Migliorata la Polymerase Chain Reaction-restrizione frammento lunghezza polimorfismo genotipizzazione di Pufferfish Tossico per cromatografia liquida / spettrometria di massa

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di eseguire una genotipizzazione rapida e accurata di pesci palla tossici analizzando piccoli ampliconi PCR. La parte commestibile del pesce palla che viene utilizzata per preparare il piatto di pesce palla varia a seconda della sua specie e alcune specie contengono tossine in tutto il corpo. Questo muscolo il database e masu e la pinna e la pelle di nascita del pesce palla possono aiutare nella genotipizzazione del pesce palla dal punto di vista della piena sicurezza alimentare per tutti e per l'indagine.

Per eseguire l'estrazione del DNA utilizzando un kit, posizionare prima da 30 a 50 milligrammi di tessuto di pesce in una provetta da microcentrifuga da 0,5 o 1,5 millilitri. Schiacciare il tessuto senza pinna e pelle, usando una microspatola. Aggiungere 180 microlitri di tampone per la lisi dei tessuti animali e 40 microlitri di proteinasi k e agitare brevemente.

Incubare a 56 gradi Celsius su un riscaldatore a blocchi per due ore o durante la notte. Centrifugare il campione per cinque minuti a 13000xg. Dopo aver trasferito il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri, aggiungere 200 microlitri del tampone caotropico contenente guanidina cloridrato dal kit.

Quindi aggiungere 200 microlitri di etanolo al 99,5% e mescolare a vortice. Trasferire la miscela, compreso l'eventuale precipitato, nella colonna di centrifuga posta in una provetta di raccolta da due millilitri. Dopo aver centrifugato per un minuto a 13000xg, scartare il flusso.

Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio, contenente guanidina cloridrato dal kit, e centrifugare come prima. Eliminare il flusso di passaggio e il tubo di raccolta. Posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta di raccolta da due millilitri fornita con il kit.

Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio due e centrifugare per tre minuti a 20.000xg. Dopo aver scartato il flusso e la provetta di raccolta, trasferire la colonna di centrifuga in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Pipettare 200 microlitri del tampone di eluizione al centro della membrana della colonna di centrifuga.

Dopo un minuto, centrifugare per un minuto a 6000xg. Quindi pipettare 50 microlitri di aluette in una cuvetta a raggi ultravioletti usa e getta. Misurare lo spettro ultravioletto dell'aluetta a 220-300 nanometri e l'assorbanza a 260 nanometri utilizzando uno spettrofotometro.

L'uso di reagenti privi di detergenti è fondamentale per il successo della cromatografia liquida perché i reagenti causano effettivamente possibili danni alla colonna analitica. Lavorando su un banco pulito per evitare contaminazioni, impostare una PCR da 25 microlitri per ogni campione di DNA estratto, un controllo positivo e un controllo negativo, su ghiaccio come descritto nel protocollo di testo. Per un facile utilizzo, preparare una quantità sufficiente di cocktail contenente tutti i reagenti senza DNA stampo e dispensarlo.

Utilizzare la DNA polimerasi con attività di correzione di bozze per evitare l'aggiunta di tre sporgenze di adenina primaria al prodotto PCR. Eseguire l'amplificazione PCR su un termociclatore utilizzando il programma del ciclo mostrato nel protocollo di testo. Per eseguire la digestione enzimatica, aggiungere due microlitri del tampone di digestione enzimatica alla soluzione PCR.

Aggiungere un microlitro di ciascun enzima di restrizione e mescolare delicatamente. Incubare il campione per 30 minuti a 37 gradi Celsius nel termociclatore, seguiti da cinque minuti a 72 gradi Celsius. Filtrare la soluzione di reazione con un dispositivo di filtraggio centrifugo da 0,2 a 0,5 micron per evitare l'intasamento ed evitare di danneggiare la colonna analitica.

Trasferire il filtrato in una fiala di polipropilene conica e conservare a 20 gradi Celsius fino all'analisi. Preparare una soluzione di esafluoroisopropanolo e trietilammina in un flacone da un litro come descritto nel protocollo di testo. Collegare la bottiglia alla linea A dello strumento di cromatografia liquida, raffreddando la bottiglia utilizzando un frigorifero portatile a raffreddamento diretto per evitare la vaporizzazione.

Collegare un'altra bottiglia piena di metanolo alla linea B.Collegare la colonna di protezione e la colonna analitica allo strumento. Avviare il flusso della fase mobile iniziale per equilibrare le colonne. Se si utilizza uno spettrometro di massa senza software per il controllo della pressione della trappola C, è necessario ridurre la pressione della trappola C controllando manualmente la barra.

Per fare ciò, tirare la manopola per sbloccare e ruotare la manopola in senso antiorario molto lentamente per ridurre la pressione dell'alto vuoto a 1/3. La pressione indicata deve cambiare gradualmente in modo ritardato. Ignorare il messaggio di avviso sulla bassa pressione.

Premere la manopola per bloccarla. Dopo aver impostato la calibrazione, come descritto nel protocollo di testo, avvicinare la sonda di ionizzazione elettrospray riscaldata all'interfaccia dello spettrometro di massa in posizione B.Collegare alla sonda e a una siringa con un tubo. Infondere costantemente il calibrante a una portata di 10 microlitri al minuto utilizzando la pompa a siringa incorporata.

Controllare solo i sei ioni di massa inferiore nella tabella di calibrazione personalizzata. Procedere con la calibrazione dopo che l'intensità dei segnali si è stabilizzata. Dopo la calibrazione, controllare solo i sei ioni di massa superiore e procedere con la calibrazione.

Evitare di calibrare utilizzando tutti gli ioni contemporaneamente per evitare guasti. Spostare la sonda in posizione D per una portata di 0,4 millilitri al minuto e collegarla allo strumento con un tubo metallico inerte. Dopo aver impostato i parametri come descritto nel protocollo di testo, eliminare le bolle toccando il fondo delle fiale.

Posizionare le fiale del campione sul rack per campioni e iniettare un microlitro di campione utilizzando l'autocampionatore per avviare l'analisi. Apri i file di dati grezzi con un software browser e conferma che tutte le acquisizioni sono state completate con successo, compresi i controlli positivi e negativi. Impostare un metodo come descritto nel protocollo di testo, quindi fare clic sul pulsante Esegui nella scheda Esegui cue per avviare il software di deconvoluzione.

Al termine del segnale, selezionare una riga e fare clic su Apri risultato nella didascalia superiore per ottenere i risultati della deconvoluzione. Ecco un tipico cromatogramma a corrente ionica totale ottenuto da un controllo negativo e da un campione di pesce palla. Ogni picco rappresenta un duplex di DNA che viene separato in base alla loro lunghezza.

In questo esempio, si osservano tre picchi del campione di pesce palla. Questi picchi sono il risultato della digestione dell'amplicone utilizzando due endonucleasi. Non sono stati osservati picchi nel campione di controllo negativo.

Ogni picco rappresenta uno spettro di massa che comprende ioni con carica moltiplicata. L'ingrandimento dello spettro di massa consente di notare dozzine di picchi risolti isotopicamente. Questa risoluzione è un requisito per determinare la massa monoisotopica ed è fattibile solo tramite uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

In questo esempio, le masse monoisotopiche del terzo picco sono 16296,7656 e 16468,6616 Dalton. Considerando una tolleranza di massa di tre ppm, i valori misurati sono identici ai valori teorici dei rubripes takifugu come mostrato qui. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno utilizzando strumenti e apparecchi comuni.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come analizzare piccoli ampliconi mediante cromatografia liquida spettrometria di massa ad alta risoluzione per la genotipizzazione. La tecnica può essere applicata nell'analisi di altri polimorfismi del DNA a condizione che la variazione di sequenza si rifletta nei piccoli ampliconi da analizzare. Tuttavia, questa tecnica identifica solo le composizioni di base, la sostituzione di basi all'interno dello stesso mercure non può essere distinta.