Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare i recettori del fattore di crescita a bassa abbondanza negli embrioni di zebrafish combinando la selettività e la sensibilità della marcatura di affinità del recettore scelto dal suo ligando radioattivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nei campi della biologia dello sviluppo, come i livelli di espressione dei recettori e le loro proprietà biochimiche. Questo metodo, che abbiamo soprannominato AFLIP, estende una potente qualità descrittiva della marcatura di affinità, una tecnica di biologia cellulare ben consolidata, agli studi sullo sviluppo del pesce zebra.

Per iniziare questa procedura, raccogli da 100 a 200 embrioni per ogni condizione e mettili in piastre di Petri contenenti acqua di pesce. Quindi decoionare manualmente gli embrioni utilizzando una pinza a punta fine ed evitare l'uso di pronasi o qualsiasi altra proteasi durante il protocollo in quanto potrebbe digerire i recettori mirati. Successivamente, metti gli embrioni in una provetta per microfugo da 1,5 millilitri e lavali due volte con 1X PBS.

Quindi aggiungere 500 microlitri di tampone deyolking. Rilascia la maggior parte del tuorlo pipettando delicatamente gli embrioni nella soluzione su e giù circa 30-40 volte. Per 72 embrioni HPF e 48 HPF, utilizzare rispettivamente puntali per pipette blu e gialli.

Potrebbe essere necessario tagliare leggermente le punte gialle per evitare di distruggere gli embrioni. Il successo del rilascio del tuorlo può essere verificato osservando gli embrioni al microscopio. La rimozione del tuorlo deve essere il più completa possibile poiché i lipidi e le proteine del tuorlo possono interferire con le successive fasi di legame del ligando o degli anticorpi.

Successivamente, raccogli gli embrioni mediante centrifugazione a 600 x g per 15 secondi. Eliminare con cura il surnatante utilizzando una pipetta. Successivamente, lavare gli embrioni due volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio facendoli vorticare delicatamente alla velocità più bassa.

Quindi raccogliere gli embrioni mediante centrifugazione a 600 x g per 15 secondi. Da qui in poi, continuare la procedura a quattro gradi Celsius. Eliminare con cura il surnatante utilizzando una pipetta.

Successivamente, sospendiamo gli embrioni in 350 microlitri di tampone di lisi e li omogeneizziamo utilizzando un pestello di plastica. Quindi incubare gli embrioni lisati per 30 minuti agitando su una provetta a bilanciere a quattro gradi Celsius. Successivamente, centrifugare gli embrioni lisati a 11.000 x g per 15 minuti per rimuovere i detriti insolubili.

Successivamente, trasferire il surnatante chiarificato in una nuova provetta. Determinare la proteina totale mediante il saggio proteico di Bradford e la curva di calibrazione della tracciatura. In questa fase, mettere da 400 a 500 microgrammi di proteine embrionali totali in una provetta da microfugo da 1,5 millilitri e diluirla a un microgrammo per microlitro con tampone 1.

Successivamente, aggiungere il ceppo TGF-beta II marcato con iodio-125 per raggiungere una concentrazione finale di 150 picomolare e incubare agitando su una provetta a bilanciere per due ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere l'anticorpo non diluito contro il recettore di interesse per raggiungere una diluizione di 1:100. Quindi continuare l'incubazione a quattro gradi Celsius per altre due ore o durante la notte.

Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di perle leganti le immunoglobuline adatte e incubare per 50 minuti agitando su un bilanciere in provetta a quattro gradi Celsius. Quindi recuperare le perle mediante microcentrifugazione a 11.000 x g per 20 secondi e gettare il surnatante in un apposito contenitore per rifiuti radioattivi. Successivamente, lavare le perle IP tre volte con un millilitro di tampone di lavaggio IP mediante vortice in microcentrifugazione a 11.000 x g per 20 secondi ogni volta.

Quindi risospendere le perle IP in 250 microlitri di tampone di lavaggio IP. Preparare una soluzione DSS fresca e aggiungerne 1,5 microlitri al campione. Successivamente, incubare il campione per 15 minuti a quattro gradi Celsius con agitazione.

Per estinguere la reazione di reticolazione, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio IP integrato con una quantità sufficiente di cloruro di tryst a pH 7,4 per raggiungere 25 millimolari di cloruro di tryst. Successivamente, centrifugare a 11,00 x g per 20 secondi per raccogliere le perle IP. Successivamente, scartare il surnatante e risospendere le perle IP in 30 microlitri di tampone laemmli riducente.

Successivamente, far bollire il campione a 94 gradi Celsius per cinque minuti prima dell'elettroforesi su gel SDS-PAGE e quindi analizzare i gel essiccati in un fosforimetro o mediante autoradiografia convenzionale. Questa figura mostra i risultati rappresentativi ottenuti con AFLIP. Le proteine totali estratte dagli embrioni a 72 hpf e 48 hpf sono state sottoposte a marcatura di affinità con iodio-125 TGF-beta II seguita da IP con BG anti-zebrafish di coniglio o BG anti-ratto di coniglio come controllo.

Nell'autoradiografia, la glicemia può essere rilevata senza GAG o come glicemia modificata con glicosaminoglicano. Questa figura mostra come l'AFLIP possa essere utilizzato per misurare i livelli di espressione di un dato recettore in embrioni sottoposti a una manipolazione sperimentale, in questo caso, la diminuzione del betaglicano all'iniezione di morfolino. La corsia uno mostra il livello del recettore beta III del TGF in un embrione wild-type da 72 hpf, mentre la corsia due mostra l'effetto della somministrazione di sette nanogrammi di un morfolino diretto al confine dell'esone 2-introne 2 del trascritto primario ZFPG. Si noti che la sottoregolazione BG ottenuta con questo morfolino non viene riprodotta dal suo controllo non corrispondente.

Questi risultati hanno confermato che il fenotipo ottenuto con questo morfinolino era specifico per il knockdown del recettore beta III del TGF, come descritto in precedenza. Il successo di AFLIP per la rilevazione di un fattore di crescita o di recettori per citochine dipende dalla disponibilità di un ligando radiomarcato che può essere legato e reticolato al suo recettore. È necessario anche un buon anticorpo per l'immunoprecipitazione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. Poiché l'AFLIP evita la fase di trasferimento del western blot, consente una maggiore rilevazione dei recettori fortemente glicosilati. E abbiamo visto qui per il proteoglicano betaglicano che si trasferisce in modo molto inefficiente nel western blot Seguendo questa procedura, altri metodi come la digestione enzimatica possono essere eseguiti per descrivere ulteriori modificazioni post-traduzionali purché siano rivelate da tecniche elettroforetiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come AFLIP può aiutarti a rilevare recettori a bassa abbondanza in diversi embrioni di pesce mediante marcatura di affinità legata all'immunoprecipitazione. Infine, non dimenticare che lavorare con lo iodio-125 deve essere fatto con cura e protezione adeguata. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.