruro di aggiunta di calcio o cloruro di magnesio e posto in un bagno d&#39;acqua 37 ° C. Le concentrazioni di soluzione di alginato può variare, ma 1 - 4% (w / v) sono raccomandati soluzioni di alginato. </li><li> Mescolare la soluzione di alginato con un rapporto di 1: 1 con base mezzi di coltura cellulare caldo (ad esempio, di Dulbecco Modified Eagle Medium.) Per il tipo cellulare desiderato. La concentrazione alginato è ora metà della concentrazione iniziale, cioè., 2% (w / v). Sterilizzare alginato / soluzione multimediale utilizzando sterili 0,2 micron filtri di nylon siringa. </li><li> Preparare un bagno di sterile 102 mM cloruro di calcio diidrato in acqua sterile con soluzione sufficiente per sommergere stampi (~ 200 - 300 ml). </li><li> Raccogliere la sterile &quot;di stampo formazione di gel&quot; (6 mm di diametro x 3 mm pozzi cilindrici alti in un 3 a 3 x in lamiera di alluminio, vedere <strong&gt; Figura 1) e placche (inferiore: uno 3 x 3 in lamiera di alluminio, Top: una 1.5 in x 3 in lamiera di alluminio) e preparare stampi come segue: <ol><li> Tagliare carta spessa filtro (carta da filtro assorbente) e la membrana cellulare microsieve (10 micron dimensioni dei pori) per le dimensioni della parte superiore e inferiore piastre laterali e metterli nella vasca da bagno di cloruro di calcio fino a saturazione, circa 1 min. Se lo si desidera, sterilizzare il filtro di carta spessa e la membrana microsieve tramite autoclave o luce ultravioletta per 30 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Set-up metà (la metà inferiore) del costrutto stampo. <ol><li> Posizionare i seguenti elementi in cima l&#39;un l&#39;altro nel seguente ordine e lisciare con una spatola sterile: grande endplate (3 x 3), carta da filtro di spessore, e quindi la membrana microsieve. </li><li> Capovolgere e premere lo stampo su una pila di tovaglioli di carta per assicurare la perdita di soluzione di cloruro di calcio in eccesso. </li><li> Posizionare il &quot;muffe gel&quot; con i pozzetti cilindrici in cima alla cell microsieve membrana e delicatamente fissare lo stampo insieme su due lati con legante clip sui lati destro e sinistro. Assicurarsi di lasciare abbastanza spazio per la placca superiore (1,5 in x 3) per coprire completamente i pozzetti in seguito. </li></ol></li><li> Allestimento seconda metà (la metà superiore) del costrutto stampo. <ol><li> Posizionare i seguenti elementi in cima l&#39;un l&#39;altro nel seguente ordine e levigare: piccola placca motrice, carta da filtro di spessore, a membrana microsieve. </li><li> Invertito e premere questo metà dello stampo su una pila di asciugamani di carta per garantire la perdita di soluzione di cloruro di calcio in eccesso. Non fissare questo metà dello stampo utilizzando clip legante in questo momento. </li></ol></li></ol></li><li> cellule di coltura come raccomandato secondo le istruzioni del produttore. Raccogliere le cellule desiderate per incorporare nelle idrogel alginato strati. La densità raccomandata è 1 - 2 x 10 6 cellule / ml, ma questo può essere variata a seconda esperimenti desiderati. Nota: quando si utilizza questo metodoper fare gli strati con differenti tipi di cellule, assicurarsi di cultura due tipi di cellule in parallelo per la stratificazione. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) seminate ad una densità cellulare di cellule 1 x 10 6 / ml sarà utilizzato come esempio per il seguente protocollo. numero di cellulare e numero del disco possono essere scalati per esperimenti, se necessario. <ol><li> Una a due settimane prima incorporamento, cellule staminali seme mesenchimali ad una densità cellulare di 3.000 - 5.000 cellule / cm 2 in 10 ml di terreni di crescita basale (Dulbecco Modified Eagle Medium, 10% siero fetale bovino, 2% L-Glutammina, 1 % non-aminoacidi essenziali, 1% penicillina / streptomicina) in T-75 fiaschi. </li><li> Rimuovere media speso ogni 2 - 3 giorni e sostituire con 10 ml di mezzi di crescita basale finché le cellule sono 80 - 90% confluenti. </li><li> Per raccogliere le cellule, rimuovere i supporti spesi, e pipetta da 3 ml di 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline senza cloruro di calcio aggiunto o cloruro di magnesio per sciacquare le cellule. Rimuovere questa soluzione, pipetta 3 ml di 0,25% TryPSIN-EDTA su cellule in crescita in T-75 fiaschi, e incubare per 5 min a 37 ° C. Dopo che le cellule hanno sollevato dalla superficie di adesione aggiungere 6 - 9 ml di terreni di crescita basale. </li><li> MSC centrifugare a 600 xg per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il supernatante e risospendere in: 1 - 5 ml di terreni di crescita basale. Contare le cellule utilizzando un emocitometro utilizzando istruzioni del dispositivo. </li><li> Rimuovere 1 x 10 6 cellule dalla risospensione delle cellule totali, centrifugare utilizzando le stesse condizioni, e aspirare il surnatante. </li></ol></li></ol> 2. Formazione di cellule Seeded alginato dischi <ol><li> Risospendere il pellet cellulare con 1 ml di soluzione di alginato / media sterile per ottenere una densità cellulare di 1 x 10 6 cellule / ml. La miscela di cellule-alginato sarà omogeneamente nuvoloso in aspetto quando le cellule sono mescolati in modo appropriato. </li><li> Pipettare 130 ml di miscela di cellule-alginato in sei diametro di 6 mm x 3 mm pozzi alti nella metà inferiore dello stampocostruire goccia a goccia, in modo da non creare bolle. Un leggero menisco convesso deve essere visibile sopra il bordo di ciascun pozzetto. </li><li> lisciare cautela la metà superiore del costrutto stampo usando una spatola sterile e capovolgerlo, in modo che la membrana microsieve cellulare è in cima pozzetti. Posizionare lo stampo costrutto sopra dei pozzetti, facendo attenzione a coprire i pozzetti contenenti le cellule e la miscela alginato completamente. </li><li> Sollevare il costrutto di stampo caricato e, tenendo premuto con forza sul centro, Fermaglio a molla i restanti due lati (superiore e inferiore) per fissare le due metà superiore e inferiore del costrutto stampo. Le soluzioni cell-alginato devono essere immerso saldamente in pozzetti in questo momento. </li><li> Immergere il costrutto di stampo fissato in 102 mm bagno di cloruro di calcio, facendo in modo che l&#39;intero costrutto è sommerso. Incubare nel cofano coltura cellulare a temperatura ambiente per 90 min. </li><li> Alla fine del 90 min, rimuovere il costrutto stampo dal cloruro di calcio 102 mMbagno e posto su una pila di asciugamani di carta nel cofano coltura cellulare. Rimuovere tutte e quattro le clip legante e separare le due metà del costrutto stampo. Gli idrogel formati in pozzetti non dovrebbero avere eventuali bolle e devono riempire completamente i pozzetti. </li><li> Utilizzando una spatola, accuratamente tracciare il bordo dei pozzetti contenenti gli idrogeli per allentare attentamente e incuneare le idrogel. Dopo aver rimosso i idrogel dal costrutto stampo rilasciare gli idrogeli direttamente in un bagno di 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline con cloruro di calcio e cloruro di magnesio. Coprire i gel completamente per lavare via la soluzione di cloruro di calcio in eccesso per 1-5 min. </li><li> Trasferire i idrogel nella soluzione basale terreni di crescita in piatto desiderato (ad es., Piastre 6 e) che copre completamente i idrogel. Incubare per almeno 1 ora in incubatrice coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2 prima di passare alla fase stratificazione. Nota: Gli idrogel che contengono le cellule possono essere tenuti inincubatore di coltura cellulare indefinitamente in questo momento fino stratificazione di gel con un&#39;altra popolazione cellulare è desiderato, purché le modifiche di supporto vengono completati ogni 2 - 3 giorni. </li></ol> 3. Stratificazione di alginato di dischi <ol><li> Durante l&#39;ultima mezz&#39;ora della incubazione 1 ora, raccogliere e preparare stampi sterili e soluzioni per la ricottura i gel. <ol><li> Preparare la &quot;stampo taglio&quot; fissando uno stampo che ha pozzetti la metà dell&#39;altezza della &quot;muffe gel&quot; (da 6 mm di diametro x 1,5 mm pozzi alti in 3 x 3 in lamiera di alluminio) ad una placca (3 x 3 in lamiera di alluminio) con legante clip sui lati destro e sinistro. </li><li> Preparare la &quot;stampo annealing&quot; fissando uno stampo che è di 3 mm di diametro maggiore del &quot;muffe gel&quot; (diametro di 9 mm x 3 mm pozzi alte in un 3 a x 3 in lamiera di alluminio) ad una placca (3 x 3 in lamiera di alluminio) con legante clip sui lati destro e sinistro. </li><li> Preparare una soluzione di100 mM citrato di sodio / 30 mM EDTA (citrato di sodio diidrato, etilendiamminotetraacetico tetrasodico dell&#39;acido sale diidrato) in acqua sterile. </li></ol></li><li> Rimuovere gel di popolazioni cellulari desiderato (in questo esempio, due dischi con hMSCs) da parte dei media nel piatto, e il luogo in pozzi &quot;di taglio di muffa&quot;. Ogni gel dovrebbe andare bene comodamente nei pozzetti con la metà del gel che sporge sopra lo stampo. </li><li> Usando un bisturi, tagliare il gel lungo la superficie dello stampo (questo intercettato idrogel a metà). Vibrazione la metà superiore del gel e metterlo in un pozzo stampo aperto. La metà del gel dovrebbe adattarsi comodamente nello stampo bene, ma ora entrambi i gel mezzo dovrebbe essere l&#39;altezza dello stampo con la superficie interna tagliata visibile. Ripetere con la seconda gel. Nota: Attenzione: solo le superfici di taglio interne formeranno dischi sovrapposti. Utilizzando le superfici esterne comporterà la metà di separazione. Si sospetta che trama dalla membrana microsieve trasferito sulla superficie del gel impedisconos successo del processo di ricottura. </li><li> Posizionare un pezzo di secca membrana cellulare microsieve sopra dei pozzetti, facendo in modo che la membrana microsieve è in contatto con tutte le metà gel essere ricotto e li copre completamente. Posizionare la carta filtro spesso sulla parte superiore della membrana microsieve, avendo cura di coprire completamente i gel. </li><li> Pipettare una soluzione di 100 mM di sodio citrato / 30 mM EDTA (sodio citrato diidrato, etilendiamminotetracetico tetrasodico dell&#39;acido sale diidrato) sulla carta filtro spesso fino a saturazione. Circa 750 ml è sufficiente per quattro pozzi. </li><li> Incubare i gel per 1 min a temperatura ambiente. Poi, rimuovere la membrana microsieve cellulare e carta da filtro di spessore e gettarli. Rimuovere le clip legante e aprire lo stampo. </li><li> Per ogni gel ricotto, trasferire uno citrato di sodio / trattato con EDTA metà del idrogel al preparato &quot;stampo ricottura&quot; con la superficie di taglio verso l&#39;alto. Questo sarà una metà del const ricottoruct. </li><li> Utilizzando una spatola, sollevare e posizionare un citrato secondo sodio / trattato con EDTA half-gel (può contenere un diverso tipo di cellula) sul gel già nel &quot;muffa annealing&quot;, lanciando questa seconda metà gel in modo che la superficie di taglio è in contatto con la superficie di taglio del gel già nel &quot;stampo annealing&quot;. </li><li> Premere delicatamente verso il basso le due gel utilizzando una spatola per eliminare eventuali bolle tra le due gel. Inoltre, riposizionare i gel come necessario per assicurarsi che essi sono direttamente sopra l&#39;altro. </li><li> Sollevare delicatamente la &quot;muffa ricottura&quot; e immergerlo nella vasca 102 mm di calcio cloruro per 30 min. Non coprire i pozzetti con una placca motrice. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 30 minuti, rimuovere il &quot;muffa ricottura&quot; e posizionarlo sulla carta assorbente. Rimuovere le clip legante e separare lo stampo dalla placca. </li><li> Utilizzando una spatola, raccogliere i gel ricotto e metterli in un 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline con cloruro di calcio e mbagno di cloruro di agnesium per lavare i gel. Successivamente, il trasferimento idrogel ricotto per terreni di coltura di cellule in un piatto desiderato (ad es., 6 pozzetti) per la cultura. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, descriviamo un protocollo per la formazione di dischi idrogel alginato stratificate per lo studio co-colture di più popolazioni cellulari, come quelli nei tessuti fisiologicamente strati, ad esempio, la cartilagine. strutture stratificate, come la piattaforma coltura descritto, possono essere utilizzati per esaminare l&#39;interazione tra due distinte popolazioni cellulari sottoposti allo stesso ambiente coltura o sotto carico. Alginato è un polisaccaride lineare anionico che è...

Compressione portanti tessuti come la cartilagine articolare o dischi intervertebrali sono costituiti da regioni tessuti eterogenei che sono fondamentali sia per la funzione biomeccanica e adeguata meccano-trasduzione nel tessuto. Non solo è l&#39;organizzazione cellulare e funzione distinta in diverse regioni, ma le matrici extracellulari (ECM) sono inoltre variazioni nella composizione e organizzazione. Ad esempio, cartilagine articolare è costituito da tre zone primarie con diversi morfologia cellulare, funzione meccanica e ECM. Le differenze a cambiare ECM al differenziale responsabilità portanti; lo strato superficiale è coinvolto soprattutto in risposta alla trazione per caricare, mentre le zone centrali e profonde sono principalmente responsabili per la risposta alla compressione 1. Allo stesso modo, nel disco intervertebrale, un nucleo polposo simile a gel è circondato da un anello di fibrosi lamellare e le cellule all&#39;interno di queste due aree distinte sperimentare diversi tipi di stimoli biofisici2. In questi tipi di tessuti, cellule e le matrici extracellulari all&#39;interno degli strati di tessuto interagiscono tra loro come il tessuto subisce e risponde a forze meccaniche. Ricapitolazione di tali strutture dei tessuti eterogenei rimane una sfida in ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa, e la nostra comprensione del loro significato biologico è limitato. Vi è la necessità per la coltura piattaforme per analizzare tessuti stratificate nonché co-colture di diverse popolazioni di cellule all&#39;interno di un costrutto. In ingegneria dei tessuti cartilagine articolare, costrutti scaffold meno strati sono stati costruiti sfruttando la capacità dei condrociti zonali per depositare varia ECM per simulare i diversi strati di questo tessuto 3,4. Tuttavia, a strati costrutti idrogel forniscono un&#39;opportunità per indagare l&#39;interazione di diversi tipi di popolazioni di cellule che non hanno la capacità di formare un tessuto robusto in modo indipendente. Ad esempio, pop diversoulations di cellule staminali mesenchimali possono essere co-coltura all&#39;interno di costrutti a strati. Tali ponteggi strati sono stati utilizzati sia con condrociti e differenziazione delle cellule staminali mesenchimali per migliorare ingegneria tissutale 5. Non solo è possibile diverse popolazioni cellulari essere co-coltura in strati di idrogel simili, ma un unico tipo di cellule possono anche essere coltivati ​​all&#39;interno di strati che sono state manipolate per avere diversa rigidità o il contenuto biochimico per ottenere risposte diverse dalle cellule 6,7. Molti idrogel biomateriali differenti sono stati utilizzati per sovrapporre popolazioni cellulari per l&#39;ingegneria tissutale cartilagine come quelle realizzate con glicole polietilene o basi alcool polivinilico 7-9. Tuttavia, idrogel alginato sono uno dei biomateriali semplici da cui creare scaffold stratificate per studiare popolazioni cellulari eterogenee in co-coltura. Mentre idrogel agarosio sono anche facilmente formate, idrogel alginato hanno il vantaggio di consentire facile èolation di celle dal costrutto 3-D per l&#39;analisi delle singole celle come è stato descritto in precedenza 10. In studi precedenti, idrogel alginato bi-strati sono stati formati in fogli sottili e da questi fogli, sezioni sono state fette (ad es., Usando un punzone biopsia) per particolari applicazioni come per l&#39;analisi del contenuto biochimica o proprietà di taglio interfacciali 11,12. Un altro metodo per formare fogli sottili alginato è stato descritto con il potenziale per la stratificazione in più strati, ma richiederebbe alterazione del idrogel per l&#39;uso in test meccanici 13. Qui, vi presentiamo un metodo per la creazione di dischi riproducibile idrogel alginato bi-strati per l&#39;utilizzo in co-coltura di diverse popolazioni di cellule. Questa piattaforma disco alginato possiede diversi vantaggi. Principalmente, la forma riproducibile e piccole dimensioni è favorevole per la stimolazione meccanica delle cellule incorporati senza richiedere una biopsia punch o altra modifica fisica alla idrogel per molte applicazioni. Inoltre, la vitalità cellulare rimane elevato durante il processo di stratificazione, e dopo la formazione del gel netta separazione di due popolazioni di cellule all&#39;interno del gel è visibile senza regione di sovrapposizione iniziale.

<table><tbody><tr><td>Acido alginico sale sodico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Soluzione prodotta in % in peso utilizzando DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11965</td><td>Esempio. Utilizzare i filtri per siringa del tipo di terreno desiderato</td></tr><tr><td>(0,02 &#956; m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Fisher Bioreagenti</td><td>BP510</td><td>Preparare la soluzione in acqua sterile</td></tr><tr><td>Carta da filtro per assorbente Criterion Biorad</td><td></td><td>1704085</td><td>Tagliare a misura le piastre terminali per la formazione di stampi</td></tr><tr><td>Membrana per microsetaccio cellulare (10 &#956; m dimensione dei pori)</td><td>Biodesign Inc di New York</td><td>N10R</td><td>Taglio a misura delle placche terminali per la formazione di stampi</td></tr><tr><td>Citrato di sodio diidrato</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico sale tetrasodico diidrato (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Tecnologie Gibco Life&nbsp;</td><td>26140</td><td>Utilizzato in esempio cellule staminali mesenchimali terreni di crescita basale</td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>15140</td><td>Utilizzato nell'esempio di cellule staminali mesenchimali terreni di crescita basale</td></tr><tr><td>L-glutammina (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>25030081</td><td>Utilizzato ad esempio con cellule staminali mesenchimali Mezzi di crescita basali</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Utilizzato ad esempio con cellule staminali mesenchimali mezzi di crescita basali</td></tr></tbody></table>

layered alginato costrutti: una piattaforma per la cooperazione culturale delle popolazioni cellulari eterogenee

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Molti tessuti portanti possiedono regioni strutturalmente e funzionalmente distinte, tipicamente accompagnate da diversi fenotipi cellulari con caratteristiche meccanosensoriali differenziali. L'ingegnerizzazione e l'analisi di questi tipi di tessuto rimangono una sfida. I costrutti di idrogel stratificati offrono l'opportunità di studiare le interazioni tra più popolazioni cellulari all'interno di singoli costrutti. Gli idrogel di alginato sono entrambi biocompatibili e consentono un facile isolamento delle cellule dopo la sperimentazione. Qui descriviamo un metodo per lo sviluppo di dischi di idrogel di alginato a doppio strato di piccole dimensioni. Questo processo mantiene un'elevata vitalità cellulare delle cellule staminali mesenchimali umane durante il processo di formazione e questi dischi stratificati possono resistere alla compressione ciclica non confinata, comunemente usata per la stimolazione delle hMSC in corso di condrogenesi. Questi costrutti stratificati possono potenzialmente essere ingranditi per includere livelli aggiuntivi ed essere utilizzati anche per segregare le popolazioni cellulari inizialmente dopo la stratificazione. Questa piattaforma di coltura di idrogel di alginato a doppio strato può essere utilizzata per molte applicazioni diverse, tra cui l'ingegneria e l'analisi di cellule di tessuti portanti e co-colture di altri tipi di cellule.

La figura 1 illustra la formazione e la stratificazione degli idrogel alginato. Completato gel bi-strati presentano una separazione iniziale completa di popolazioni cellulari come mostrato in Figura 2. La vitalità cellulare di cellule staminali mesenchimali umane) incorporato all&#39;interno di questi idrogel e stratificato rimane elevata e paragonabile a idrogel di massa come mostrato in figura 3. La vitalità è stata valutata dopo ricot...

L'ingegneria e l'analisi di tessuti portanti con popolazioni cellulari eterogenee sono ancora una sfida. Qui, descriviamo un metodo per la creazione di dischi di idrogel di alginato a doppio strato come piattaforma per la co-coltura di diverse popolazioni cellulari all'interno di un unico costrutto.

Layered alginato costrutti: Una piattaforma per la cooperazione culturale delle popolazioni cellulari eterogenee

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare in modo riproducibile dischi di idrogel di alginato a doppio strato per studiare le relazioni tra diverse popolazioni cellulari durante la co-coltura in 3D. Questo metodo facilita lo studio delle interazioni tra più popolazioni cellulari in colture tridimensionali spazialmente eterogenee, il che può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'ambito dell'ingegneria tissutale e della fisiologia dei tessuti portanti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che offre un modo semplice, economico e riproducibile per costruire idrogeli di alginato stratificati con cellule, strutturalmente adatti alla stimolazione meccanica.La procedura sarà dimostrata da Poonam Sharma, una studentessa laureanda del mio laboratorio. Per formare i dischi di alginato, posizionare prima un pezzo di carta filtrante spessa sopra una piastra terminale di tre pollici per tre pollici, seguita da una membrana microsetacciante per cellule. Utilizzare una spatola sterile per appiattire la membrana e la carta filtrante.Successivamente, capovolgere la pila su un mucchio di carta assorbente e comprimere i materiali per rimuovere l'eccesso di soluzione di cloruro di calcio. Poi, posizionare un modulo per la formazione del gel con pozzi cilindrici sulla membrana microsetacciata e utilizzare fermagli per rilegare per fissare delicatamente il modulo alla piastra terminale sui lati sinistro e destro. Ora, impilare un pezzo di carta filtrante spessa su una piccola piastra terminale, seguito da un pezzo di membrana microsetacciata, quindi capovolgere l'intera pila per rimuovere qualsiasi eccesso di cloruro di calcio, come appena dimostrato.Quando entrambe le metà dello stampo sono pronte, risospendere un milione di cellule di interesse per millilitro di mezzo sterile di alginato. La miscela apparirà uniformemente torbida quando le cellule saranno adeguatamente disperse. Successivamente, trasferire 130 microlitri di cellule, goccia a goccia, in singoli pozzetti del diametro di sei millimetri e dell'altezza di tre millimetri nella metà inferiore della costruzione dello stampo.Dovrebbe essere visibile un leggero menisco convesso al di sopra del bordo di ogni pozzetto. Una volta seminate tutte le cellule, utilizzare una spatola sterile per livellare con attenzione la metà superiore della matrice. Successivamente, capovolgere la matrice in modo che la membrana microsetacciata si trovi sulla parte superiore dei pozzetti, e posizionare la matrice sopra i pozzetti, avendo cura di coprire completamente i pozzetti contenenti le miscele di cellule e alginato.Quando lo stampo è in posizione, sollevare l'assemblaggio dello stampo caricato e, premendo con fermezza al centro, applicare mollette di fissaggio sui due lati rimanenti dell'assemblaggio per unire le due metà dello stampo, superiore e inferiore. Le soluzioni di alginato cellulare devono essere alloggiate in modo sicuro all'interno delle cavità. Successivamente, immergere l'intero assemblaggio dello stampo in un bagno di cloruro di calcio 102 millimolare all'interno di una cappa per colture cellulari a temperatura ambiente per 90 minuti.Al termine dell'incubazione, trasferire la costruzione su un impacco di fazzoletti di carta ed eliminare le due clip fermacarte che fissano la piastra superiore al mold. Separare le due metà della costruzione. Gli idrogeli formati nei pozzetti non dovrebbero presentare bolle e dovrebbero riempire completamente i pozzetti.Rimuovere le rimanenti due clip di fissaggio e separare lo stampo contenente l'idrogel dalla restante piastra terminale. Utilizzando una spatola, seguire con attenzione il bordo dei pozzetti contenenti gli idrogeli per allentare delicatamente i gel. Successivamente, trasferire direttamente gli idrogeli in un bagno di DPBS con cloruro di calcio e cloruro di magnesio.Dopo uno a cinque minuti, trasferire gli idrogeli in pozzetti separati di una piastra a sei pozzetti contenente una soluzione di mezzo di crescita per basilico sufficiente a immergere completamente i gel per almeno un'ora a 37 gradi Celsius e al 5 percento di CO2. Durante gli ultimi 30 minuti dell'incubazione, utilizzare fermagli a levetta per fissare lo stampo con pozzetti alti la met&agrave; rispetto allo stampo per la formazione dei gel alla piastra di alluminio da tre per tre pollici o da tre per 1,5 pollici sui lati sinistro e destro, al fine di creare uno stampo da taglio. Successivamente, creare la modalit&agrave; di ricottura fissando con fermagli uno stampo con pozzetti di diametro superiore di tre millimetri rispetto allo stampo per la formazione dei gel a piastre di alluminio da tre per tre pollici sui lati sinistro e destro.Ora trasferire gli idrogeli nelle cavità dello stampo per il taglio. Ogni gel deve adattarsi perfettamente alla cavità, con metà del gel che sporge al di sopra dello stampo. Utilizzare quindi un bisturi per tagliare lungo la superficie dello stampo e dividere l'idrogel in due metà.Ribaltare la metà superiore del gel e posizionarla in una cavità aperta dello stampo. Il pezzo di gel deve adattarsi perfettamente alla cavità, ma ora entrambe le metà devono raggiungere l'altezza dello stampo, con la superficie interna tagliata visibile. Successivamente, posizionare un pezzo di membrana microsetacciata per cellule asciutta sulle cavità, assicurandosi che la membrana sia a contatto con tutte le metà del gel da ricongiungere, e coprire la membrana con un pezzo di carta filtro spessa.Quando i gel sono completamente coperti, saturare la carta filtrante con citrato di sodio integrato con EDTA e incubare i gel a temperatura ambiente. Dopo un minuto, scartare la membrana microsetacciata per cellule e la carta filtrante spessa ed eliminare le graffette. Successivamente, aprire lo stampo e trasferire metà di un gel in uno stampo per ricottura preparato, con la superficie tagliata rivolta verso l'alto.Utilizzando una spatola, trasferire la seconda metà del gel trattata sul primo gel, in modo che la superficie tagliata sia a contatto con la superficie tagliata del primo gel. Una volta posizionati tutti i gel, usare una spatola per premere delicatamente sui gel al fine di rimuovere eventuali bolle d'aria ed immergere con attenzione lo stampo di anneggiamento nella soluzione di cloruro di calcio. Dopo 30 minuti, trasferire lo stampo di anneggiamento su un mucchio di tovaglioli di carta e rimuovere le clip di fissaggio.Quindi, separare lo stampo dalla piastra terminale e trasferire brevemente i gel in un bagno di DPBS, seguito dall'immersione nel relativo mezzo di coltura cellulare. I gel a doppio strato completati mostrano una separazione iniziale totale delle popolazioni cellulari, come osservato in questa immagine di cellule 293 FT marcate con coloranti tracker verde o rosso. La vitalità delle cellule staminali mesenchimali umane incorporate dopo il ricottimo è elevata all'interno degli idrogel stratificati, simile alla vitalità cellulare osservata negli idrogel in massa.Dopo aver isolato lo sforzo massimo di ogni ciclo durante quattro ore di compressione ciclica non confinata, gli idrogeli stratificati privi di cellule mostrano una risposta in termini di sforzo significativamente inferiore in ampiezza rispetto agli idrogeli privi di cellule non stratificati in massa, anche se entrambi i tipi di idrogel rimangono integri dopo sette giorni di coltura. Una volta padroneggiata, questa tecnica, compresa la preparazione di tutti i materiali, può essere completata in meno di quattro ore e mezza se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavorare con attenzione e lentamente per prevenire eventuali errori e per tenere più facilmente traccia dei diversi campioni.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la stimolazione meccanica e l'immunomarcatura per rispondere a ulteriori domande riguardanti le interazioni tra le diverse popolazioni cellulari che possono formare le matrici extracellulari. Questa tecnica permetterà ai ricercatori nel campo della meccanobiologia e dell'ingegneria tissutale di indagare più facilmente il rapporto tra diverse popolazioni cellulari, come le cellule staminali mesenchimali, i condrociti e le cellule del nucleo polposo. Non dimenticare che lavorare con oggetti appuntiti, materiali biologici e in particolare cellule umane può essere estremamente pericoloso, e che precauzioni come l'indossare dispositivi di protezione individuale adeguati devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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In questo protocollo, dimostriamo la realizzazione di una serie di messaggi microattuatore verticalmente sfollati su cui si basa la tecnologia, e come questa tecnologia di base può essere modificato per condurre high-throughput di coltura cellulare meccanicamente dinamica sia la cultura bidimensionale e tridimensionale paradigmi.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

Coltura di cellule normali in loro contesto tridimensionale rappresenta un metodo alternativo per studiare eventi precoci necessari per la trasformazione cellulare e tumorigenesi. Questo metodo è utilizzato per la coltivazione ovarici normali e cellule oviductal per studiare eventi precoci nella formazione del cancro ovarico.

Idrogeli di alginato per tridimensionale Cultura Organo di ovaie e tube

Nelle sezioni seguenti, si delineano le procedure per la preparazione di microsfere di alginato per l'uso in applicazioni biomediche. Specificatamente illustrano una tecnica per creare multistrato alginato microsfere per il duplice scopo di incapsulamento delle cellule e proteine ​​come potenziale trattamento di diabete di tipo 1.

Generazione di microsfere di alginato per applicazioni biomediche

Acquose due sistemi monofase sono stati usati per simultaneamente popolazioni modello multiple di cellule. Questo metodo semplice e veloce per patterning cellulare sfrutta la fase di separazione di soluzioni acquose di destrano e polietilene glicole e la tensione interfacciale che esiste tra le due soluzioni polimeriche.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Abbiamo stabilito un metodo per incapsulare cellule staminali pluripotenti (cellule PS) in capsule di idrogel di alginato utilizzando un ugello coassiale.  Ciò impedisce alle cellule di aggregarsi eccessivamente e limita lo stress da taglio sperimentato dalle cellule in coltura in sospensione.  La tecnica è applicabile alla produzione di massa di cellule PS e alla ricerca sulla nicchia delle cellule staminali.

Incapsulamento alginato di cellule staminali pluripotenti usando un ugello coassiale

Il seguente protocollo descrive la procedura per assemblare colture simili a sandwich da utilizzare come stadio intermedio tra ambienti cellulari bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D). I sistemi ingegnerizzati possono avere applicazioni in microscopia, biomeccanica, biochimica e saggi di biologia cellulare.

Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni

Descriviamo la fabbricazione di fogli di idrogel micromodellati utilizzando un processo semplice, che può essere assemblato e manipolato in una forma indipendente. Utilizzando questi fogli modulari di idrogel, è possibile generare un semplice sistema di coltura cellulare 3D su macroscala con un microambiente cellulare controllato.

Costruzione di fogli modulare idrogel per micropatterned macro-scala 3D Cellular Architettura

La coltura tridimensionale in perle di alginato, per la sua semplicità e riproducibilità, è stata scelta per mantenere le cellule di adenoma ipofisario. Le procedure includevano una digestione enzimatica iniziale e la dissociazione meccanica del tessuto tumorale, e la successiva sospensione cellulare è stata incapsulata in perle di alginato.

Tridimensionale alginato-tallone coltura di cellule umane adenoma ipofisario

Modelli di cultura doppio strato attuali non consentono per studi funzionali in vitro che imitano microambienti in vivo . Utilizzando polietilene glicole e un metodo di applicazione di modelli di ossido di zinco, questo protocollo descrive lo sviluppo di una membrana basale biomimetici ultrasottile con rigidità sintonizzabile, porosità e composizione biochimica che imita molto attentamente in vivo matrici extracellulari.

Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

Questo lavoro descrive un protocollo per la stampa 3D incorporata a forma libera di cellule staminali neurali all'interno di compositi di matrice extracellulare ricottura autorigeneranti. Il protocollo consente la modellazione programmabile di costrutti di tessuto neurale umano interconnessi con alta fedeltà.

Supporto composito a matrice microgel-extracellulare per la stampa 3D embedded di costrutti neurali umani

Il protocollo mostra un nuovo modello sperimentale in vitro in grado di ricapitolare la biologia di due tipi di linee cellulari aderenti con un'impalcatura tridimensionale (3D) stampata. Vengono descritte la costruzione di questo modello e le procedure operative, dalla preparazione e coltura cellulare all'analisi e valutazione.

Modello di co-coltura che utilizza due tipi di linee cellulari aderenti

Scopri come creare dischi di idrogel di alginato bi-strato per studiare le interazioni tra popolazioni cellulari eterogenee in co-coltura 3D. Questo metodo economico e riproducibile facilita la ricerca nell'ingegneria tissutale.

Layered alginato costrutti: Una piattaforma per la cooperazione culturale delle popolazioni cellulari eterogenee

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