Name: Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri la tecnica AFLIP per rilevare recettori di fattori di crescita a bassa abbondanza in embrioni di zebrafish. Questo metodo combina etichettatura di affinità e immunoprecipitazione per studi di biologia dello sviluppo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano Gilberto Morales per la cura e il mantenimento dei pesci, e i dottori Claudia Rivera e Hector Malagòn (IFC-UNAM Animal Facility) per il loro aiuto nell'immunizzazione dei conigli. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di CONACYT 131226 e PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

Tutti gli esperimenti condotti negli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali da laboratorio e l&#39;uso della Università Nazionale Autonoma del Messico (UNAM), con il numero CICUAL-protocollo: FLC40-14. (CICUAL: &quot;Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologia Celular, Universidad Nacional Autonoma de Mexico&quot;). 1. Preparazione di embrioni Protein Extract <ol><li> Raccogliere 100 - 200 embrioni per ogni condizione di confrontare (morphants vs. wild type) allo stadio desiderato, ad esempio 72 ore dopo la fecondazione (HPF). </li><li> Luogo embrioni in piastre di Petri contenenti acqua di pesce (vedi tabella 1) e dechorionate manualmente embrioni utilizzando pinze punta fine. Evitare di utilizzare pronase durante questa fase (o qualsiasi altro proteasi durante il protocollo) come può digerire il recettore bersaglio. </li><li> Luogo embrioni in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e lavare gli embrioni twghiaccio con soluzione tampone 1x fosfato (PBS) (vedi Tabella 1). </li><li> Aggiungere 500 ml di tampone deyolk (vedi tabella 1). </li><li> Rilasciare la maggior parte di tuorlo pipettando gentilmente su e giù (circa 30 - 40 volte) gli embrioni nella soluzione. Per 72 HPF e 48 embrioni HPF utilizzare puntali per pipette blu e giallo, rispettivamente. Giallo suggerimenti possono avere bisogno di essere un po &#39;tagliata per evitare la distruzione di embrioni. Il rilascio tuorlo successo può essere controllato osservando gli embrioni sotto il microscopio. </li><li> Raccogliere gli embrioni per centrifugazione a 600 xg per 15 sec. </li><li> Gettare il surnatante con cura utilizzando una pipetta. </li><li> Embrioni lavare due volte con 500 microlitri tampone di lavaggio (vedi tabella 1) vortex delicatamente a velocità più bassa. </li><li> Raccogliere gli embrioni per centrifugazione a 600 xg per 15 sec. </li><li> A partire da qui, continuare la procedura a 4 ° C. </li><li> Gettare il surnatante con cura utilizzando una pipetta. </li><li> embrioni risospendere in 350 ml di tampone di lisi (vedere Tabella 1) ed omogeneizzare con un pestello in plastica. </li><li> Incubare gli embrioni lisati 30 minuti con agitazione su una sedia a dondolo provetta a 4 ° C. </li><li> Centrifugare lisato embrioni a 11.000 xg per 15 minuti per rimuovere i detriti insolubili. </li><li> Trasferimento cancellata surnatante con una pipetta in una nuova provetta. </li><li> Determinare proteine ​​totali da Metodo di Bradford 4, o altre procedure adatto. Se viene utilizzato saggio Bradford, eseguire la curva di taratura in presenza di concentrazioni equivalenti dei detergenti presenti nel tampone di lisi, in cui possono causare una sottostima della proteina normale 4. </li></ol> 2. Rilevamento di endogena proteina recettore <ol><li> Affinità Etichettatura e Immunoprecipitazione (tutti questi passaggi a 4 ° C) <ol><li> Collocare 400 - 500 mg di proteine ​​totali embrione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e diluire a 1 mg / mL con tampone 1 (vedi Tabella 1). Nota: Al fine di ottenere 500 mg di proteine ​​totali dell&#39;embrione, circa 100-200 embrioni devono essere inizialmente trattati. 72 HPF embrioni di routine resa ~ 5 mg di proteine ​​totali dell&#39;embrione, che è sufficiente per il rilevamento betaglycan. </li><li> Aggiungere un volume sufficiente di TGF-β2 etichettati stock di raggiungere una concentrazione finale di 150 PM e incubare con l&#39;agitazione su una provetta rocker 2 ore a 4 ° C. TGF-β2 deve essere etichettato prima AFLIP viene avviato, con 125 I con il metodo T chloramine come descritto da Cheifetz et al. 5. ATTENZIONE: l&#39;utilizzo di schermatura per ridurre al minimo l&#39;esposizione durante la manipolazione 125 ho etichettato ligando. </li><li> Aggiungere un volume sufficiente di anticorpo non diluito contro il recettore di interesse al fine di raggiungere una diluizione 1: 100 e continuare incubazione per altri 2 ore a 4 ° C (incubazione può essere O / N). Questa è la diluizione ottimale di antisiero # 31, utilizzato in questo studio e descritto altrove 3, ma a seconda della qualità del untibody, una diluizione maggiore o minore può essere ottimale. </li><li> Aggiungere 50 ml di perline vincolanti adatto immunoglobuline (ad esempio, proteina G-Sepharose, precedentemente equilibrata in TNTE e risospeso 1: 5 del suo volume originale in TNTE) e incubare per 50 min sotto agitazione su un bilanciere provetta a 4 ° C. </li><li> Recuperare le perle di microcentrifugation a 11.000 xg per 20 sec. </li><li> Gettare il surnatante in un contenitore di rifiuti radioattivi appropriata. </li><li> Lavare le IP-perle tre volte con 1 ml di tampone di lavaggio IP (vedi Tabella 1), con vortex e microcentrifugation a 11.000 xg per 20 secondi ogni volta. </li><li> Risospendere IP-perline in 250 ml di tampone di lavaggio IP. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di disuccinimidyl suberato (DSS, sciolti in DMSO a 10 mg / ml). Preparare la soluzione DSS appena prima del suo uso in questa fase. </li><li> Incubare per 15 minuti a 4 ° C con agitazione. </li><li> Al fine di placare la reazione di reticolazione, aggiungere 500 microlitri otampone di lavaggio f IP, integrato con abbastanza Tris-Cl pH 7,4 magazzino per raggiungere 25 mM Tris-Cl. I gruppi amminici liberi in Tris catturano DSS che non ha reagito. </li><li> Centrifugare a 11.000 xg per 20 secondi per raccogliere IP-perline e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere IP-perline in 30 ml di ridurre Laemmli buffer. </li><li> campioni bollire 5 min a 94 ° C. </li><li> Opzionalmente, analizzare i campioni in un contatore gamma utilizzando il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Analisi dei campioni <ol><li> campioni oggetto di denaturazione SDS-PAGE. Utilizzare poliacrilammide al percentuale appropriata per la massa del recettore ed eseguire gel secondo la procedura standard. </li><li> Immergere il gel in soluzione fissativo (vedi Tabella 1) per 30 minuti a RT. </li><li> Lavare il gel con acqua distillata per 15 min. </li><li> Mettere il gel in carta da filtro precedentemente idratata e coprire con pellicola involucro di saran. </li><li> gel secco a 80 ° C per 1 ora. </li><li> Esporre il gel su un phosphorimager scre biancoit a RT O / N. </li><li> Scansione schermo esposto utilizzando un phosphorimager utilizzando il protocollo del produttore. </li></ol></li></ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
<li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li>
<li>López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF%CE%B2+signaling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Maccari, F., Volpi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+specific+recognition+of+glycosaminoglycans+by+antibodies+after+their+separation+by+agarose+gel+electrophoresis+and+blotting+on+cetylpyridinium+chloride-treated+nitrocellulose+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes.</a> Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).</li>
<li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li>
<li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li>
<li>Bratthauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avidin-biotin+complex+%28ABC%29+method+and+other+avidin-biotin+binding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).</li>
<li>Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+by+125I-cationized+cytochrome+c+of+proteoglycans+and+glycosaminoglycans+immobilized+on+unmodified+and+on+positively+charged+Nylon+66%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66.</a> Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).</li>
<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li>
<li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li>
<li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li>
<li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;uso di Western blot con un anticorpo specifico contro una proteina di interesse è uno strumento prezioso per studiare la sua espressione 7 durante l&#39;embriogenesi. Tuttavia, immunoblotting di proteine ​​altamente glicosilata, non ha avuto molto successo a causa del loro trasferimento inefficiente e debole legame di nitrocellulosa o PVDF membrane 8,9. I proteoglicani sono un buon esempio di questa lacuna, a causa delle loro catene di glicosaminoglicani (GAG cova...

Il rilevamento specifico delle proteine espresse durante lo sviluppo embrionale è necessario per convalidare i profili di espressione ottenuti misurando i loro mRNA affini con RT-PCR o ibridazione in situ (ISH). Ciò si ottiene comunemente mediante un western blot di estratti di embrioni seguito da una rilevazione con anticorpi specifici. Tuttavia, questo approccio è difficile da applicare alle proteine che sono in abbondanza molto bassa o che hanno proprietà che ostacolano il loro trasferimento quantitativo durante il loro blotting. Il betaglicano, noto anche come recettore del fattore di crescita trasformante di tipo III β (TGF-β) (TGFBR3), è un esempio di queste difficoltà. TGFBR3 è un proteoglicano di membrana part-time che lega il TGF-β attraverso la sua proteina centrale1, con un'affinità notevolmente più elevata per l'isoforma TGF-β2, una proprietà che lo distingue da qualsiasi altra proteina legante il TGF-β2. Il TGFBR3 nel pesce zebra è espresso da 8 hpf in poi, raggiungendo un massimo di 72 hpf, come rilevato dalla RT-PCR del suo mRNA3. 
Tuttavia, nonostante la disponibilità di unanticorpo 3 molto specifico, ogni tentativo di rilevare il suo prodotto tradotto con il western blot si è rivelato infruttuoso. Ritenendo che la natura proteoglicana di TGFBR3, così come la presunta bassa abbondanza, possano essere responsabili di questo fallimento, è stato ideato un metodo di rilevamento, AFLIP, che sfrutta l'elevata affinità di TGFBR3 per TGF-β2. In questo metodo un estratto proteico da embrioni raggruppati è autorizzato a legare specificamente 125TGF-β2 marcati con I e i complessi recettore-ligando vengono purificati mediante immunoprecipitazione e reticolati prima della separazione mediante SDS-PAGE. I modelli di migrazione osservati dall'autoradiografia dei gel hanno rivelato la presenza e la natura delle specie recettoriali marcate. Questo approccio combina la specificità del ligando della marcatura di affinità con l'immunoprecipitazione da parte di anticorpi specifici, aumentando il campo di rivelazione, evitando l'inefficiente blotting di trasferimento di TGFBR3. A causa delle sue proprietà intrinseche, il test AFLIP non è un test quantitativo, ma può essere utilizzato per valutare con sicurezza le differenze sperimentali relative nel recettore analizzato.

<table><tbody><tr><td>Disuccinimidil suberato (DSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>proteina G Sefarosio 4 flusso rapido</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore di gel modello 583&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>Tifone 9400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>Cobra II Auto gamma counter</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exposure Cassette</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH3OH</td><td>J.T. Baker</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH3COOH</td><td>J.T. Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Sea Marine Mix</td><td>Marine Enterprises International</td><td>http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td></tr></tbody></table>

affinità etichettatura rilevazione di endogena recettori da embrioni di zebrafish

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Combinando i poteri dell'Affinity Labeling e della recipiazione Immunop(AFLIP), è stata implementata una tecnica per la rilevazione dei recettori a bassa abbondanza negli embrioni di zebrafish. Questa tecnica sfrutta la selettività e la sensibilità conferite dalla marcatura di affinità di un dato recettore da parte del suo ligando con la specificità dell'immunoprecipitazione. Abbiamo utilizzato AFLIP per rilevare il recettore TGF-β di tipo III (TGFBR3), noto anche come betaglicano, durante lo sviluppo precoce del pesce zebra. AFLIP è stato determinante per convalidare l'efficacia di un fenotipo di pesce zebra morphant TGFBR3. Nella prima fase, vengono preparati estratti di proteine embrionali che vengono utilizzati per generare 125complessi I-TGF-β2-TGFBR3 che vengono purificati mediante immunoprecipitazione. Successivamente, questi complessi vengono reticolati in modo covalente e rivelati utilizzando la separazione SDS-PAGE e il rilevamento autoradiografico. Questa tecnica richiede la disponibilità di un ligando marcato per il recettore e di un anticorpo specifico contro il recettore e deve essere facilmente adattata per identificare qualsiasi fattore di crescita o recettore delle citochine che soddisfi questi requisiti.

La figura 1 mostra un risultato rappresentativo ottenuto con AFLIP. Segnali in corsia 1 provengono dalla 125 I-ligando covalentemente legati sia alla zebrafish proteina betaglycan nucleo (core BG, al di sotto del marcatore 150 kDa), o il nucleo BG che è stato elaborato nella sua forma proteoglicani dall&#39;attaccamento di glicosaminoglicani (GAG, striscio vanno da 170 kDa all&#39;inizio del gel). Questo modello di migrazione, una proteina nucleo tagliente più...

Viene descritta una nuova tecnica per la rilevazione dei recettori endogeni a bassa abbondanza presenti negli embrioni di zebrafish. L'abbiamo chiamato AFLIP perché consiste nell'etichettatura di affinità del recettore da parte del suo ligando legato all'immunoprecipitazione.

Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è rilevare recettori per fattori di crescita a bassa abbondanza negli embrioni di pesce zebra combinando la selettività e la sensibilità dell'etichettatura per affinità del recettorio scelto mediante il suo ligando radioattivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo della biologia dello sviluppo, come i livelli di espressione dei recettori e le loro proprietà biochimiche. Questo metodo, che abbiamo soprannominato AFLIP, estende le potenti caratteristiche descrittive dell'etichettatura per affinità, una tecnica ben consolidata di biologia cellulare, agli studi sullo sviluppo del pesce zebra.Per iniziare questa procedura, raccogliere da 100 a 200 embrioni per ogni condizione e posizionarli in piatti di Petri contenenti acqua per pesci. Quindi, rimuovere manualmente le corioniche utilizzando pinzette a punta fine ed evitare l'uso di pronasi o qualsiasi altra proteasi durante tutto il protocollo, poiché potrebbe digerire i recettori bersaglio. Successivamente, posizionare gli embrioni in una provetta microfuge da 1,5 mL e lavarli due volte con PBS 1X.Quindi aggiungere 500 microlitri di buffer deconjugante. Rimuovere la maggior parte del tuorlo pipettando delicatamente gli embrioni nella soluzione su e giù per circa 30-40 volte. Per gli embrioni a 72 HPF e 48 HPF, utilizzare rispettivamente punte di pipetta blu e gialle.Punte gialle potrebbero dover essere tagliate leggermente per evitare di danneggiare gli embrioni. Un rilascio efficace del tuorlo può essere verificato osservando gli embrioni al microscopio. La rimozione del tuorlo deve essere il più completa possibile poiché i lipidi e le proteine del tuorlo potrebbero interferire con i successivi passaggi di legame di ligandi o anticorpi.In seguito, raccogliere gli embrioni mediante centrifugazione a 600 x g per 15 secondi. Rimuovere con attenzione il soprannatante utilizzando una pipetta. Successivamente, lavare gli embrioni due volte con 500 microlitri di buffer di lavaggio, agitandoli delicatamente al minimo regime di vortex.Quindi raccogliere gli embrioni mediante centrifugazione a 600 x g per 15 secondi. Da questo punto in poi, proseguire la procedura a quattro gradi Celsius. Rimuovere con attenzione il soprannatante utilizzando una pipetta.In seguito, sospendiamo gli embrioni in 350 microlitri di buffer di lisi ed eseguiamo l'omogeneizzazione utilizzando un pestello di plastica. Quindi, incubiamo gli embrioni lisati per 30 minuti con agitazione su un agitatore per provette a 4 gradi Celsius. Successivamente, centrifughiamo gli embrioni lisati a 11.000 x g per 15 minuti al fine di rimuovere i detriti insolubili.In seguito, trasferire il surnatante chiarificato in un tubo nuovo. Determinare la proteina totale mediante il saggio proteico di Bradford e tracciare la curva di calibrazione. In questo passaggio, collocare da 400 a 500 microgrammi di proteina totale dell'embrione in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e diluire fino a una concentrazione di un microgrammo per microlitro con il buffer 1.Successivamente, aggiungere il reagente marcato con Iodio-125 TGF-beta II stock per raggiungere una concentrazione finale di 150 picomolare e incubare sotto agitazione su un agitatore per provette per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo questo passaggio, aggiungere l'anticorpo non diluito contro il recettore di interesse in modo da ottenere una diluizione 1:100. Proseguire quindi l'incubazione a quattro gradi Celsius per altre due ore o durante la notte.Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di perle leganti immunoglobuline appropriate e incubare per 50 minuti con agitazione su un agitatore per provette a quattro gradi Celsius. Recuperare quindi le perle mediante microcentrifugazione a 11.000 x g per 20 secondi e scartare il soprannatante in un apposito contenitore per rifiuti radioattivi. Successivamente, lavare le perle di immunoprecipitazione tre volte con un millilitro di buffer di lavaggio per immunoprecipitazione, agitando con vortice e microcentrifugando a 11.000 x g per 20 secondi ogni volta.Sospendere quindi i microperline di IP in 250 microlitri di tampone di lavaggio per l'IP. Preparare una soluzione fresca di DSS e aggiungere 1,5 microlitri al campione. Successivamente, incubare il campione per 15 minuti a quattro gradi Celsius con agitazione.Per bloccare la reazione di cross-linking, aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio IP integrato con quantità sufficiente di soluzione stock di tryst cloruro a pH 7,4 da raggiungere una concentrazione finale di 25 millimoli di tryst cloruro. Successivamente, centrifugare a 11.000 x g per 20 secondi per raccogliere le perline di IP. Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere le perline di IP in 30 microlitri di buffer riducente di Laemmli.Successivamente, far bollire il campione a 94 gradi Celsius per cinque minuti prima dell'elettroforesi su gel SDS-PAGE, quindi analizzare i gel essiccati mediante fosforimetria o autoradiografia convenzionale. Questa figura mostra i risultati rappresentativi ottenuti con AFLIP. Le proteine totali estratte dagli embrioni a 72 hpf e 48 hpf sono state sottoposte a marcatura di affinità con iodio-125 TGF-beta II, seguita da immunoprecipitazione con anticorpo policlonale anti-zebrafish BG o con anticorpo policlonale anti-ratto BG come controllo.Nell'autoradiografia, il BG può essere rilevato senza GAG o come BG modificato da glicosaminoglicano. Questa figura mostra come AFLIP possa essere utilizzato per valutare i livelli di espressione di un recettore specifico in embrioni sottoposti a una manipolazione sperimentale, in questo caso, la riduzione del betaglicano mediante iniezione di morpholino. La corsia uno mostra il livello del recettore TGF beta III in un embrione wild-type a 72 hpf, mentre la corsia due mostra l'effetto dell'amministrazione di sette nanogrammi di un morpholino diretto al confine tra l'esone 2 e l'introne 2 del trascritto primario ZFPG. Si noti che la riduzione del BG ottenuta con questo morpholino non viene riprodotta dal suo controllo mismatchato.Questi risultati hanno confermato che il fenotipo ottenuto con questo morpholino era specifico per l'abbattimento del recettore TGF beta III, come descritto in precedenza. Il successo di AFLIP nel rilevare recettori di fattori di crescita o citochine dipende dalla disponibilità di un ligando radioetichettato che possa legarsi e cross-linkarsi al proprio recettore. È inoltre necessario disporre di un buon anticorpo per l'immunoprecipitazione.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se effettuata correttamente. Poiché AFLIP evita il passaggio di trasferimento del western blot, consente una rilevazione migliorata di recettori fortemente glicosilati. Abbiamo osservato qui il proteoglicano betaglicano, che si trasferisce in modo molto inefficiente nel western blot. Dopo questa procedura, altri metodi come la digestione enzimatica possono essere eseguiti al fine di descrivere ulteriori modifiche post-traduzionali, purché queste siano rivelate da tecniche elettroforetiche.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come AFLIP possa aiutarti a rilevare recettori poco abbondanti in diversi embrioni di pesce mediante etichettatura per affinità abbinata a immunoprecipitazione. Infine, ricorda che il lavoro con Iodio-125 deve essere eseguito con attenzione e con adeguate protezioni. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.

affinity-labeling-detection-endogenous-receptors-from-zebrafish

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. Descriviamo qui una tecnica per l'etichettatura di singole cellule o piccoli gruppi di cellule in embrioni di zebrafish intero con membrana mirati proteina verde fluorescente.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Questo protocollo delinea un modo per etichettare e tracciare il destino dei piccoli gruppi di cellule di embrioni di zebrafish con UV-uncaging della fluoresceina in gabbia, seguita da montare tutto immunomarcatura per amplificare il segnale proveniente dal fluoresceina Uncaged.

Etichettatura stirpe di cellule Zebrafish con laser Uncagable Fluoresceina Destrano

Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

Questo video mostra un test di captazione degli anticorpi per visualizzare la segnalazione Notch/DeltaD nei progenitori della glia radiale del pesce zebra. Prevede il montaggio di embrioni di pesce zebra dechorionati inclusi in agarosio, l'iniezione di una soluzione colorante mirata ai ligandi DeltaD sugli RGP e l'imaging al microscopio a fluorescenza per la divisione cellulare asimmetrica che conferma l'attivazione della segnalazione Notch/DeltaD.

Un saggio di captazione degli anticorpi per l'imaging della segnalazione Notch/DeltaD nei progenitori della glia radiale del pesce zebra

Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

L'embrione zebrafish è un ottimo modello per la ricerca biologia dello sviluppo. Durante l'embriogenesi, zebrafish sviluppare con una massa tuorlo, che presenta sfide tridimensionali per l'osservazione e l'analisi del campione. Questo protocollo descrive come creare bidimensionali montaggio preparazioni semplici di tutto il monte in situ (WISH) colorati esemplari embrioni di zebrafish.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Questo protocollo dimostra l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.

Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione

Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l'ibridazione in situ e l'immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c'è una scarsità di anticorpi.

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

Questo lavoro sviluppa un saggio di assorbimento degli anticorpi per l'imaging della segnalazione Notch/DeltaD intra-lineage nella divisione dei progenitori della glia radiale del cervello embrionale del pesce zebra.

Saggio di assorbimento degli anticorpi per il monitoraggio dell'endocitosi notch/delta durante la divisione asimmetrica dei progenitori della glia radiale del pesce zebra

Qui, presentiamo un protocollo per marcare le proteine con un tag proteico di fluorescenza nelle larve di zebrafish, un sistema in vivo recentemente sviluppato e modificato particolarmente utile per visualizzare le proteine a bassa abbondanza nel zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Scopri la tecnica AFLIP per rilevare recettori di fattori di crescita a bassa abbondanza in embrioni di zebrafish. Questo metodo combina etichettatura di affinità e immunoprecipitazione per studi di biologia dello sviluppo.

Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish

Esplora altri video