Name: Gusto Preferenza Assay per adulti Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: Impara un saggio di ingestione semplice per valutare le preferenze gustative di Drosophila melanogaster verso composti chimici dolci e amari. Questo metodo accessibile aiuta a identificare i geni coinvolti nella selezione del gusto.

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Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Tessier per la lettura critica di questo manoscritto e per gli utili suggerimenti durante la preparazione di questo protocollo.

1. fame <ol><li> Preparare volare fiale fame saturando un batuffolo di cotone con 18,2 MW acqua sul fondo di una fiala mosca standard. In alternativa, allo stesso modo di saturare una piccola striscia di carta da filtro con 18,2 MW acqua e posto in un angolo all&#39;interno della fiala. </li><li> Raccogliere vola in gruppi di circa 100 animali su un rilievo di CO 2 e quindi aggiungere le mosche per una fiala preparato. Nota: i migliori risultati si ottengono con animali che sono meno di 5 giorni. Tuttavia, l&#39;esatta età degli animali può essere controllata come variabile sperimentale per determinare le variazioni di preferenza di gusto nel tempo. </li><li> Utilizzare un batuffolo di cotone o schiuma tappo per fissare le fiale chiuse. Posizionare le fiale dalla loro parte in un incubatore ambiente controllato. Mantenere la temperatura a 25 ° C, e l&#39;umidità superiore al 70%. Lascia fiale intatte per 24 ore. </li></ol> 2. Taste Preferenza Assay <ol><li> Preparare tutti tastants per il saggio lo stesso giorno uns test. Nota: I tastants esatta da utilizzare varia a seconda domanda sperimentale viene chiesto. I seguenti sono esempi di tastants utilizzati in questo protocollo. Vedere la sezione 4 per ottimizzazioni. <ol><li> Preparare il controllo tastant (1 mM saccarosio) mediante la combinazione di 10 ml di 100 mm soluzione di saccarosio, 13 ml di colorante alimentare rosso, e 977 ml di 18,2 MW acqua. </li><li> Preparare tastant sperimentale (5 mm saccarosio) mediante la combinazione di 50 ml di 100 mm soluzione di saccarosio, 10 ml di colorante alimentare blu, e 940 ml di 18,2 MW acqua. </li></ol></li><li> Rendere camere dosaggio usando da 100 mm x 15 mm piatto di plastica standard di petri preparato nel seguente modo: <ol><li> Mettere tre gocce 10 microlitri di controllo tastant più vicino al bordo del piatto a ore 12 e un altro 3 gocce a ore 6. Assicurarsi che la distanza tra gocce è simile. </li><li> Inserire tre gocce 10 microlitri di tastant sperimentale vicina al bordo della piastra a ore 3 e unaltri 3 gocce alle ore 9. Assicurarsi che la distanza tra gocce è simile. </li><li> Ripetere i punti 2.2.1 e 2.2.2 per il numero di repliche, se lo desideri. </li></ol></li><li> Vuoto 1 fiala di ~ 100 mosche di fame su un tappetino di CO 2 giusto il tempo per anestetizzare gli animali (circa 10 sec). Spennellate gli animali in mezzo a una camera di test preparata e coprire con il coperchio piatto. Nota: più lunghi periodi di esposizione CO 2 dovrebbe essere evitato per migliorare i tempi di recupero e l&#39;interferenza con il limite di comportamento alimentare. L&#39;esposizione al ghiaccio (~ 5 min) può essere utilizzato per anestetizzare per evitare di CO 2 effetti comportamentali che possono derivare da un&#39;esposizione limitata. </li><li> Posizionare la camera di test in una scatola di cartone opaco. Assicurarsi di etichettare l&#39;esterno della scatola con la condizione e il genotipo in fase di test. </li><li> Posizionare l&#39;intera impostazione (camera di analisi contenuta in scatola di cartone a partire dal punto 2.4) in un incubatore a 25 ° con almeno il 70% di umidità per 2 ore. </li&gt; <li> Ripetere i passaggi 2.3 tramite 2.5 per tutte le repliche. </li><li> Dopo 2 ore, posizionare le camere di test, ancora contenuti in scatole di cartone, direttamente in un congelatore a -20 ° C fino al momento per la quantificazione. </li></ol> 3. Gusto Preferenza Assay Quantificazione <ol><li> Lasciare una sola camera di test per riscaldare a temperatura ambiente (circa 5 min). </li><li> Sotto un microscopio dissezione, utilizzando un pennello o un paio di pinze, animali di gruppo in base al colore della loro addome: rosso, blu, viola o trasparente (Figura 1). </li><li> Registrare il numero di animali in ciascun gruppo. Considerare gli animali chiare per non hanno partecipato al test e quindi non includerli in tutti i calcoli. </li><li> Calcolare l&#39;indice preferenza, secondo una delle seguenti formule: <ol><li> Se il tastant sperimentale di interesse viene aggiunto il colorante rosso, quindi utilizzare (N + rosso 0,5N viola) / (N + N rosso N purpl blue +e). </li><li> Se il tastant sperimentale viene aggiunto il colorante blu, quindi regolare l&#39;equazione (N blu + 0,5 N viola) / (N + N blu rosso + N viola). </li></ol></li><li> Ripetere i calcoli per tutte le condizioni sperimentali e replicati. </li></ol> 4. Ottimizzazione del Gusto Preferenza Assay <ol><li> Empiricamente determinare la concentrazione di indicatori colorante alimentare per essere utilizzato in modo colorante alimentare non influenza l&#39;esito del test gusto, come segue: <ol><li> Preparare 4 tastants utilizzando la stessa mescola di base (ad esempio, 5 mM saccarosio), come indicato al punto 2.1, ma omettere il colorante alimentare. </li><li> Aggiungere 1,3% colorante alimentare rosso per una delle sostanze sapide. Effettuare le restanti 3 tastants con prodotti alimentari blu coloranti di concentrazioni variabili in ogni tubo (ad esempio 0,6%, 1% e 1,3%). </li><li> protocollo completo passi 2.2 attraverso 3.4 per ogni coppia tastant: 1,3% vs. 0,6% rosso blu; 1,3% rispetto al rosso 1% e il blu1,3% contro 1,3% rosso blu. </li><li> Ripetere il passaggio 4.1.1-4.1.3 con diverse percentuali di colorante alimentare blu fino alle medie indice preferenza un valore pari a 0 (Figura 2). Nota: Come punto di partenza, 1,3% colorante alimentare rosso accoppiato con 1% colorante alimentare blu produce in genere buoni risultati. Se nessuna concentrazione soddisfacente di colorante alimentare blu può essere abbinato al 1,3% di colorante, poi passo 4.1.1 tramite 4.1.3 può essere ripetuta con concentrazioni variabili di colorazione rossa e una costante concentrazione di colorante alimentare blu. </li><li> Analizzare tutte le condizioni per essere testati con le stesse concentrazioni di colorante alimentare ottimizzati. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Herrero, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+fly+behavior+in+response+to+chemosensory+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Fruit fly behavior in response to chemosensory signals.</a> Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).</li>
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<li>French, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+mechanism+for+bitter+avoidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila.</a> J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo descritto un protocollo semplice ma efficace per determinare preferenza di gusto in Drosophila. Le versioni di questo test sono abitualmente utilizzati in esperimenti per determinare i contributi di recettori gustativi (GRS) a percepire le diverse qualità (amaro, dolce, acido, salato e umami) di composti di gusto. Il genoma di Drosophila contiene circa 60 geni che codificano 68 individuati recettori gustativi da splicing alternativo 8,9. Tuttavia, altre proteine ​​come recettori del ...

Gli animali usano chemosensation distinguere condizioni vantaggiose a parte condizioni svantaggiose. Questa percezione può essere fondamentale per cose come determinare la migliore fonte di cibo, evitando sostanze tossiche o determinare il miglior partner di accoppiamento 1. Chemosensation è spesso diviso in due componenti sensoriali: olfatto e sensi gustative. Una principale caratteristica distintiva di questi sensi è che l&#39;olfatto (odore) è usato per campionare l&#39;ambiente chimico gassoso circostante mentre gustation (gusto) richiede il contatto fisico con un substrato non volatile. Entrambe le modalità sensoriali stimolano risposte neurologiche che vengono elaborati e decodificati nel cervello per produrre l&#39;attrattiva o repulsiva comportamento appropriato 2. Questi sensi sono quindi fondamentale per la sopravvivenza degli animali. La mosca della frutta Drosophila melanogaster è un organismo modello che continua a crescere in popolarità per l&#39;uso in capireing come gli insetti percepiscono odore e sapore. Frutta mosche offrono enormi vantaggi rispetto ad altri sistemi modello per la ricchezza di strumenti genetici disponibili per la dissezione di percorsi molecolari, cellulari e comportamentali. Il lavoro nel corso degli ultimi 15 anni è stato particolarmente determinante nel caratterizzare le identità cellulari specifici, recettori neuronali, e meccanismi coinvolti sia in odore e il sapore di segnalazione. Ora, il potere della genetica della Drosophila viene usata per chiarire ulteriormente come questi processi sono codificati al singolo neurone e il circuito unico livello 3-6. Pertanto, le analisi che forniscono facilmente lanciati letture di alterazioni percorsi sensoriali sono di vitale importanza per il continuo avanzamento di questi campi. Mentre molto si sa su come i segnali olfattivi sono codificati ed elaborati nel cervello, e tanto meno è capito su meccanismi simili nel percorso gustativo. Descriviamo qui un protocollo che può essere utilizzato per verificare preferen gustoce in Drosophila. Drosophila, come i mammiferi, in genere preferiscono i composti di degustazione di dolci al contrario di composti sapore amaro. Qualsiasi combinazione di queste fonti di cibo può essere utilizzato in questo progetto sperimentale per determinare come note alterazioni genetiche influenzano la scelta gusto. Inoltre, le strategie di intervento farmacologico può analogamente essere valutati per i loro effetti sulla preferenza di gusto degli animali. La facilità e la flessibilità di questo test lo rende un paradigma utile per comprendere la natura della percezione gustativa in Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Colorante alimentare blu (acqua, glicole propilenico, FD& C Blu 1 e Rosso 40, Propilparabene)</td><td>McCormick</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Scatole crio/congelatrici senza divisori</td><td>Fisher</td><td>03-395-455</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher</td><td>BP2401-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscopio</td><td>W. Nuhsbaum, Inc.</td><td></td><td></td>10446294</tr><tr><td>Piastra di Petri (100 mm x 15 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>Riutilizzabile se accuratamente lavato e asciugato</td></tr><tr><td>Microprovette Quick-Snap</td><td>Alkali Scientific Inc.</td><td>C3017</td><td></td></tr><tr><td>Colorante alimentare rosso (acqua, glicole propilenico, FD& C Rossi 40 e 3, Propilparabene)</td><td>McCormick</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>IBI Scientific</td><td>IB37160</td><td></td></tr></tbody></table>

gusto preferenza assay per adulti<em&gt; drosophila</em

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

La percezione olfattiva e gustativa dell'ambiente è vitale per la sopravvivenza degli animali. L'applicazione più ovvia di questi chemiosensi è quella di essere in grado di distinguere le buone fonti di cibo dalle fonti di cibo potenzialmente pericolose. La gustazione richiede il contatto fisico con un composto chimico che è in grado di segnalare attraverso i recettori del gusto che sono espressi sulla superficie dei neuroni. Negli insetti, questi neuroni gustativi possono essere localizzati in tutto il corpo dell'animale, consentendo al gusto di svolgere un ruolo importante in molti comportamenti diversi. Gli insetti in genere preferiscono composti contenenti zuccheri, mentre vengono evitati i composti considerati dal sapore amaro. Data l'importanza biologica di base del gusto, c'è un intenso interesse per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base di questa modalità sensoriale. Descriviamo un saggio del gusto di Drosophila adulta che riflette la preferenza degli animali per un dato composto tattico. Questo test può essere applicato ad animali di qualsiasi background genetico per esaminare la preferenza gustativa per un composto solubile desiderato.

Alcuni risultati tipici da saggi di preferenza di gusto sono riportati di seguito. Nella maggior parte degli esperimenti qualche variazione di intensità di colorazione addominale sarà visto (Figura 1). Qualsiasi colorazione nell&#39;addome se intensa o debole è considerato un ingestione positivo. E &#39;quindi consigliabile per i ricercatori a segnare animali, mentre ciechi alla condizione sperimentale in modo da limitare i potenziali errori. <p class="jove_content" ...

Il gusto è un importante processo sensoriale che facilita l'attrazione verso sostanze benefiche e l'evitamento di sostanze tossiche. Questo protocollo descrive un semplice saggio di ingestione per determinare la preferenza gustativa della Drosophila per un dato composto chimico.

Gusto Preferenza Assay per adulti<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la preferenza relativa di Drosophila adulte tra un tastante chimico e un altro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del gusto della Drosophila, ad esempio quali geni siano necessari per la selezione tra composti dolci o composti amari potenzialmente tossici.Il principale vantaggio di questa tecnica è che è semplice e non richiede alcuno strumento specializzato. A dimostrare la procedura sarà Andrew Bantel, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare l'esperimento, inumidire una pallina di cotone con acqua nella parte inferiore di un normale vial per moscerini.Successivamente, raccogliere le mosche in gruppi di 100 esemplari su un tappetino a base di CO2 e quindi aggiungerle a una provetta preparata. Utilizzare una palla di cotone per chiudere ermeticamente le provette. Poi, posizionare le provette di lato in un incubatore a condizioni ambientali controllate.Preparare il tastante controllato di saccarosio uno millimolare, combinando 10 microlitri di soluzione di saccarosio 100 millimolare, 13 microlitri di colorante alimentare rosso e 977 microlitri di acqua. Successivamente, preparare il tastante sperimentale di saccarosio cinque millimolare. Quindi, creare le camere di saggio, prendendo una piastra di Petri in plastica da 100 millimetri per 15 millimetri e posizionando gocce da tre microlitri di tastante controllato il più vicino possibile al bordo della piastra alla posizione delle 12 in punto.Alla posizione delle tre, posizionare tre gocce da 10 microlitri di sapido sperimentale il più vicino possibile al bordo della piastra. Posizionare altre tre gocce di sapido di controllo alla posizione delle sei. Successivamente, posizionare altre tre gocce di sapido sperimentale alla posizione delle nove.Successivamente, svuotare un flaconcino contenente 100 moscerini privati di cibo su un tappetino a base di CO2, per il solo tempo necessario ad anestetizzare tutti gli animali. Spazzolare gli animali al centro di una camera per saggio preparata e coprirla con il coperchio della piastra. Posizionare la camera per saggio all'interno di una scatola di cartone opaca.Quindi, etichettare l'esterno della scatola con la condizione e il genotipo in fase di analisi. Spostare l'intero apparato in un incubatore. Dopo due ore, posizionare le camere per il saggio, ancora contenute all'interno delle scatole di cartone, direttamente in un congelatore a meno 20 gradi Celsius, fino al momento della quantificazione.Lasciare che una singola camera dell'assay si riscaldi a temperatura ambiente. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare un pennello per raggruppare gli animali in base al colore dell'addome. Rosso, blu o viola.Registrare il numero di animali in ogni gruppo. Questo grafico mostra gli effetti di diverse concentrazioni di colorante blu, mantenendo costante la concentrazione di colorante rosso, rivelando una combinazione ottimale di 1,3% rosso e 1,0% blu. I Drosophila sono naturalmente attratti da alte concentrazioni di saccarosio, come indicato da un valore di indice di preferenza vicino a uno, quando viene offerta la scelta tra saccarosio a cinque millimolari e saccarosio a un millimolare.Questa preferenza si è invertita con l'acido, che ha ridotto l'indice di preferenza a valori prossimi a zero. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di verificare gli additivi coloranti alimentari: vi sono stati effetti sul saggio di preferenza? Le concentrazioni di ciascun colorante non dovrebbero avere alcun impatto sull'indice di prestazione.

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Larve di Drosophila sono in grado di associare stimoli odore con la ricompensa gustativa. Qui descriviamo un semplice paradigma comportamentale che permette l'analisi di appetitivo apprendimento associativo olfattivo.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Questo video descrive un test di alimentazione per moscerini della frutta in cui il cibo colorato viene utilizzato per monitorare l'alimentazione e l'effetto che i composti aggiunti possono avere sull'attività di alimentazione. Il protocollo di esempio verifica gli effetti di diverse sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino (EDC).

Test di alimentazione: Valutazione delle preferenze alimentari in Drosophila melanogaster

Questo video descrive il saggio delle preferenze gustative, un metodo comportamentale utilizzato per misurare l'attrazione o l'evitamento verso soluzioni colorate che hanno un sapore diverso valutando la colorazione addominale della mosca dopo l'ingestione della sostanza preferita. Il protocollo presentato dimostra la procedura utilizzata per misurare la preferenza dei moscerini verso soluzioni con concentrazioni variabili di saccarosio.

Saggio delle preferenze gustative: un metodo per misurare il comportamento alimentare in Drosophila

Questo video descrive il test CApillary FEeder, o CAFE, un metodo comportamentale che misura l'assunzione di cibo e la preferenza dei moscerini della frutta non frenati. Il protocollo presentato mostra come eseguire il test con un'evaporazione minima dai capillari pieni di liquido utilizzati per erogare il cibo e monitorarne l'assunzione.

Il test CApillary FEeder (CAFE): un metodo per monitorare il consumo e la preferenza alimentare in Drosophila

Le femmine di Drosophila scelgono tra i substrati e selezionano i siti che sono attraenti per la deposizione delle uova. Questo video descrive un test comportamentale che mette alla prova il loro processo decisionale, chiamato saggio delle preferenze di deposizione delle uova. La clip in primo piano mostra la procedura con una configurazione personalizzata, che consente ai ricercatori non solo di testare il comportamento di molte femmine allo stesso tempo, ma è anche compatibile con la...

drosofila Saggio sulle preferenze di deposizione delle uova: un metodo per testare il processo decisionale nelle mosche

In questo articolo video, descriviamo un test automatico per misurare l'effetto della fame o sazietà su olfattiva dipende comportamento di ricerca di cibo nel frutto adulto Drosophila melanogaster.

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in Drosophila

Vi presentiamo un test di scelta per rivelare l'influenza di odoranti sul comportamento Drosophila utilizzando un test Y-labirinto.

Test<em&gt; Drosophila</em&gt; Olfatto con un test Y-maze

Questo protocollo descrive un test ad alto rendimento per testare le preferenze di deposizione delle uova di Drosophila melanogaster alla risoluzione di un singolo animale.  Questo test fornisce una piattaforma semplice, efficiente e scalabile per identificare i geni e i componenti dei circuiti che controllano un semplice processo decisionale.

High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Descriviamo un protocollo per indurre gratificante e nonrewarding esperienze nei moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) utilizzando il consumo di etanolo volontaria come misura per le modifiche negli stati di ricompensa.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Il test CApillary FEeder (CAFE) è un metodo semplice, economico e altamente affidabile per studiare i meccanismi alla base dell'assunzione di cibo. Utilizzato con l'organismo modello genetico altamente versatile Drosophila melanogaster, fornisce un potente mezzo per acquisire nuove informazioni sui meccanismi di regolazione dell'assunzione di cibo.

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Presentiamo un protocollo per un saggio di alimentazione a due scelte per le mosche. Questo test di alimentazione è veloce e facile da eseguire ed è adatto non solo per la ricerca di laboratorio su piccola scala, ma anche per schermi comportamentali ad alta produttività nelle mosche.

Un saggio rapido di preferenza alimentare in Drosophila

Impara un saggio di ingestione semplice per valutare le preferenze gustative di Drosophila melanogaster verso composti chimici dolci e amari. Questo metodo accessibile aiuta a identificare i geni coinvolti nella selezione del gusto.

Gusto Preferenza Assay per adulti

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