Preparazione dei campioni MALDI omogenei per applicazioni quantitative

L'obiettivo generale di questo metodo di preparazione del campione da MALDI MS è quello di ridurre l'eterogeneità spaziale nei segnali ionici durante MALDI MS. È stato costruito un ambiente di essiccazione ben controllato per ottimizzare il metodo convenzionale delle goccioline essiccate, manipolando i flussi idrodinamici all'interno della gocciolina del campione durante il processo di essiccazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'eterogeneità spaziale dei segnali ionici per il campione preparato con il metodo ottimizzato delle goccioline essiccate può essere efficacemente ridotta. Tuttavia, questo metodo può fornire campioni omogenei per il sistema metrico THAP.

Può essere applicato anche ad altri sistemi metrici, come l'acido alfa-ciano-4-idrossicinnamico. In generale, le persone che non conoscono questo metodo hanno avuto difficoltà perché controllare la condizione di essiccazione non è facile. Per iniziare questa procedura, aprire lo sportello di una camera di essiccazione e posizionare immediatamente una piastra di campionamento precedentemente pulita sul blocco a base di rame.

Quindi, chiudi la porta. Regolare manualmente il flussometro del gas per impostare la portata di azoto su 10 piedi cubi standard all'ora. Successivamente, regolare con precisione il flussometro del gas in modo che l'umidità relativa sia sempre inferiore al 25% nella camera di essiccazione, misurata da un igrometro.

Utilizzando le termocoppie di tipo K per monitorare la temperatura, regolare manualmente la temperatura del circolatore d'acqua, fino a quando la piastra del campione raggiunge i 5 gradi Celsius per l'esperimento. Assicurarsi che le temperature e l'umidità relativa richieste siano raggiunte prima della deposizione del campione. Mescolare 0,25 microlitri di soluzione 0,1 Molar THAP e 0,25 microlitri dell'analita desiderato in una provetta per microcentrifuga.

Agitare il campione per tre secondi. Quindi, centrifugare il campione per due secondi per raccogliere la soluzione sul fondo della provetta per microcentrifuga. Dopo la centrifugazione, aprire lo sportello della camera di essiccazione e depositare con cura 0,1 microlitri di soluzione sulla piastra del campione con una pipetta.

Chiudere immediatamente lo sportello e attendere che la gocciolina del campione si asciughi. Quando si mantiene la temperatura della piastra del campione più bassa rispetto all'ambiente circostante, la velocità media dei flussi di ricircolo all'interno della gocciolina aumenta significativamente per ridistribuire le molecole. La deposizione del campione è la fase più critica che determina la qualità e la riproducibilità dei dati.

La soluzione del campione premiscelato deve essere depositata immediatamente sulla piastra del campione per garantire che il campione sia cristallizzato in condizioni controllate. Dopo l'asciugatura, aprire lo sportello. della camera di essiccazione.

Quindi, impostare la temperatura del circolatore d'acqua a 25 gradi Celsius. Una volta che la temperatura della piastra del campione torna a 25 gradi Celsius, rimuovere la piastra del campione dalla camera di essiccazione. Esamina la morfologia del campione con uno stereomicroscopio ingrandito cinque volte e scatta un'istantanea in campo chiaro.

A questo punto, inserire la piastra di campionamento in uno spettrometro di massa MALDI. Quindi, eseguire l'analisi della spettrometria di massa per immagini. Selezionate un picco di massa caratteristico dall'elenco delle masse visualizzato nella finestra dei risultati e fate clic su 2D per tracciare un'immagine ionica bidimensionale.

Quindi, fare clic sui pulsanti di regolazione nella finestra pop-up per determinare i limiti superiore e inferiore dell'intensità del segnale, per aumentare la risoluzione dell'immagine e fare clic su Salva un'immagine. Osservare e confrontare l'immagine ionica con l'immagine in campo chiaro precedentemente acquisita per ottenere la regione del campione essenziale. Ora, fai clic sui punti nulli e sulle regioni incrinate nell'immagine ionica mostrata nella finestra dei risultati per regolare con precisione la regione da analizzare.

Fare clic sul pulsante Trova bordo per trovare lo strato più esterno dell'immagine ionica. Successivamente, fare clic su Deduci per salvare le informazioni sull'abbondanza ionica del livello più esterno in un database e rimuovere contemporaneamente questo livello dall'immagine ionica. Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti fino a definire il centro dell'immagine ionica, fare clic e selezionare tutte le caselle di controllo nell'elenco dei dati di output e fare clic su Esporta per esportare i dati.

Infine, apri i dati esportati utilizzando un foglio di calcolo per calcolare l'abbondanza media di ioni di ogni strato, per ottenere le informazioni sulla distribuzione spaziale degli ioni. Nelle immagini in campo chiaro e MALDI del maltotriosio, il segnale ionico della forma sodata si popola principalmente alla periferia dell'area del campione, quando viene preparato con una temperatura della piastra del campione di 25 gradi Celsius. Diminuendo la temperatura a cinque gradi Celsius, il segnale si popola in modo omogeneo su tutta l'area del campione, suggerendo che la preparazione dei campioni a una temperatura della piastra del campione più bassa può ridistribuire significativamente le molecole e ridurre l'eterogeneità.

L'immagine dello ione frammento di bradichinina protonato mostra un andamento simile a quello del maltotriosio sodiato. Le analisi statistiche mostrano che l'eterogeneità dei segnali ionici ottenuti a una temperatura della piastra di campionamento di 5 gradi Celsius si riduce dal 60 all'80 percento, rispetto a quella inferiore a 25 gradi Celsius. Nel caso del maltotriosio sodiato, con una temperatura della piastra del campione di 25 gradi Celsius, le intensità del segnale ai centri sono molto più basse di quelle con la temperatura di 5 gradi Celsius.

Il frammento di bradichinina protonato mostra meno variazioni quando si riduce la temperatura della piastra del campione da 25 a 5 gradi Celsius. Durante la sperimentazione di questo metodo di essiccazione, le temperature e l'umidità relativa nella camera di essiccazione devono essere attentamente controllate e monitorate. Una volta padroneggiato, un campione preparato con questa tecnica può essere fatto in 30 minuti se eseguito correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della SM MALDI per esplorare l'analisi quantitativa per campioni di goccioline essiccate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni omogenei di goccioline essiccate per l'analisi MALDI MS.