Il concetto Terroir interpretato attraverso uva a bacca Metabolomica e Trascrittomica

L'obiettivo generale di queste procedure sperimentali è quello di osservare le diverse firme del terroir nel metaboloma e nel trascrittoma dell'acino della cultivar di vite Corvina. Il caso di studio qui descritto ha riguardato la raccolta e l'analisi di campioni in tre fasi di maturazione da sette vigneti in tre macro zone nell'arco di tre stagioni vegetative. Le tecniche descritte rivelano l'effetto prevalente della maturazione in annata sul metaboloma dell'acino.

Nelle bacche mature sono state identificate anche chiare firme chimiche specifiche che rappresentano le tre macro zone. La firma del terroir a livello di macro zona è stata rivelata utilizzando tecniche statistiche adeguate come la PCA, che è l'analisi delle componenti principali, e l'auto BLSDA, che è la proiezione ortogonale bidirezionale su strutture plumbee, analisi discreta, per analizzare sia la trascrittomica che la matrice di dati metabalomica. D'altra parte, le differenze tra i singoli vigneti sono più sottili e richiedono anche approcci statistici più sofisticati e sensibili.

Iniziare l'esperimento sviluppando un piano di campionamento appropriato. Assicurarsi che il piano di campionamento indichi i luoghi, gli orari e la procedura di campionamento precisa. Dopo aver raccolto 30 grappoli da posizioni diverse lungo due filari, seleziona tre acini a caso da ogni grappolo, evitando quelli con danni visibili e/o segni di infezione.

Ripetere questo processo per ottenere tre pool indipendenti per ogni fase di maturazione. Privare le bacche dei semi e congelare immediatamente il pericarpo in azoto liquido. Schiaccia tutte le bacche congelate da ogni piscina con un macinatore automatico.

Dividi ogni campione in polvere in due parti uguali, una per l'analisi trascrittomica e una per l'analisi metabolomica. Quindi, chiudere e rimuovere il duer e conservare le polveri a meno 80 gradi Celsius. Preparare gli estratti metabolici dei campioni di bacche a temperatura ambiente in tre volumi di metanolo, acidificati con acido formico allo 0,1%, in un bagno ultrasonico a 40 kilohertz per 15 minuti.

Centrifugare gli estratti a 16.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Diluire il surnatante in due volumi di acqua deionizzata e passare attraverso un filtro da 0,2 micron. Impostare la cromatografia liquida ad alte prestazioni, accoppiata alla spettrometria di massa, utilizzando una sorgente di ionizzazione elettrospray o un sistema HPLC-ESI-MS, come descritto nel protocollo di testo.

Eseguire la separazione HPLC con un gradiente lineare di solventi A e B a una velocità di flusso costante di 0,2 millilitri al minuto, utilizzando un volume di iniezione del campione di 30 microlitri. Acquisisci spettri di massa in modalità di ionizzazione alternata negativa e positiva, con i parametri elencati nel protocollo di testo. Per elaborare i dati LCMS, implementare le procedure di allineamento del rilevamento dei picchi, riempimento delle lacune e filtraggio dei picchi utilizzando un software adatto, come il software open source M Zeta Mine, versione 2.14.

Importa i file di testo risultanti in un foglio di calcolo. Questo produce una matrice di dati in cui tutti i metaboliti rilevati riconosciuti da un numero di identificazione, un valore del rapporto massa/carica e un tempo di ritenzione, sono quantificati in tutti i campioni in termini di valori dell'area di picco. Preparare l'assemblaggio di ibridazione in base alle quattro specifiche del formato della confezione, posizionando 1,65 microgrammi di RNA complementare marcato con cianina, in un volume finale di 41,8 microlitri di acqua priva di RNAsi deionizzata.

Aggiungere 11 microlitri di agente bloccante 10X e 2,2 microlitri di tampone di frammentazione 25X. Incubare a 60 gradi Celsius per 30 minuti in un bagno termostatico, per frammentare l'RNA. Dopo 30 minuti, raffreddare immediatamente con ghiaccio per un minuto.

Infine, aggiungere 55 microlitri di tampone di ibridazione 2X e mescolare bene mediante pipettaggio. Dopo aver centrifugato per un minuto a 15, 500 volte g a temperatura ambiente, posizionare prontamente la provetta per microcentrifuga sul ghiaccio. Per caricare il micro-array personalizzato, caricare una slitta per guarnizioni con l'etichetta rivolta verso l'alto, nella base di una camera di ibridazione.

Caricare lentamente 100 microlitri di campione di ibridazione su ciascun pozzetto della guarnizione, erogando il liquido con la punta di una pipetta, evitando bolle. Posizionare lentamente il micro-array personalizzato, rivolto verso il basso, assicurandosi che il codice a barre numerico sia rivolto verso l'alto. Assicurarsi che la coppia di sandwich sia allineata correttamente.

Infine, posizionare il coperchio della camera di ibridazione sui vetrini a sandwich e serrare a mano il morsetto sulla camera. Ruotare la camera assemblata, per valutare la mobilità delle bolle. Posizionare la camera di scorrimento assemblata in un girarrosto bilanciato, in un forno di ibridazione impostato a 65 gradi Celsius.

Impostare il rotatore in modo che ruoti a 10 giri/min. Lasciare procedere l'ibridazione per 17 ore. Per procedere con il lavaggio dei vetrini in micro-array, preparare tre piatti per la colorazione dei vetrini e riempirli con gli appositi tamponi di lavaggio.

Riempire due stoviglie con il tampone di lavaggio, uno, a temperatura ambiente, e una con il tampone di lavaggio preriscaldato, due. Smontare la camera di ibridazione e rimuovere il sandwich. Con il codice a barre numerico del vetrino del micro-array rivolto verso l'alto, immergere il sandwich nel primo piatto di colorazione del vetrino riempito con il tampone di lavaggio uno a temperatura ambiente e, con l'aiuto di una pinza pulita, separare la guarnizione dal vetrino del micro-array.

Trasferire rapidamente il vetrino del micro-array in un rack per vetrini e posizionarlo nel secondo piatto di colorazione dei vetrini riempito con il tampone di lavaggio a temperatura ambiente. Mettere il piatto colorante su un agitatore magnetico e lavare per un minuto mescolando moderatamente. Trasferire rapidamente il rack per vetrini nella terza piastra per la colorazione dei vetrini, riempita con il tampone di lavaggio preriscaldato due, e lavare per un minuto mescolando moderatamente.

Rimuovere lentamente la griglia dal piatto che macchia il vetrino e rimuovere con cautela il vetrino dal rack, evitando goccioline. Posizionare il vetrino del micro-array in uno scanner adatto ed eseguire la scansione di ciascun array utilizzando le impostazioni dei parametri consigliate nel manuale di istruzioni del produttore del micro-array. Per preparare il software di analisi statistica, importare prima i dati di metabolomica e trascrittomica.

Vai su File, Nuovo Progetto Regolare, Nuovo Progetto Regolare, per importare la matrice di dati ottenuta. Quindi fare clic su Modifica. Trasporre l'intera matrice, home e assegnare l'ID primario e secondario appropriato.

Per eseguire l'analisi statistica multivariata, accedere alla finestra Workset, selezionare PCAX come tipo di modello e fare clic su AutoFit. Selezionare Punteggi e poi Dispersione, per visualizzare il grafico che mostra il possibile raggruppamento dei campioni. Ispezionare il grafico del punteggio PCA.

Se si ottiene un buon modello, utilizzare le stesse classi di campioni per costruire un modello di analisi discriminante O2PLS. Per costruire due modelli di analisi discriminante O2PLS utilizzando i campioni classificati da MacroZone, assegnare le classi andando su Home window, New As, M1 e Observations. Imposta le classi desiderate.

Quindi, modificare il tipo di modello da PCAX all'analisi discriminante O2PLS. Premere Autofit. Procedere con Seleziona M2 nella finestra progetto, e fare clic su Punteggi, quindi su Scatter, per vedere il grafico e la posizione delle classi campione.

Andare a Seleziona tipo di dati e selezionare Osservazioni e caricamenti. Quindi fare clic su Aggiungi serie e selezionare le voci Correlazione PQ uno e Correlazione PQ due o ulteriori componenti, se presenti. Con il tasto destro del mouse premuto sul grafico, vai su Proprietà, seleziona Colore, quindi seleziona Per termini, per distinguere i simboli del grafico tra molecole e classi.

Andare su Layout, Formato stampa, Accesso e o Stili, per modificare la stampa con le caratteristiche desiderate. Per osservare quali metaboliti caratterizzano una o più classi specifiche, vai su Plot List, quindi su Scatter. L'analisi esplorativa dell'intera matrice di dati mediante PCA, ha mostrato che i campioni si raggruppano in base allo stadio di maturazione, tra cui invaiatura, maturazione media e maturazione, lungo il primo e il secondo componente principale.

I campioni si sono raggruppati in base alla stagione di crescita lungo la terza componente principale. L'analisi discriminante O2PLS degli acini maturi consente l'identificazione di specifiche firme del terroir, che rappresentano le tre macrozone, Valpolicella, Lago di Garda e Soave. I grafici di carico di questi modelli sono espressi come correlazione PQ, la correlazione tra P, la classe di campioni, e Q, i metaboliti.

Nei grafici di caricamento, i quadrati rossi rappresentano la classe di campioni o macrozone e i triangoli colorati rappresentano i singoli metaboliti. I metaboliti sono codificati a colori in base alla loro classe chimica e la distanza tra i metaboliti e i campioni riflette le loro relazioni. La macrozona del Lago di Garda era caratterizzata da stilbeni, mentre il Soave e la Valpolicella erano caratterizzati da flavonoidi.

All'interno degli antociani, la peonidina e i suoi derivati erano più diffusi nella macrozona del Lago di Garda, mentre gli altri antociani erano più diffusi nella macrozona della Valpolicella. Inoltre, gli antocianine tre-O-glucosidi erano più diffusi nella macrozona della Valpolicella, mentre i derivati acilati e cumerati erano più prevalenti nella macrozona del Soave. I metodi di trascrittomica, RA e RNA sig consentono di monitorare contemporaneamente migliaia di trascritti di vite.

Di recente è stato progettato un nuovo micro-array personalizzato che rappresenta un numero ancora maggiore di sonde, che rappresentano un ulteriore genere di vite appena scoperto. Data la rapida obsolescenza delle piattaforme trascrittomiche, abbiamo descritto una procedura alternativa utilizzando una nuova piattaforma che contiene più sonde rispetto a quella vecchia, tra cui 249 trascritti più predettivi del pene, per 1392 loci del peno recentemente identificati e 179 geni della corvina prava. L'analisi metabolomica mediante HPLC-ESI-MS, è abbastanza sensibile da rilevare un gran numero di metaboliti contemporaneamente.

La capacità di creare un piano di campionamento è fondamentale. La scelta di un singolo clone per minimizzare le differenze genetiche, e la durata multipla del campionamento, hanno permesso di identificare le reali differenze tra i terroir. Sarebbe interessante confrontare le stesse cultivar coltivate in zone meno ottimali, ma purtroppo questi vigneti non erano disponibili.