Selezione del flusso e sequenza di Exome delle cellule Reed-Sternberg del linfoma classico di Hodgkin

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di separare e concentrare le cellule vitali di Hodgkin Reed-Sternberg o HRS dal linfoma di Hodgkin classico linfocitico infiammatorio o dai tumori CHL per la generazione e l'analisi di dati di sequenziamento di nuova generazione dell'intero esoma di alta qualità. Questo metodo può rispondere a domande chiave nella biologia della CHR, tra cui l'identificazione di mutazioni chiave driver, mutazioni di fuga immunologica e anche l'osservazione della diversità genica all'interno della classificazione. Questa tecnica produce DNA derivato dal tumore di altissima qualità e purezza.

Facilita la generazione di librerie di sequenziamento di nuova generazione senza la necessità di una fase di pre-amplificazione. Questa tecnica può avere importanti implicazioni per la diagnosi del linfoma di Hodgkin in quanto può aiutare con una sottoclassificazione e una prognosi. Può anche influenzare la scelta della terapia, poiché alcune alterazioni possono indicare suscettività o resistenza a farmaci specifici.

Jonathan From ha avuto questa idea per la prima volta quando ha scoperto come visualizzare le cellule HRS mediante citometria a flusso ed eseguire i primi esperimenti di smistamento con queste cellule. Prima di preparare le cellule, mescolare gli anticorpi pretitolati in una fiala di vetro scuro. Quindi, aggiungere PBS e BSA per portare il cocktail di anticorpi fino a un volume di 100 microlitri.

E trasferisci la fiala dall'azoto liquido in un secchiello per il ghiaccio o ghiaccio secco. Successivamente, scongelare rapidamente le cellule di interesse in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quando rimane solo una piccola porzione congelata, versare le cellule in un tubo conico da 50 millilitri contenente 45 millilitri di terreno di scongelamento a 37 gradi Celsius e sciacquare la fiala criogenica due volte con un millilitro di terreno di scongelamento fresco.

Dopo aver raccolto entrambi i risciacqui, lasciare digerire le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti. Quando le cellule si sono riequilibrate, raccoglierle per centrifugazione. Aspirare tutti i microlitri del surnatante tranne gli ultimi 200 litri.

Risospendere le cellule nel mezzo di scongelamento rimanente e lasciare riposare le cellule per altri due o tre minuti. Quindi, incubare le cellule in 100 microlitri del cocktail di anticorpi per 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le celle in tre millilitri di mezzo di selezione, rimettendo in sospensione il pellet in un millilitro di mezzo di selezione fresco.

Quindi, filtrare le cellule attraverso un filtro superiore a tubo di flusso da cinque millilitri. Sciacquare il tubo e il colino con un ulteriore millilitro di mezzo di selezione e tenere le celle sul ghiaccio. Prima di iniziare lo smistamento delle cellule, nel software del citometro a flusso nel menu dell'esperimento, selezionare un nuovo esperimento e aprire la finestra di stato dello strumento.

Nella scheda dei parametri, eliminare tutti i parametri inutilizzati. Quindi, riapri la scheda dell'esperimento e seleziona l'impostazione di compensazione per creare i controlli di compensazione. Nella finestra del browser, fare clic sul segno più per espandere il campione di controllo della compensazione ed eseguire i tubi di controllo della compensazione senza registrare i dati.

Regolare le tensioni del rivelatore secondo necessità in modo che le popolazioni di perline colorate positivamente per ogni flora cromata siano comprese tra il canale 10.000 e 100.000. E dei più brillanti nel loro canale di rilevamento primario. Registra le tensioni necessarie per ogni parametro per ogni tubo.

Quindi, sotto il campione di controllo di compensazione, fare un clic sinistro per evidenziare il tubo di controllo non colorato e caricare il tubo di controllo non colorato sul tavolino del campione. Nella finestra di controllo dell'acquisizione, fare clic su carico ed eseguire i singoli controlli di compensazione nei campi di tensione del rivelatore per tutti i parametri per inserire manualmente le tensioni determinate. Fare clic su registra per ottenere i dati di controllo non colorati.

Quindi eseguire tutti i controlli di compensazione rimanenti, registrando i dati senza modificare le impostazioni del rilevatore. Quando tutti i controlli sono stati analizzati, far scorrere una provetta di acqua deionizzata sterile per cinque minuti per ripulire lo strumento da eventuali residui di materiale prima di procedere. Per bloccare le celle per l'ordinamento HRS, caricare il tubo sperimentale e registrare almeno 100.000 eventi regolando la velocità di flusso per acquisire da 3.000 a 4.000 eventi al secondo.

Assicurati di registrare un numero sufficiente di eventi per visualizzare una popolazione che può essere pari a una su 1.000 celle. Per identificare i controlli somatici delle cellule B e T, eseguire il gate rispettivamente sulle cellule CD20 e CD5 positive. Quando tutti i cancelli sono stati impostati, suddividere le celle in tubi conici da 15 millilitri pre-raffreddati contenenti da sette a otto millilitri di terreno di raccolta.

Al termine della cernita, trasferire le popolazioni cellulari isolate in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. E pellettare le celle mediante centrifugazione. Quindi, lavare le cellule in un millilitro di PBS fresco e rimuovere i surnatanti da ogni provetta, facendo attenzione a non disturbare i minuscoli pellet.

Dopo l'amplificazione della libreria e la pulizia del cordone del punto 8X, si deve osservare una normale distribuzione della luce delle dimensioni dei frammenti nell'intervallo desiderato. Le librerie che mostrano deviazioni da questa forma indicano la presenza di un artefatto ad alto o basso peso molecolare e idealmente non dovrebbero essere sequenziate. Ad esempio, un dimero adattatore a volte può essere trasferito attraverso la prima pulizia del cordone X appuntito, apparendo come un picco acuto centrato intorno a 125-130 coppie di basi.

In questo caso, è necessario eseguire un'ulteriore pulizia del cordone X appuntito, seguita da una visualizzazione ripetuta della distribuzione dimensionale per garantire la corretta rimozione del dimero. Dopo il sequenziamento multiplexing di quattro campioni per corsia, è possibile ottenere una profondità mediana di copertura da 50 a 100 volte attraverso il bersaglio. Sebbene i grafici del numero di copie generati da una libreria di un nanogrammo possano comportare guadagni e perdite spurie del numero di copie.

Circa il 70% dei casi di linfoma di Hodgkin classico è portatore di mutazioni B2M e 820, e/o delezioni che sembrano essere clonali, e che possono essere utilizzate per stimare il contenuto tumorale relativo. Se le cellule T vengono utilizzate come controlli somatici, il sequenziamento HRS dimostrerà un significativo aumento del numero di copie nelle posizioni corrispondenti alle posizioni alfa, delta e beta del recettore delle cellule T. Oltre a perdite significative nel recettore delle cellule B, nelle posizioni pesanti e delle catene leggere kappa con un carico mutazionale complessivo da 100 a 400 mutazioni somatiche per caso di esoma.

Una volta padroneggiata, questa tecnica, che comprende lo smistamento delle cellule e la costruzione della libreria di sequenziamento, può essere completata in tre o quattro giorni se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, possiamo eseguire studi prospettici più ampi e altri metodi, come l'epigenetica, la proteomica e la metabalomica per acquisire maggiori conoscenze sul linfoma di Hodgkin e progredire verso terapie personalizzate più specifiche. Dopo il suo sviluppo, il metodo ci ha permesso di studiare celle HRS con elevata purezza in numeri relativamente grandi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule HRS e iniziare la loro analisi genomica.