Name: Preparazione dei campioni MALDI omogenei per applicazioni quantitative (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Impara a preparare campioni MALDI omogenei per spettrometria di massa analitica. Questo metodo controlla l'essiccazione e i flussi idrodinamici per ridurre l'eterogeneità spaziale dei segnali ionici e migliorare l'affidabilità quantitativa dei risultati.

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Questo lavoro è supportato dal Centro di Ricerca Genomica, dall'Academia Sinica e dal Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan, Repubblica di Cina (Contratto n. 104-2119-M-001-014).

NOTA: Questo protocollo è sviluppato per ridurre l&#39;eterogeneità spaziale maltotrioso e bradichinina frammento (1-7) preparato con il metodo essiccati gocciolina. Il protocollo consiste di tre fasi principali, compresa la preparazione e precondizionamento, la deposizione del campione e l&#39;essiccazione, e l&#39;analisi dei dati di spettrometria di massa. Le procedure sono delineati e descritti più in dettaglio qui di seguito: 1. Preparazione e precondizionamento <ol><li> Pulizia del piatto del campione <ol><li> Indossare guanti di nitrile e mano-lavare delicatamente la piastra campione con detergente e acqua distillata-deionizzata (DDW). </li><li> Lavare il piatto del campione con metanolo (MeOH) e DDW. </li><li> Inserire la piastra campione in un becher da ml 600 e riempire con DDW. </li><li> Sonicare piatto del campione in DDW per 15 minuti in un bagno a ultrasuoni (200 W, 40 kHz). </li><li> Rimuovere DDW dal bicchiere e riempire il bicchiere con MeOH. </li><li> Sonicare piatto del campione in MeOH per 15 minuti in bagno ad ultrasuoni (200 W, 40 kHz). </li><li> Soffiare via le gocce di solvente sul piatto con gas azoto e mantenere la piastra campione asciutto prima deposizione del campione. </li></ol></li><li> Regolazione della temperatura di asciugatura Camera NOTA:. La camera di essiccazione è un 35 x 20 x 45 cm 3 (L x P x A) camera di acrilico La figura 1 mostra l&#39;immagine di questo sistema di asciugatura. La camera è pulita con temperatura ambiente azoto gassoso attraverso un misuratore di flusso di gas ad una portata costante per mantenere una condizione di bassa umidità relativa monitorata da un igrometro calibrato installato all&#39;interno della camera di essiccazione. Un blocco base di rame nella camera di essiccazione dotato di una costante circolatore dell&#39;acqua temperatura programmata Serve per targhe di esempio in acciaio inox. Il blocco base in rame è in grado di regolare la temperatura della piastra del campione da 5 a 25 ° C. Le temperature dell&#39;aria, blocco base di rame, e la piastra sono controllate da K-termocoppie. <ol><li> Aprire la porta e rapidamente mettere piatto del campione sul rameblocco di base quindi chiudere la porta. </li><li> Regolare manualmente il misuratore di portata di gas per impostare il flusso di azoto a 10 piedi cubi standard per ora (SCFH). </li><li> Monitorare l&#39;umidità relativa nella camera di essiccazione dal igrometro e calibrare il misuratore di portata di gas per assicurare l&#39;umidità relativa è sempre inferiore al 25%. </li><li> Monitorare la temperatura del piatto del campione mediante termocoppie di tipo K e regolare manualmente la temperatura dell&#39;acqua circolatore finché la piastra campione raggiunge 5 ° C per esperimento oa temperatura ambiente (25 ° C) per il controllo. NOTA: Al fine di stabilizzare il piatto del campione ad una temperatura progettato, la temperatura dell&#39;acqua circolatore è in genere impostato tra 0 e 5 ° C inferiore rispetto al campione progettato. Ad esempio, per mantenere 5 ° C al piatto del campione, la temperatura del circolatore acqua è nell&#39;intervallo da 0 a 2 ° C; per mantenere la piastra di campione a 25 ° C, la temperatura del circolatore acqua è nell&#39;intervallo da 23 a 25 ° C. </li><li> Assicurarsi che le temperature richieste e l&#39;umidità relativa vengono raggiunti (Tabella 1) prima della deposizione del campione. NOTA: Tutti i parametri ei loro valori di regolazione per i processi di essiccazione a temperature diverse piastre campione sono riportati in Tabella 1. NOTA: A bassa temperatura piatto del campione, condensa sulla piastra campione può verificarsi se la porta della camera aperta per lungo tempo. In caso di condensa di acqua, chiudere la porta e NON depositare qualsiasi campione su di esso fino a quando la formazione di condensa è asciugata. </li></ol></li><li> Preparazione di Matrix e Analita Solutions <ol><li> Preparazione delle soluzioni matrice <ol><li> Preparare 0,1 soluzione M THAP con il 50% acetonitrile (ACN): 50% soluzione acquosa DDW. </li></ol></li><li> Preparazione di analiti <ol><li> Preparare 10 -4 soluzione maltotriosio M con DDW. </li><li> Preparare 10 -5 M frammento bradichinina (1-7) soluzione nel 50% acetonitrile(ACS): 50% soluzione acquosa DDW. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Deposizione del campione e asciugatura <ol><li> Premix 0,25 ml di soluzione di THAP 0,1 M e 0,25 ml di 10 -4 M maltotriosio o 10 -5 M frammento bradichinina (1-7) soluzioni in una provetta. </li><li> Agitare la soluzione mista per 3 sec. </li><li> Centrifugare la soluzione mista per 2 sec (2.000 xg) per raccogliere la soluzione al fondo della provetta. </li><li> Aprire la porta della camera di essiccazione, accuratamente depositare 0,1 ml di soluzione sul piatto del campione con pipetta e chiudere immediatamente la porta. </li><li> Attendere che la goccia del campione si asciughi. . NOTA: I tempi di essiccazione tipicamente osservati con differenti temperature piatto del campione sono elencati nella tabella 1 per la temperatura della piastra campione di 5 ° C, il tempo medio di asciugatura è di 800 a 1.000 sec; per temperatura della piastra campione di 25 ° C, il tempo medio di essiccazione è da 100 a 150 sec. </li><li> Dopo l&#39;essiccazione, aprire la porta della camera di essiccazione. </li><li> Impostare la temperatura dell&#39;acqua circolatore a temperatura ambiente (25 ° C). NOTA: Saltare questo punto se la piastra campione viene mantenuta costantemente a temperatura ambiente (25 ° C) durante il processo di essiccazione. </li><li> Dopo la temperatura della piastra campione ritorni a temperatura ambiente (25 ° C), rimuovere la piastra campione dalla camera di essiccazione. </li><li> Esaminare la morfologia del campione allo stereomicroscopio 5X e prendere l&#39;immagine in campo chiaro un&#39;istantanea. NOTA: Se le morfologie cristalline non sono come previsto, è necessario preparare un nuovo campione con la stessa procedura. Morfologie cristalline tipiche sono illustrate nei pannelli superiori della figura 2. NOTA: Nei casi con temperature piastra campione basse, ad esempio 5 ° C, è importante riscaldare il piatto del campione a temperatura ambiente, mette fuori dalla camera di essiccazione. All&#39;atto del deposito dei campioni, non mantenere la solutio premiscelaton nella punta della pipetta di oltre 10 secondi. NON usare di nuovo la soluzione premiscelata dopo aver depositato i campioni. I pannelli superiori della figura 2 mostrano immagini in campo chiaro di campioni preparati con diverse temperature della piastra del campione. </li></ol> Analisi 3. Spettrometria di massa dei dati <ol><li> Spettrometria di Massa Data Acquisition NOTA: Dopo la preparazione, il campione può essere analizzato utilizzando la spettrometria di massa imaging. Nel corso di studio, gli esperimenti di imaging MS sono condotti utilizzando un sincronizzato TOF doppia polarità laboratorio integrato (DP-TOF) spettrometro di massa di imaging. 15 Commercial MALDI-TOF spettrometri di massa con capacità di imaging sono adatti a tali esperimenti anche. Lo spettrometro di massa è gestito in estrazione lineare e modalità di ioni positivi con ritardi di estrazione ottimizzate. L&#39;energia cinetica degli ioni è di 20 kV. La dimensione del fascio laser è di 35 micron di diametro sulla superficie del campione, e lo spettro di ogni punto è la avela rabbia di 5 colpi laser. <ol><li> Inserire la piastra del campione nello spettrometro di massa MALDI. </li><li> Eseguire l&#39;imaging spettrometria di massa per il campione preparato nei passaggi 2.1-2.9. </li><li> Selezionare un picco di massa caratteristica dall&#39;elenco di massa mostrato nella finestra dei risultati e fare clic su &quot;2D&quot; per tracciare un&#39;immagine ioni bidimensionale. NOTA: Per maltotriosio mescolato con THAP, i picchi caratteristici sono sodiated maltotriosio, THAP protonata e sodiated THAP. Per frammento bradichinina (1-7) miscelato con THAP, i picchi caratteristici comprendono protonati frammento bradichinina (1-7), protonata THAP, e sodiated THAP. </li><li> Fare clic sui pulsanti di regolazione nella finestra pop-up per determinare i limiti superiore e inferiore della intensità del segnale e fare clic su &quot;salvare un&#39;immagine&quot;. Questa impostazione definisce il contrasto delle immagini di ioni. NOTA: in ogni set individuale dei dati, le regioni e le macchie screpolate nulli mostrano bassa luminosità sono eliminati. </li><li> Osservare e confrontare lo ioneimmagine l&#39;immagine in campo chiaro che è stata presa al punto 2.9 con. NOTA: imaging con spettrometria di massa e costruzione di immagini di particolari ioni può essere realizzato con strumenti commerciali. A causa della varietà di acquisizione dati e software di analisi, gli utenti devono seguire le istruzioni software forniti dal fornitore dello strumento per ottenere immagini di alta qualità. </li></ol></li><li> Analisi dei dati NOTA: L&#39;eterogeneità dei campioni viene analizzato quantitativamente. In questa dimostrazione, ogni campione viene diviso in più zone concentriche di software sviluppati internamente per analizzare la distribuzione spaziale degli ioni. L&#39;analisi può essere eseguita anche utilizzando software di analisi dati stand-alone. <ol><li> Clicca i punti nulli e le regioni incrinate l&#39;immagine di ioni mostrata nella finestra dei risultati in per rimuovere aree non importanti. NOTA: Questa procedura definisce l&#39;area essenziale dell&#39;immagine ionico. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;edge trovare&quot; per trovare strato esterno dell&#39;immagine di ioni. </li><li> Fai clic su &quot;dedurre&quot; per salvare le informazioni ioni abbondanza dello strato esterno in un database e rimuovere questo strato dall&#39;immagine ioni contemporaneamente. Una casella di controllo che rappresenta questo strato più esterno apparirà nel &quot;dati di uscita&quot; lista della finestra dei risultati. </li><li> Ripetere i punti 3.2.2 e 3.2.3 fino viene definito il centro dell&#39;immagine ione. </li><li> Fare clic e selezionare tutte le caselle di controllo nella lista &quot;dati di uscita&quot; e fare clic su &quot;Esporta&quot; per esportare i dati. </li><li> Aprire i dati esportati utilizzando il software foglio di calcolo per calcolare l&#39;abbondanza media di ioni di ogni livello per ottenere le informazioni distribuzione spaziale degli ioni. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10000+Daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons.</a> Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velocity+Distributions+of+Intact+High+Mass+Polypeptide+Molecule+Ions+Produced+by+Matrix+Assisted+Laser+Desorption%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption.</a> Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).</li>
<li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).</li>
<li>Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Photoionization+and+Photochemistry+in+Ionization+Processes+of+Organic-Molecules+and+Relevance+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).</li>
<li>Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C5-Dihydroxybenzoic+Acid+-+a+New+Matrix+for+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom.+Ion+Process%22%5BJournal%5D)">2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+of+a+Sessile+Droplet+on+a+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).</li>
<li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Flow+as+the+Cause+of+Ring+Stains+from+Dried+Liquid+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li>
<li>Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee-Ring+Effects+in+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Tissue+Analysis+Using+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%3A+Practical+Aspects+of+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marangoni+Effect+Reverses+Coffee-Ring+Depositions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Formation+During+the+Evaporation+of+a+Colloidal+Nanoliter+Drop%3A+A+Numerical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study.</a> New J. Phys. 11, 075020(2009).</li>
<li>Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyancy+and+Marangoni+Effects+in+an+Evaporating+Drop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thermophys+Heat+Tr%22%5BJournal%5D)">Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop.</a> J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).</li>
<li>Probstein, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aProbstein%2C+RF+%22Surface+Tension.+in+Physicochemical+Hydrodynamics+%3A+An+Introduction%22">Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction</a>. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).</li>
<li>Lai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).</li>
<li>Hsiao, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Molecular+Imaging+of+Photolabile+Surface+Samples+with+Synchronized+Dual-Polarity+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).</li>
<li>Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Resolution+and+Very+High-Sensitivity+in+MALDI+TOF+of+Matrix+Surfaces+Made+by+Fast+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation.</a> Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Segregation+as+the+Major+Cause+for+Sample+Inhomogeneity+in+MALDI+Dried+Droplet+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).</li>
<li>Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Evaporating+Complex+Fluids+through+Electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting.</a> Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Sulla base di precedenti previsioni teoriche, temperatura indotta flussi idrodinamici all&#39;interno gocce possono superare verso l&#39;esterno flussi capillari indotte da evaporazione del solvente. L&#39;efficacia di tale ricircolo interno delle molecole è maggiore quando la temperatura gradienti di un aumento gocciolina. Secondo i risultati previsti, quando mantenendo la temperatura della piastra campione sotto 5 ° C, mantenendo l&#39;ambiente circostante a temperatura ambiente, la velocità media dei flussi di ricirc...

La spettrometria di massa (MS) è una delle tecniche analitiche più importanti per analizzare le composizioni molecolari di campioni complessi. Tra tutti i metodi di ionizzazione utilizzati nella MS, il desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) è il metodo più sensibile e ampiamente utilizzato nelle applicazioni bioanalitiche. 1 Rispetto ad altre tecniche di ionizzazione, MALDI ha la massima sensibilità e un'elevata tolleranza ai contaminanti salini. Tali proprietà analitiche rendono MALDI la prima scelta per l'analisi dei carboidrati e per molte applicazioni di proteomica. Tuttavia, la preparazione del campione è un passaggio cruciale per ottenere dati di alta qualità in MALDI-MS.
Il metodo di preparazione del campione più comunemente usato per MALDI-MS è il metodo delle goccioline essiccate, in cui le goccioline del campione vengono depositate su una superficie ed essiccate in condizioni ambientali. Questo metodo di essiccazione è semplice e generalmente efficace. 2-5 Tuttavia, un problema comune nel metodo delle goccioline essiccate è che i cristalli di analita/matrice risultanti normalmente si distribuiscono in modo irregolare. In molti casi, i cristalli si aggregano alla periferia delle aree del campione, provocando la cosiddetta formazione di macchie ad anello. 6-8 Le morfologie eterogenee dei cristalli influenzano la distribuzione spaziale delle molecole dell'analita, con conseguente forte fluttuazione del segnale ionico sulle aree del campione. Tali forti fluttuazioni del segnale e scarsa riproducibilità dei dati sono note come il problema del "punto debole" nella MALDI-MS. 9 Pertanto, vi è una grande necessità di ridurre le eterogeneità spaziali nelle applicazioni di goccioline essiccate MALDI-MS.
I flussi idrodinamici nella gocciolina del campione giocano un ruolo importante nel determinare la distribuzione spaziale dei campioni preparati con il metodo delle goccioline essiccate. 10-12 È stato riscontrato che l'evaporazione del solvente induce flussi capillari verso l'esterno all'interno delle goccioline, che sono responsabili della formazione della colorazione anulare. 7,10 Al contrario, i flussi di ricircolo indotti da gradienti tangenziali di tensione superficiale possono controbilanciare i flussi capillari verso l'esterno. 13 Se le velocità del flusso di ricircolo sono superiori a quelle dei flussi capillari verso l'esterno, i campioni possono essere ridistribuiti in modo efficiente per ridurre il problema dell'eterogeneità. 14
In questo lavoro, dimostriamo un protocollo dettagliato per la preparazione di campioni con una semplice camera di essiccazione per indurre flussi di ricircolo efficienti durante i processi di essiccazione delle goccioline. Le condizioni di essiccazione delle gocce sono controllate con precisione, comprese le temperature della piastra del campione e dell'ambiente circostante e l'umidità relativa all'interno della camera. Gli analiti modello includono la catena maltotriosio e bradichinina (1-7). La matrice utilizzata per la dimostrazione è il 2,4,6-triidrossiacetofenone (THAP). I campioni vengono esaminati con MS a tempo di volo (TOF) e i dati vengono analizzati quantitativamente per mostrare la riduzione dell'eterogeneità.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detersivo in polvere</td><td>Alconox</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-triidrossiacetofenone (THAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T64602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Frammento di bradichinina (1-7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1651</td><td></td></tr><tr><td>Maltotriosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47884</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette</td><td>Mettler Toledo</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q sistema</td><td>Millipore</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>Guanti in nitrile senza polvere</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>Becher da 600 ml</td><td>Duran</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>Delta</td><td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>Igrometro</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Flussimetro per azoto gassoso</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>K-type termocoppie</td><td>Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Seleziona BioProdotti</td><td>Force Mini&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>Spettromicroscopio Rainin</td><td>pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Camera di essiccazione a temperatura controllabile</td><td>questo laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa sincronizzato a doppia polarità per immagini a tempo di volo (DP-TOF IMS)</td><td>questo laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF target del campione in acciaio inossidabile</td> questo <td>laboratorio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione dei campioni maldi omogenei per applicazioni quantitative

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

Questo protocollo dimostra una semplice preparazione del campione per ridurre l'eterogeneità spaziale nei segnali ionici durante la spettrometria di massa MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization). L'eterogeneità dei segnali ionici è un grave problema in MALDI, che si traduce in una scarsa riproducibilità dei dati e rende MALDI inadatto per l'analisi quantitativa. Regolando la temperatura della piastra del campione durante la preparazione del campione, i flussi idrodinamici indotti termicamente all'interno delle goccioline della soluzione del campione sono in grado di ridurre il problema dell'eterogeneità. Una camera di preparazione del campione a temperatura ambiente dotata di un blocco di base in rame a temperatura regolata che contiene le piastre per campioni MALDI facilita il controllo preciso delle condizioni di essiccazione del campione. Dopo l'essiccazione delle goccioline del campione, la temperatura delle piastre del campione viene riportata a temperatura ambiente e rimossa dalla camera per la successiva analisi spettrometrica di massa. Le aree dei campioni vengono esaminate con la spettrometria di massa MALDI-imaging per ottenere la distribuzione spaziale di tutti i componenti del campione. Rispetto al metodo convenzionale a goccioline essiccate che prepara i campioni in condizioni ambientali senza controllo della temperatura, i campioni preparati con il metodo qui dimostrato mostrano una distribuzione spaziale e un'intensità del segnale significativamente migliori. Secondo le osservazioni effettuate su campioni di carboidrati e peptidi, la diminuzione della temperatura del substrato mantenendo l'ambiente circostante a temperatura ambiente durante il processo di essiccazione può ridurre efficacemente l'eterogeneità dei segnali ionici. Questo metodo è generalmente applicabile a varie combinazioni di campioni e matrici.

Le immagini in campo chiaro e le immagini MS di maltotrioso e bradichinina frammento (1-7) preparato con temperatura della piastra campione di 5 e 25 ° C sono mostrati in Figura 1. Nel caso di maltotriosio sodiated, il segnale ione principalmente popola alla periferia dell&#39;area campione quando viene preparato con una temperatura della piastra campione di 25 ° C. Diminuendo la temperatura della piastra del campione a 5 ° C, il segnale popola omogeneamente su tutta la ...

Lo dimostra un protocollo per la riduzione eterogeneità spaziali di segnali di ioni in spettrometria di massa MALDI regolando la temperatura del substrato durante i processi di essiccazione del campione.

Preparazione dei campioni MALDI omogenei per applicazioni quantitative

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization ...

L'obiettivo generale di questo metodo di preparazione del campione per la spettrometria di massa MALDI è ridurre l'eterogeneità spaziale nei segnali ionici durante l'analisi MALDI MS. È stato realizzato un ambiente di essiccazione ben controllato per ottimizzare il metodo tradizionale della goccia essiccata, manipolando i flussi idrodinamici all'interno della goccia del campione durante il processo di essiccazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'eterogeneità spaziale dei segnali ionici per i campioni preparati mediante il metodo della goccia essiccata ottimizzato può essere efficacemente ridotta. Questo metodo può fornire campioni omogenei per il sistema metrico THAP.Si può applicare anche ad altri sistemi metrici, come l'acido alfa-ciano-4-idrossicinnamico. In generale, le persone nuove a questo metodo hanno avuto difficoltà perché controllare le condizioni di essiccazione non è facile. Per iniziare questa procedura, aprire la porta di una camera di essiccazione e posizionare immediatamente una piastra campione precedentemente pulita sul blocco a base di rame.Quindi, chiudere la porta. Regolare manualmente il flussimetro del gas per impostare la portata di azoto a 10 piedi cubi standard all'ora. Successivamente, regolare con precisione il flussimetro del gas per garantire che l'umidità relativa sia sempre inferiore al 25% nella camera di essiccazione, come misurato da un igrometro.Utilizzando termocoppie di tipo K per monitorare la temperatura, regolare manualmente la temperatura del circolatore d'acqua finché la piastra del campione non raggiunge i 5 gradi Celsius per l'esperimento. Assicurarsi che siano raggiunte le temperature richieste e l'umidità relativa prima del deposito del campione. Mescolare 0,25 microlitri di soluzione di THAP 0,1 Molar e 0,25 microlitri dell'analita desiderato in un tubo da microcentrifuga.Vortexare il campione per tre secondi. Successivamente, centrifugare il campione per due secondi per raccogliere la soluzione in fondo alla provetta da microcentrifuga. Dopo la centrifugazione, aprire la porta della camera di essiccazione e depositare con attenzione 0,1 microlitri della soluzione sulla piastra del campione utilizzando una pipetta.Chiudere immediatamente la porta e attendere che la goccia di campione si asciughi. Quando la temperatura della piastra del campione è mantenuta più bassa rispetto all'ambiente circostante, la velocità media dei flussi di ricircolazione all'interno della goccia aumenta significativamente, favorendo la ridistribuzione delle molecole. Il deposito del campione è il passaggio più critico che determina la qualità e la riproducibilità dei dati.La soluzione campione pre-miscelata deve essere depositata immediatamente sulla piastra del campione per garantire che il campione si cristallizzi in condizioni controllate. Dopo l'essiccazione, aprire la porta della camera di essiccazione.Successivamente, impostare la temperatura del circolatore d'acqua a 25 gradi Celsius. Una volta che la temperatura della piastra del campione torna a 25 gradi Celsius, rimuovere la piastra del campione dalla camera di essiccazione. Esaminare la morfologia del campione al microscopio stereoscopico con un ingrandimento di cinque volte e acquisire un'immagine in campo chiaro.A questo punto, inserire la piastra del campione in uno spettrometro di massa MALDI. Quindi, eseguire l'analisi di spettrometria di massa con imaging. Selezionare un picco di massa caratteristico dall'elenco delle masse mostrato nella finestra dei risultati e fare clic su 2D per tracciare un'immagine ionica bidimensionale.Successivamente, fare clic sui pulsanti di regolazione nella finestra popup per determinare i limiti superiore e inferiore dell'intensità del segnale, aumentare la risoluzione dell'immagine e fare clic su salva un'immagine. Osservare e confrontare l'immagine ionica con l'immagine in campo chiaro acquisita in precedenza per individuare la regione essenziale del campione. A questo punto, fare clic sui punti nulli e sulle regioni screpolate nell'immagine ionica mostrata nella finestra dei risultati per regolare con precisione la regione da analizzare.Fare clic sul pulsante "trova bordo" per individuare il livello più esterno dell'immagine ionica. Successivamente, fare clic su "deduci" per salvare le informazioni sull'abbondanza ionica del livello più esterno in un database ed eliminare contemporaneamente questo strato dall'immagine ionica. Dopo aver ripetuto questi passaggi precedenti fino a quando non viene definito il centro dell'immagine ionica, fare clic, selezionare tutte le caselle di controllo nell'elenco dei dati di output e fare clic su "esporta" per esportare i dati.Infine, aprire i dati esportati utilizzando un software per fogli di calcolo per calcolare l'abbondanza ionica media di ogni strato ed ottenere le informazioni sulla distribuzione spaziale degli ioni. Nelle immagini in campo chiaro e MALDI del maltotriosio, il segnale ionico della forma sodiata si localizza principalmente alla periferia dell'area del campione, quando questo viene preparato con una temperatura della piastra campione di 25 gradi Celsius. Riducendo la temperatura a cinque gradi Celsius, il segnale si distribuisce in modo omogeneo su tutta l'area del campione, suggerendo che la preparazione dei campioni a una temperatura più bassa della piastra campione può ridistribuire in modo significativo le molecole e ridurre l'eterogeneità.L'immagine del frammento ionico della bradichinina protonata mostra una tendenza simile a quella della maltotriosio sodiata. Le analisi statistiche mostrano che l'eterogeneità dei segnali ionici ottenuti con una temperatura della piastra campione di 5 gradi Celsius si riduce del 60-80 percento rispetto a quella a 25 gradi Celsius. Nel caso della maltotriosio sodiata, con una temperatura della piastra campione di 25 gradi Celsius, le intensità del segnale nei centri sono molto inferiori rispetto a quelle registrate alla temperatura di 5 gradi Celsius.Il frammento di bradichinina protonato mostra una minore variabilità quando la temperatura della piastra del campione viene ridotta da 25 a 5 gradi Celsius. Durante il tentativo di questo metodo di essiccazione, è necessario controllare e monitorare attentamente la temperatura e l'umidità relativa nella camera di essiccazione. Una volta padroneggiato, un campione preparato con questa tecnica può essere ottenuto in 30 minuti, se eseguito correttamente.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della spettrometria di massa MALDI per esplorare l'analisi quantitativa di campioni a goccia essiccata. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare campioni omogenei a goccia essiccata per l'analisi mediante spettrometria di massa MALDI.

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