Il concetto Terroir interpretato attraverso uva a bacca Metabolomica e Trascrittomica

L'obiettivo generale di queste procedure sperimentali è osservare le diverse firme di terroir nel metaboloma e nel trascrittoma dell'acino del vitigno Corvina. Lo studio di caso descritto in questo articolo ha previsto la raccolta e l'analisi di campioni in tre stadi di maturazione provenienti da sette vigneti appartenenti a tre macrozone, monitorati per tre stagioni vegetative. Le tecniche descritte evidenziano il predominante effetto dell'annata sulla maturazione del metaboloma dell'acino.

Sono state inoltre identificate chiare firme chimiche specifiche rappresentative delle tre macrozone nelle bacche mature. La firma del terroir a livello di macrozona è stata rivelata utilizzando opportune tecniche statistiche come la PCA, ovvero l'analisi delle componenti principali, e l'auto BLSDA, ovvero la proiezione ortogonale bidirezionale per rilevare strutture dominanti, analisi discreta, per analizzare sia la matrice di dati transcriptomici che quella metabolomici. Dall'altro lato, le differenze tra singoli vigneti sono più sottili e richiedono anche approcci statistici più sofisticati e sensibili.

Iniziare l'esperimento sviluppando un piano di campionamento appropriato. Assicurarsi che il piano di campionamento indichi i luoghi, i tempi e la procedura di campionamento precisa. Dopo aver raccolto 30 grappoli da diverse posizioni lungo due file di vite, selezionare casualmente tre acini da ciascun grappolo, evitando quelli con danni visibili o segni di infezione.

Ripetere questo processo per ottenere tre pool indipendenti per ciascuna fase di maturazione. Privare le bacche dei semi e congelare immediatamente il pericarpo in azoto liquido. Triturare tutte le bacche congelate di ciascun pool con un macinatore automatico.

Dividere ogni campione in polvere in due parti uguali, una per l'analisi di trascrittomica e una per l'analisi di metabolomica. Successivamente, chiudere e rimuovere il duer e conservare le polveri a meno 80 gradi Celsius. Preparare gli estratti metabolici dei campioni di bacca a temperatura ambiente in tre volumi di metanolo, acidificati con acido formico 0,1%, in un bagno ad ultrasuoni a 40 kilohertz per 15 minuti.

Centrifugare gli estratti a 16.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Diluire il soprannatante in due volumi di acqua deionizzata e filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron. Impostare la cromatografia liquida ad alte prestazioni, abbinata alla spettrometria di massa, utilizzando una sorgente di ionizzazione ad elettrospruzzo o un sistema HPLC-ESI-MS, come descritto nel protocollo del testo.

Eseguire la separazione tramite HPLC con un gradiente lineare dei solventi A e B a un flusso costante di 0,2 millilitri al minuto, utilizzando un volume di iniezione del campione di 30 microlitri. Acquisire gli spettri di massa in modalità di ionizzazione negativa e positiva alternate, con i parametri elencati nel protocollo testuale. Per elaborare i dati LCMS, applicare le procedure di rilevamento dei picchi, allineamento, riempimento dei gap e filtraggio dei picchi mediante un software adeguato, come il software open source M Zeta Mine, versione 2.14.

Importare i file di testo risultanti in un foglio di calcolo. Questo produce una matrice di dati in cui tutti i metaboliti rilevati, identificati da un numero di riconoscimento, da un valore del rapporto massa/carica e da un tempo di ritenzione, vengono quantificati in tutti i campioni in base ai valori della loro area del picco. Preparare l'assemblaggio di ibridazione secondo le specifiche del formato a quattro pacchetti, aggiungendo 1,65 microgrammi di RNA complementare marcato con cianina, in un volume finale di 41,8 microlitri di acqua deionizzata priva di RNAse.

Aggiungere 11 µL di agente bloccante 10X e 2,2 µL di tampone di frammentazione 25X. Incubare a 60 °C per 30 minuti in un bagno termostatico, al fine di frammentare l'RNA. Trascorsi 30 minuti, raffreddare immediatamente sul ghiaccio per un minuto.

Infine, aggiungere 55 microlitri di buffer di ibridazione 2X ed emulsionare accuratamente mediante pipetta. Dopo aver centrifugato per un minuto a 15.500 ×g a temperatura ambiente, posizionare immediatamente il tubo microcentrifuga sul ghiaccio. Per caricare la microarray personalizzata, inserire una lamella con guarnizione con l'etichetta rivolta verso l'alto nella base di una camera di ibridazione.

Caricare lentamente 100 microlitri di campione di ibridazione su ciascun pozzetto della guarnizione, dispensando il liquido con la punta della pipetta ed evitando bolle. Posizionare lentamente il microarray personalizzato rivolto verso il basso, assicurandosi che il codice a barre numerico sia rivolto verso l'alto. Verificare che la coppia a sandwich sia correttamente allineata.

Infine, posizionare il coperchio della camera di ibridazione sui vetrini sovrapposti e serrare a mano la morsa sulla camera. Ruotare la camera assemblata per valutare la mobilità delle bolle d'aria. Posizionare la camera con i vetrini in una girapolti bilanciata, all'interno di un forno di ibridazione impostato a 65 gradi celsius.

Impostare il rotatore su 10 giri/min. Lasciare procedere l'ibridazione per 17 ore. Per proseguire con il lavaggio della slide per microarray, preparare tre contenitori per colorazione di slide e riempirli con i rispettivi tamponi di lavaggio.

Riempire due piatti con il buffer di lavaggio uno, a temperatura ambiente, e un piatto con il buffer di lavaggio due preriscaldato. Smontare la camera di ibridazione e rimuovere il sandwich. Con la barra numerica del vetrino per microarray rivolta verso l'alto, immergere il sandwich nel primo piatto porta-oggetti riempito con il buffer di lavaggio uno a temperatura ambiente e, con l'aiuto di pinze pulite, separare la guarnizione dal vetrino per microarray.

Trasferire rapidamente il vetrino microarray in un portavetrini e posizionarlo nel secondo contenitore per colorazione riempito con tampone di lavaggio uno a temperatura ambiente. Posizionare il contenitore per colorazione su un agitatore magnetico e lavare per un minuto con agitazione moderata. Trasferire rapidamente il portavetrini nel terzo contenitore per colorazione, riempito con tampone di lavaggio due preriscaldato, e lavare per un minuto con agitazione moderata.

Rimuovere lentamente il supporto dalla vaschetta per la colorazione dei vetrini e prelevare con attenzione il vetrino dal supporto, evitando gocciolature. Posizionare il vetrino micro-array su uno scanner adeguato e scansionare ogni matrice utilizzando le impostazioni dei parametri raccomandate nel manuale istruzioni del produttore del micro-array. Per preparare il software di analisi statistica, importare innanzitutto i dati di metabolomica e trascrittomica.

Vai su File, Nuovo Progetto Regolare, Nuovo Progetto Regolare, per importare la matrice di dati ottenuta. Quindi fai clic su Modifica. Trasponi l'intera matrice, home, e assegna l'ID primario e secondario appropriato. E completa.

Per eseguire l'analisi statistica multivariata, accedere alla finestra del Workset, selezionare PCAX come tipo di modello e fare clic su AutoFit. Selezionare Scores e quindi Scatter per visualizzare il grafico che mostra il raggruppamento possibile dei campioni. Esaminare il grafico dei punteggi PCA.

Se si ottiene un buon modello, utilizzare le stesse classi di campioni per costruire un modello di analisi discriminante O2PLS. Per costruire due modelli di analisi discriminante O2PLS utilizzando i campioni classificati da MacroZone, assegnare le classi andando alla finestra Home, New As, M1 e Osservazioni. Impostare le classi desiderate.

Quindi, modificare il tipo di modello da PCAX a analisi discriminante O2PLS. Premere Autofit. Procedere selezionando M2 nella finestra del progetto e fare clic su Scores, quindi su Scatter, per visualizzare il grafico e la posizione delle classi dei campioni.

Vai a Seleziona tipo di dati e seleziona Osservazioni e Loadings. Quindi fai clic su Aggiungi serie e seleziona gli elementi correlazione PQ uno e correlazione PQ due, oppure ulteriori componenti se presenti. Premendo il tasto destro del mouse sul grafico, vai su Proprietà, seleziona Colore e quindi seleziona Per termini, per distinguere i simboli del grafico tra molecole e classi.

Vai a Layout, Formatta grafico, Accesso e/o Stili, per modificare il grafico con le caratteristiche desiderate. Per osservare quali metaboliti caratterizzano una o più classi specifiche, vai a Elenco grafici, quindi Dispersione. L'analisi esplorativa dell'intera matrice di dati mediante PCA ha mostrato che i campioni si raggruppano in base allo stadio di maturazione, inclusi verasion, maturazione intermedia e maturo, lungo le prime due componenti principali.

I campioni si sono raggruppati in base alla stagione di crescita lungo la terza componente principale. L'analisi discriminante O2PLS delle bacche mature consente l'identificazione di firme specifiche di terroir, rappresentative delle tre macrozone: Valpolicella, Lago di Garda e Soave. I grafici dei loading di questi modelli sono espressi come correlazione PQ, ovvero la correlazione tra P, la classe dei campioni, e Q, i metaboliti.

Nelle rappresentazioni grafiche di caricamento, i quadrati rossi rappresentano la classe di campioni o macrozone, mentre i triangoli colorati rappresentano i singoli metaboliti. I metaboliti sono codificati per colore in base alla loro classe chimica, e la distanza tra i metaboliti e i campioni riflette le loro relazioni. La macrozona del Lago di Garda è stata caratterizzata da stibenoidi, mentre Soave e Valpolicella sono state contraddistinte da flavonoidi.

Nell'ambito delle antocianine, la peonidina e i suoi derivati erano più prevalenti nella macrozona del Lago di Garda, mentre le altre antocianine risultavano più abbondanti nella macrozona della Valpolicella. Inoltre, le antocianine tre-O-glucosidi erano più prevalenti nella macrozona della Valpolicella, mentre i derivati acilati e cumarilati erano più diffusi nella macrozona del Soave. Le metodiche di transcriptomica, RA e RNA sig permettono di monitorare simultaneamente migliaia di trascritti della vite.

È stato recentemente progettato un nuovo microarray personalizzato che rappresenta un numero ancora maggiore di sonde, comprendente ulteriori specie del genere vite appena scoperte. Data la rapida obsolescenza delle piattaforme transcriptomiche, abbiamo descritto una procedura alternativa che utilizza una nuova piattaforma contenente più sonde rispetto alla precedente, inclusi 249 trascritti predetti di peno in più, per 1392 nuovi loci di peno identificati e 179 geni di corvina prava. L'analisi metabolomica mediante HPLC-ESI-MS è sufficientemente sensibile da rilevare un elevato numero di metaboliti simultaneamente.

La capacità di creare un piano di campionamento è fondamentale. La scelta di un singolo clone per minimizzare le differenze genetiche e la ripetizione del campionamento in diversi momenti hanno permesso di identificare le effettive differenze tra i terroir. Sarebbe interessante confrontare lo stesso cultivar coltivato in zone meno ottimali, ma purtroppo questi vigneti non erano disponibili.