Lo sviluppo di un anticorpo salivare Multiplex immunoenzimatico per misurare l'esposizione umana ad agenti patogeni ambientali

L'obiettivo generale di questo saggio immunoistochimico multiplo basato su microsfere per la rilevazione di anticorpi salivari è identificare gli agenti eziologici responsabili di malattie sintomatiche e asintomatiche associate all'ambiente, misurando contemporaneamente le risposte anticorpali di tipo IGG a più patogeni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della scienza dell'esposizione. Ad esempio, quali patogeni sono responsabili dell'insorgenza di malattie in specifiche popolazioni.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per misurare rapidamente ed in modo economico gli anticorpi contro molteplici analiti contemporaneamente, impiegando volumi di campione molto ridotti. Questo metodo può fornire informazioni sugli agenti eziologici e sulle loro fonti di esposizione, incluse le vie trasmesse da alimenti, acqua e aria. La dimostrazione ufficiale di questa procedura è fondamentale perché, se non viene impostata correttamente, i risultati possono risultare non affidabili.

Iniziare vortexando e sonicando le miscele stock di perline legate agli antigeni di interesse per 20 secondi alla volta, al fine di ottenere sospensioni omogenee di perline. Successivamente, diluire le stock di perline coniugate a una concentrazione finale di 100 perline per microlitro di ciascun set unico di perline in PBS, integrato con 1% BSA. Poi, preparare almeno sette diluizioni seriali a due raddoppi di anticorpo primario anti-specie IGG, in PBS aggiunto di BSA, in una piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo, seguendo le raccomandazioni del produttore.

Inumidire preventivamente una colonna separata da otto per dodici di una piastra filtrante a 96 pozzetti per ciascun test di conferma dell'accoppiamento dell'antigene con 100 microlitri di buffer di lavaggio ed eliminare il sovranatante mediante vuoto. Successivamente, aggiungere 50 microlitri delle perline legate all'antigene nei pozzetti pre-inumiditi e 50 microlitri dell'anticorpo diluito in serie nelle righe da uno a sette della piastra a 96 pozzetti con filtro, e aggiungere 50 microlitri di PBS più BSA nella riga otto come controllo di fondo per l'anticorpo diluito. Utilizzare una pipetta multicanale per mescolare il contenuto di ciascun pozzetto su e giù per cinque volte.

Quindi coprire la piastra e incubare gli anticorpi con le perle legate all'antigene al buio, a temperatura ambiente, su uno scuotitore per micropiastre a 500 rpm. Dopo un'ora, aspirare il soprannatante e lavare le pozzette con due aliquote da 100 microlitri di buffer di lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, sostituire il buffer con 50 microlitri di PBS contenente BSA.

Ora diluire l'anticorpo secondario di rilevamento anti-IgG specifico per specie, fino a 16 microgrammi per millilitro in PBS più BSA, e aggiungere 50 microlitri di anticorpo secondario diluito in ogni pozzetto. Incubare le perle e gli anticorpi a temperatura ambiente al buio per 30 minuti su un agitatore per piastre. Al termine dell'incubazione, aspirare il sopranatante e lavare le perle con due aliquote da 100 microlitri di tampone di lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, risospendere le perle in 50 microlitri di PBS con BSA e diluire il marcatore streptavidina r-ficoeritrina a 24 microgrammi per millilitro in PBS con BSA. Aggiungere 50 microlitri del marcatore a ogni pozzetto e mescolare mediante pipettaggio. Incubare la piastra al buio per 30 minuti a temperatura ambiente su agitatore, seguita da due risciacqui con 100 microlitri di buffer di lavaggio come illustrato.

Quindi risospendere le perle in 100 microlitri di PBS aggiunto di BSA e valutare le perle accoppiate all'antigene sull'analizzatore. Dopo aver risospeso le scorte di perle accoppiate mediante vortex e sonificazione per 20 secondi, diluire le scorte di perle accoppiate a una concentrazione finale di 100 perle per microlitro di ciascun set unico di perle in PBS aggiunto di BSA. Preparare quindi una diluizione da uno a quattro di saliva a temperatura ambiente in PBS aggiunto di BSA in una piastra a 96 pozzetti con pozzetti profondi.

Inumidire preliminarmente una piastra filtrante con 100 microlitri di soluzione di lavaggio ed aspirare il soprannatante. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di microsferette legate all'antigene e un volume uguale di saliva diluita in 95 pozzetti della piastra filtrante a 96 pozzetti per una diluizione finale da uno a otto. Allo stesso tempo, aggiungere 50 microlitri di microsferette legate all'antigene e 50 microlitri di PBS con BSA soltanto nel pozzetto di controllo.

Incubare le perle al buio a temperatura ambiente per un'ora sulla piastra agitata a 500 giri al minuto. Quindi aspirare il soprannatante e lavare le pozzette due volte con 100 microlitri di soluzione di lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le perle in 50 microlitri di PBS contenente BSA.

Diluire l'anticorpo secondario e aggiungere 50 microlitri di questo in ogni pozzetto. Dopo aver mescolato il contenuto dei pozzetti con una pipetta multicanale, incubare la piastra sullo shaker al buio per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare i pozzetti due volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio e risospendere le perle in 50 microlitri di PBS fresco più BSA. A questo punto diluire il marcatore e aggiungere 50 microlitri in ogni pozzetto.

Mescolare accuratamente con una pipetta multicanale. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente sullo shaker al buio, lavare i pozzetti due volte come indicato, quindi risospendere le perle in 100 microlitri di PBS con BSA e analizzare i campioni sull'analizzatore. Per assicurare che le perle coniugate con l'antigene siano in grado di rientrare nel range dinamico del saggio, un corretto coniugio è definito come un'intensità media di fluorescenza maggiore o uguale a 18.000.

Come dimostrato per queste conferme rappresentative dell'accoppiamento degli antigeni nel saggio per C.jejuni e T.gondii. Sulla base del punto di cutoff stabilito, i tassi di immunoprevalenza per i campioni sono variati da circa il 2% per T.gondii a quasi il 50% per il genogruppo 1.1 del Norovirus, indicando che il tasso di immunoprevalenza era più elevato per i Norovirus, seguito dall'Epatite A e da H.Pylori. Mentre il 32% dei campioni risultava immunonegativo per tutti i patogeni nel saggio, il 68% risultava immunopositivo per uno o più patogeni.

Una volta padroneggiata, questa procedura può essere completata in circa quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere le perle al buio per evitare il fotoblecamento. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come ELISA e il Western blotting possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande riguardo sensibilità e specificità.

Oltre alla cross-reattività degli anticorpi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nei campi dell'epidemiologia, della scienza dell'esposizione e della microbiologia clinica per esplorare i rischi umani derivanti da esposizioni ambientali. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una comprensione molto chiara di come sviluppare, analizzare e interpretare i risultati di un saggio immunoanalitico multiplex, misurando contemporaneamente gli anticorpi contro più patogeni.

Non dimenticare che lavorare con fluidi corporei e azoturo di sodio può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come indossare idonei dispositivi di protezione individuale e smaltire correttamente i reagenti durante l'esecuzione di questa procedura.