Name: Lo sviluppo di un anticorpo salivare Multiplex immunoenzimatico per misurare lesposizione umana ad agenti patogeni ambientali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Scopri lo sviluppo di un immunoassay multiplex salivare per misurare l'esposizione umana a patogeni ambientali. Questo metodo permette di analizzare anticorpi IgG contro più agenti patogeni simultaneamente in modo rapido ed economico.

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Clarissa Curioso è stata supportata attraverso una nomina al Programma di Partecipazione alla Ricerca presso l'Agenzia per la Protezione dell'Ambiente degli Stati Uniti amministrata dall'Oak Ridge Institute for Science and Education attraverso un accordo interagenzia tra il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti e l'EPA degli Stati Uniti.

L&#39;approvazione è stata ottenuta dalla Institutional Review Board (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) per la raccolta di campioni di saliva stimolati crevicolare da bagnanti a Boqueron Beach, Porto Rico, come parte degli Stati Uniti Environmental Protection Agency (EPA) nazionale epidemiologici e valutazione ambientale di attività ricreative (neear) acqua Studio 23 per la valutazione di nuoto associato esposizioni e malattie. I soggetti dello studio fornito il consenso informato e sono stati istruiti sull&#39;uso del dispositivo di raccolta della saliva da personale qualificato e imprenditori USEPA. I campioni di saliva sono stati spediti in ghiaccio e, sulla ricevuta, sono stati centrifugati e conservati a -80 ° C come descritto 4. 1. Attivazione Bead <ol><li> Risospendere le scorte di sferette di vortex e sonicating per 20 secondi e il trasferimento di circa 5,0 x 10 6 delle perline stock (400 microlitri) per provette da microcentrifuga. Nota: Tha perle vengono alimentate ad una concentrazione di 12,5 x 10 6 perline / ml. </li><li> Agglomerare le azionari perline per centrifugazione a 10.000 xg per 2 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in pellet in 100 ml di acqua distillata (DH 2 O) dal vortice e ultrasuoni per 20 sec. Ripetere il punto 1.2. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere lavate in 80 ml di 100 mM sodio fosfato monobasico, pH 6,2 per vortice e sonicazione per 20 sec. </li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, effettuare una soluzione di 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) con l&#39;aggiunta di 200 pl dH 2 O al 10 mg Sulfo-NHS aliquota. Miscelare vortice. </li><li> Aggiungere 10 ml di 50 mg / ml solfo-NHS ai talloni. Miscelare vortice. </li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, fare un 50 mg / ml di 1-etil [3dimethylaminopropyl] carbodiimide soluzione (EDC) cloridrato con l&#39;aggiunta di 200 ml di acqua distillata (DH 2 O) al 10 mg EDC aliquota. Miscelare vortice. </li><li> Aggiungere 10 ml di 50mg / ml soluzione EDC ai talloni. Miscelare vortice. Incubare le perline per 20 min a temperatura ambiente, al buio, con miscelazione vortex ad intervalli di 10 min. Pellet le perle attivate da microcentrifugation a 10.000 xg per 2 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 250 microlitri di 50 mm 2- [N -Morpholino] acido etansolfonico (MES), pH 5,0 da vortice e ultrasuoni per 20 sec. </li><li> Pellet le perle attivate da microcentrifugation a 10.000 xg per 2 minuti. </li><li> Ripetere i punti 1.9 e 1.10. Nota: Questo fornisce un totale di due lavaggi con 50 mM MES, pH 5,0. </li><li> Risospendere le sfere in 100 ml di 50 mM MES, pH 5,0 da vortice e ultrasuoni per 20 sec. </li></ol> 2. Giunto Bead <ol><li> Coppia antigeni ai set tallone utilizzando le concentrazioni indicate nella Tabella 1. </li><li> Aggiungere ciascun antigene ai talloni attivati ​​e portare il volume totale a 500 microlitri in 50 mM MES, pH 5,0. Mescolare gli antigeni und perline di vortice. </li><li> Incubare gli antigeni e perline per 2 ore con miscelazione mediante rotazione (~ 15 rpm) a temperatura ambiente al buio. Agglomerare le perline accoppiate di microcentrifugation a 10.000 xg per 2 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 500 ml di tampone fosfato (PBS) -bovine albumina sierica (BSA) monolaurato -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) -Sodio azide (PBS-TBN) pH 7,4 per vortice e ultrasuoni. Pellet le perle di microcentrifugation a 10.000 xg per 2 minuti e rimuovere il surnatante. Attenzione: azide di sodio è una sostanza chimica altamente tossici. È fatale se ingerito o si mette in contatto con la pelle. Non respirare la polvere / i fumi / gas / la nebbia / vapori o spray. Indossare dispositivi di protezione adeguati (di DPI) durante la manipolazione e smaltire secondo le leggi appropriate. </li><li> Risospendere le sfere in 1 ml di PBS-TBN di vortice e ultrasuoni per 20 sec. </li><li> Pellet le perle di microcentrifugation a 10.000 xg per 2 minuti. </li><li>Ripetere i punti 2.5 e 2.6. Nota: Questo fornisce un totale di due lavaggi con PBS-TBN. </li><li> Risospendere le sfere accoppiati e lavati con 1 ml di PBS, 1% BSA, 0,05% azide, pH 7,4. Conservare le perline accoppiate in C frigorifero 2-8 ° al buio. </li></ol> 3. Conte Bead <ol><li> Preparare una diluizione 1:10 di perline accoppiate in acqua o PBS. </li><li> Carico 10 ml di diluizione tallone SU UN emocitometro nel punto di introduzione del campione. </li><li> Contare le perline visto in una delle griglie 4 x 4 angolari. Calcolare il numero totale di perline accoppiate utilizzando la seguente formula: Count (1 angolo di 4 x 4 griglia) x (1 x 10 4) x (fattore di diluizione) x risospensione volume in ml. </li></ol> 4. Conferma di Antigen Coupling <ol><li> Risospendere la miscela magazzino di perline accoppiate agli antigeni di interesse da vortice e ultrasuoni per 20 sec. </li><li> Preparare una miscela tallone di lavoro diluendo le scorte di perline accoppiate ad una finaleconcentrazione di 100 perline / pl di ciascuna sfera unica situata all&#39;interno di PBS-1 tampone% BSA (PBS-BSA 1%, pH 7,4). </li><li> Preparare almeno 7 due diluizioni seriali di anti-IgG specie di anticorpo primario in base alle raccomandazioni del produttore a 96 pozzetti a fondo tondo con tampone PBS-BSA 1%. </li><li> Pre-bagnare una colonna 8 pozzetti separato (8 righe) di un filtro piastra inferiore 96 pozzetti per ciascun test di conferma accoppiamento dell&#39;antigene con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere surnatante tramite aspirazione. Aggiungere 50 ml di lavoro miscela sferette (perline antigene-coupled) ai pozzetti pre-umido. </li><li> Aggiungere 50 ml di diluizioni di anticorpi alle righe 1-7 di ciascuna colonna della piastra filtrante a 96 pozzetti e 50 ml di PBS-1 tampone BSA% alla riga 8 al posto di anticorpo diluito per servire come pozzi sfondo. Mescolare con una pipetta multicanale pipettando su e giù per 5 volte. Eseguire la stessa procedura per ogni insieme di sferette antigene-accoppiato ad essere confermata. </li><li> Coprire e lasciare incubare al buio a temperatura ambienteerature per 1 ora, un vortex a 500 rpm. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. </li><li> Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere 1x. Risospendere le sfere in 50 microlitri di PBS-BSA 1% con una pipetta multicanale. </li><li> Diluire biotinilati anti-specie specifico anticorpo di rilevazione secondario IgG a 16 mg / ml in PBS-BSA 1%. </li><li> Aggiungere 50 ml di anticorpo secondario diluito in ciascun pozzetto pipettando su e giù 5 volte. </li><li> Coprire piastra filtrante e lasciar incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere il lavaggio 1x. </li><li> Risospendere le sfere in 50 microlitri di PBS-BSA 1% con una pipetta multicanale. </li><li> Diluire streptavidina-R-ficoeritrina giornalista (SAPE) a 24 mg / ml in PBS-BSA 1%. </li><li> Aggiungere 50 ml di giornalista in ogni pozzetto e mescolare pipettando su e giù per 5 volte. </li><li> Csu piastra di filtraggio e lasciare ad incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere il lavaggio 1x. </li><li> Perline risospendere in 100 ml di PBS-BSA 1% e analizzare 50 ml utilizzando l&#39;analizzatore 29. Nota: I risultati del test immunologico multiplex bead-based sono misurati in fluorescenza mediana (MFI). Fare sempre riferimento alla versione più recente del manuale del software, se disponibile per evitare errori. </li></ol> 5. salivare Multiplex immunoenzimatico <ol><li> Rimuovere saliva dal -80 ° C freezer e lasciare scongelare a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere antigene accoppiato scorte perline da vortice e ultrasuoni per 20 sec. </li><li> Preparare una miscela sferette lavoro diluendo le scorte tallone accoppiato ad una concentrazione finale di 100 perline / ml di ogni insieme di sferette unico in PBS-1 tampone% BSA. </li><li> Preparare una diluizione 1: 4 di saliva wesimo PBS-1% tampone BSA in un 96 ben, piatto pozzo profondo. </li><li> Piastra filtro di pre-bagnato con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. </li><li> Aggiungere 50 ml di una miscela sferette di lavoro e un volume uguale di saliva diluita a 95 pozzetti delle piastre filtranti 96 e per una diluizione 1: 8 finale. Mescolare reazioni con una pipetta multicanale. Per il controllo di un bene, aggiungere 50 perline antigene-accoppiato microlitri più 50 ml di PBS-1 tampone% di BSA (come un sostituto di saliva). </li><li> Coprire e lasciar incubare al buio a temperatura ambiente per 1 ora, un vortex a 500 rpm. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere il lavaggio 1x. </li><li> perline risospendere in 50 ml di PBS-BSA 1% con una pipetta multicanale. </li><li> Diluire biotinilato di capra anti-IgG umane anticorpo di rilevazione secondario a 16 mg / ml in PBS-BSA 1%. </li><li> Aggiungere 50 ml diluito anticorpo secondario in ogni pozzetto e mescolare il contenuto conuna pipetta multicanale. </li><li> Coprire piastra filtrante e lasciar incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere il lavaggio 1x. </li><li> perline risospendere in 50 ml di PBS-BSA 1% con una pipetta multicanale. </li><li> Diluire streptavidina-R-ficoeritrina giornalista (SAPE) a 24 mg / ml in PBS-BSA 1%. </li><li> Aggiungere 50 ml giornalista in ogni pozzetto e mescolare con una pipetta multicanale. </li><li> Coprire piastra filtrante e lasciar incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere il lavaggio 1x. </li><li> Perline risospendere in 100 ml di PBS-BSA 1% e analizzare 50 ml utilizzando l&#39;analizzatore 29. Nota: I risultati del test immunologico multiplex sono misurati in mediana fluorescenza intensità unità (MFI). Fare sempre riferimentol&#39;ultima versione del manuale del software, se disponibile per evitare errori. </li></ol>

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</ol>

L&#39;Environmental Protection Agency degli Stati Uniti attraverso il suo Ufficio di Ricerca e Sviluppo finanziato e gestito la ricerca descritta qui. E &#39;stato sottoposto a controllo amministrativo dell&#39;Agenzia e approvato per la pubblicazione. La citazione di marchi o prodotti commerciali non costituisce approvazione o raccomandazione per l&#39;uso.

Questi risultati indicano che il metodo immunologico multiplex è utile per discriminare tra campioni di saliva che sono immunopositive o immunonegative. Per determinare immunopositività, un unico punto di cut-off è stato sviluppato calcolando la media più tre deviazioni standard dei log trasformato risposte MFI del controllo perline disaccoppiati testati con tutti i campioni di saliva. Il punto di cut-off concessa la possibilità di valutare l&#39;esposizione e immunoprevalence ad un singolo o più agenti patogeni. Questo...

L&#39;ottantotto per cento delle malattie diarroiche in tutto il mondo è associata con l&#39;esposizione umana ad acqua contaminata, alimenti non sicuri, e scarsa igiene / igiene, causando circa 1,5 milioni di morti, la maggior parte dei quali sono bambini 1. Questa è una delle principali cause di preoccupazione per i funzionari della sanità pubblica e dei responsabili politici. Nel tentativo di indagare le esposizioni e le malattie associate con vie d&#39;acqua ed altri agenti patogeni ambientali, abbiamo sviluppato un test immunologico multiplex per misurare gli anticorpi in campioni umani 2-4. Questo metodo può essere applicato a studi epidemiologici per determinare l&#39;esposizione umana a questi agenti patogeni e di definire meglio le infezioni immunoprevalence e incidenti. La saliva contiene molto promettente come alternativa al siero per la ricerca biomarker umana. Tra i vantaggi derivanti dall&#39;utilizzo di saliva sono la non invasività e facilità di raccolta del campione, a basso costo, ed i campioni possono essere facilmente raccolti da bambini 5-7 &lt;/ Sup&gt;. I campioni di siero e saliva sono stati ampiamente studiati per gli anticorpi contro H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, virus dell&#39;epatite A e C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, virus della dengue 16, virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV) 17, ed Escherichia coli O157: H7 18. Un immunodosaggio multiplex permette l&#39;analisi di analiti multipli simultaneamente all&#39;interno di un volume del campione singolo e all&#39;interno di un singolo ciclo o correre. Antigeni multiplex da C. jejuni, T. gondii, H. pylori, sono stati utilizzati virus dell&#39;epatite A, e due norovirus a misura umana salivare IgG 2-4 e IgA 3,4 e nel plasma IgG 2,3 risposte anticorpali a questi agenti patogeni con unbead-based immunologico multiplexing. Quando utilizzato in combinazione con studi epidemiologici di esposizione ai microbi in acqua, suolo e cibo, il tipo di analisi descritto in questo studio può fornire informazioni preziose per migliorare la comprensione delle infezioni causate da patogeni ambientali. Inoltre, i dati di anticorpi salivari ottenuti da tali studi possono essere utilizzati per migliorare i modelli di valutazione del rischio 19-22.

<table><tbody><tr><td>Attrezzature e software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td>75002446 Utilizzato per centrifugare campioni</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>VWR</td><td>G560</td><td>Utilizzato per miscelare campioni</td></tr><tr><td>Sonicatore (mini)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-337-22</td><td>Utilizzato per separare le perline</td></tr><tr><td>Pipettatori P10, P20, P100, P1000, 8 ch. </td><td>Capp</td><td>Vari Ematocitometri</td><td></td></tr><tr><td>(Linea Luminosa)</td><td>Housser Scientific&nbsp;</td><td>3200</td><td>Utilizzato per contare le perle accoppiate</td></tr><tr><td>Collettore a vuoto multischermo</td><td>Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>Utilizzato nelle fasi di lavaggio per rimuovere il surnatante</td></tr><tr><td>MicroShaker</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td>Utilizzato per agitare le perle durante le incubazioni</td></tr><tr><td>Rack per provette (1,5 ml e 0,5 ml) (assortito)</td><td>VWR</td><td>30128-346</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Mettler o altro</td><td></td><td>Utilizzato per misurare i reagenti di lavaggio per la produzione di tamponi</td></tr><tr><td>Dynabead Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>947-01</td><td>Utilizzato durante la fase di incubazione dell'accoppiamento</td></tr><tr><td>MatLab (R2014b)</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td>Utilizzato per analizzare i dati di risposta anticorpale</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2014</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>Utilizzato per analizzare i dati di risposta anticorpale</td></tr><tr><td>Luminex Analyzer con software xPonent 3.1</td><td>Luminex Corporation</td><td>LX200-XPON3.1</td><td>Strumento e software utilizzati per eseguire assay</td></tr><tr><td>Antigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GI.1 Virus Norwalk: p-particella</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Ospedale pediatrico di Cincinnati. Conc. finale 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>GII.4 Norovirus VA387: p-particella</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Cincinnati Children' Hospital. Conc. finale 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>Virus dell'epatite A: concentrato di grado II da coltura cellulare</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>8505</td><td>Antigene accoppiato a 100 &micro; g</td></tr><tr><td>Helicobacter pylori: lisato</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R14101</td><td>Antigene accoppiato a 25 &micro; g</td></tr><tr><td>Toxoplasma gondii: p30 ricombinante (SAG1)</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R18426</td><td>Antigene accoppiato a 25 &micro; g</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni: cellule intere uccise termicamente</td><td>KPL</td><td>50-92-93</td><td>Antigene accoppiato a 50 &micro; <</td></tr><tr><td>strong>Anticorpi primari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Norovirus</td> (<td>CCHMC)*</td><td>NA</td><td>Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento</td></tr><tr><td>Anti-epatite A IgG Meridian del topo</td> Life <td>Sciences</td><td>C65885M</td><td>Utilizzato per la conferma</td></tr><tr><td>dell'accoppiamento Anti-epatite A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento</td></tr><tr><td>BacTraceAffinity Anticorpo purificato contro Helicobacter pylori</td><td>KPL</td><td>01-93-94</td><td>Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento</td></tr><tr><td>pAb di capra a Toxoplasma gondii</td><td>Abcam</td><td>Ab23507</td><td>Utilizzato per la conferma</td></tr><tr><td>dell'accoppiamento BacTrace Goat anti-Campylobacter specie</td><td>KPL</td><td>01-92-93</td><td>Utilizzato per la conferma</td></tr> <tr><td>dell'accoppiamento<forte>Secondario&nbsp; Anticorpi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>705-065-149</td><td>Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento</td></tr><tr><td>Biotinilato Rabbit anti-Goat IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-13-06</td><td>Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento</td></tr><tr><td>Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-18-06</td><td>Utilizzato per la conferma</td></tr> <tr><td>dell'accoppiamentoAffinità Anticorpo purificato Biotina marcato capra anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>176-1506</td><td>Utilizzato per l'accoppiamento conferma</td></tr><tr><td><forte>Materiali di consumo</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml provette per microcentrifuga copolimero</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>Utilizzato come provette per microcentrifuga a basso legame</td></tr><tr><td>10 &; l ricariche per puntali per pipette</td><td>BioVentures</td><td>5030050C</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l ricariche per puntali per pipette</td><td>BioVentures</td><td>5030080C</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &micro; l ricariche per puntali per pipette</td><td>BioVentures</td><td>5130140C</td><td></td></tr><tr><td>Foglio</td><td>di</td><td></td> alluminio Vari fornitori <td>Utilizzato per mantenere le perle al buio durante le incubazioni</td></tr><tr><td>Piastre a pozzetti profondi</td><td>VWR</td><td>40002-009</td><td>Utilizzato per diluire campioni di saliva</td></tr><tr><td>Piastre filtranti multischermo</td><td>Millipore</td><td>MABVN1250</td><td>Utilizzato per eseguire saggi</td></tr><tr><td>Sistema di raccolta della saliva Oracol</td><td>Malvern Medical Developments Limited</td><td></td><td>Utilizzato per la raccolta della saliva</td></tr><tr><td>Reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsfere carbossilate (perline)</td><td>Luminex Corporation</td><td>A seconda del set di perline</td><td>Gli antigeni sono accoppiati alle microsfere</td></tr><tr><td>EDC (1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimmide cloridrato)</td><td>Pierce</td><td>77149 o 22980</td><td>Utilizzato nell'attivazione</td></tr> <tr><td>delle perleSulfo-NHS (N-idrossisulfosuccinimide)</td><td>Pierce</td><td>24510</td><td>Utilizzato nell'attivazione di perline</td></tr><tr><td>Steptavidin-R-ficoeritrina (1 mg/ml)</td><td>Sonde molecolari</td><td>S-866</td><td>Utilizzato come reporter</td></tr><tr><td>MES (2-[N-Morpholino]acido etansolfonico)</td><td>Sigma</td><td>M-2933</td><td>Utilizzato per l'accoppiamento</td></tr><tr><td>Tween-20 (poliossietilenesorbitano monolaurato)</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>Utilizzato nel tampone di lavaggio per rimuovere</td></tr> <tr><td>i tamponi proteici di legame non specifici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-TBN Blocking/ Buffer di conservazione (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% Azide, pH 7,4)**</td><td></td><td></td><td>Filtrare Sterilizzare e conservare a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl BSA</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A-7888</td><td>0,1% (p/v)Tween-20</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>0,2% (v/v)</td></tr><tr><td>Sodio azide (0,05% azide)**</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td>**Attenzione</forte>: L'azoturo di sodio è acutamente tossico. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Indossare DPI adeguati. Smaltire secondo le leggi applicabili.</td></tr><tr><td>MES/Tampone di accoppiamento (0,05 M MES, pH 5,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES (2-[N-Morpholino]acido etansolfonico)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7,4)&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Filtra Sterilizza e conserva a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>PBS, 1% BSA, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3688</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA</td></tr><tr><td>Activation Buffer (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)</forte></td><td></td><td></td><td>Filtro Sterilizzare e conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (Fosfato di sodio, monobasico anidro)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td>0,1 M NaH2PO4</td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Wash Buffer (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>Filter Sterilizzare e conservare a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3563</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN</td></tr></tbody></table>

lo sviluppo di un anticorpo salivare multiplex immunoenzimatico per misurare l&#39;esposizione umana ad agenti patogeni ambientali

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

L&#39;eziologia e impatti di esposizione umana ad agenti patogeni ambientali sono di grande preoccupazione in tutto il mondo e, quindi, la capacità di valutare efficaci approcci high-throughput di esposizione e le infezioni utilizzando costo sarebbe indispensabile. Questo manoscritto descrive lo sviluppo e l&#39;analisi di un immunodosaggio multiplex bead-based in grado di misurare la presenza di anticorpi nella saliva umana per diversi patogeni contemporaneamente. La saliva è particolarmente interessante in questa applicazione, perché è non invasiva, meno costoso e più facile da raccogliere dal siero. Gli antigeni da patogeni ambientali sono stati accoppiati a microsfere carbossilati (perle) e utilizzati per misurare gli anticorpi in molto piccoli volumi di campioni di saliva umana utilizzando una, saggio soluzione fasi bead-based. Beads sono stati accoppiati con gli antigeni di Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G e G I.1 II.4) e virus dell&#39;epatite. Per garantire che gli antigeni sono stati sufficientemente accoppiatile perline, l&#39;accoppiamento è stata confermata usando specie-specifici, anticorpi di cattura primario di derivazione animale, seguita da incubazione con biotinilati anti-specie anticorpi di rilevamento secondarie e streptavidina-R-ficoeritrina giornalista (SAPE). Come controllo per misurare legame non specifico, un insieme di sferette è stata trattata in modo identico agli altri tranne che non è stato accoppiato a qualsiasi antigene. Le perle antigene-accoppiati e di controllo sono stati poi incubati con campioni di saliva umana prospetticamente raccolti, misurato su un analizzatore alto rendimento basato sui principi della citometria a flusso, e la presenza di anticorpi ciascun antigene è stata misurata in unità di intensità mediana fluorescenza (MFI) . Questo immunodosaggio multiplex ha una serie di vantaggi, tra cui più dati con meno di esempio; riduzione dei costi e del lavoro; e la possibilità di personalizzare il dosaggio per molti obiettivi di interesse. I risultati indicano che il test immuno-multiplex salivare può essere in grado di individuare esposizioni e infezioni precedenti, che può essere especially utile negli studi di sorveglianza che coinvolgono grandi popolazioni umane.

Un unico insieme di sferette è stato utilizzato come controllo per misurare il legame non specifico e campione a campione variabilità. Queste perle sono state trattate in maniera identica ai antigene accoppiato perline con l&#39;eccezione che non erano incubate con qualsiasi antigene in fase di accoppiamento. valori di MFI&gt; 500 ottenuti dalle sfere di controllo incubati con tutti i campioni di saliva sono stati rimossi da ulteriori analisi a causa della contaminazione sospetta dal sie...

Nell'attuale clima di scarsità di risorse, stanno emergendo nuove tecnologie che consentono ai ricercatori di condurre studi in modo più economico, veloce e con maggiore precisione. Qui descriviamo lo sviluppo di un test immunologico multiplex di anticorpi salivari basato su microsfere per misurare l'esposizione umana a più patogeni ambientali contemporaneamente.

Lo sviluppo di un anticorpo salivare Multiplex immunoenzimatico per misurare l&#39;esposizione umana ad agenti patogeni ambientali

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

L'obiettivo generale di questo saggio immunoistochimico multiplo basato su microsfere per la rilevazione di anticorpi salivari è identificare gli agenti eziologici responsabili di malattie sintomatiche e asintomatiche associate all'ambiente, misurando contemporaneamente le risposte anticorpali di tipo IGG a più patogeni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della scienza dell'esposizione. Ad esempio, quali patogeni sono responsabili dell'insorgenza di malattie in specifiche popolazioni.Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per misurare rapidamente ed in modo economico gli anticorpi contro molteplici analiti contemporaneamente, impiegando volumi di campione molto ridotti. Questo metodo può fornire informazioni sugli agenti eziologici e sulle loro fonti di esposizione, incluse le vie trasmesse da alimenti, acqua e aria. La dimostrazione ufficiale di questa procedura è fondamentale perché, se non viene impostata correttamente, i risultati possono risultare non affidabili.Iniziare vortexando e sonicando le miscele stock di perline legate agli antigeni di interesse per 20 secondi alla volta, al fine di ottenere sospensioni omogenee di perline. Successivamente, diluire le stock di perline coniugate a una concentrazione finale di 100 perline per microlitro di ciascun set unico di perline in PBS, integrato con 1% BSA. Poi, preparare almeno sette diluizioni seriali a due raddoppi di anticorpo primario anti-specie IGG, in PBS aggiunto di BSA, in una piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo, seguendo le raccomandazioni del produttore.Inumidire preventivamente una colonna separata da otto per dodici di una piastra filtrante a 96 pozzetti per ciascun test di conferma dell'accoppiamento dell'antigene con 100 microlitri di buffer di lavaggio ed eliminare il sovranatante mediante vuoto. Successivamente, aggiungere 50 microlitri delle perline legate all'antigene nei pozzetti pre-inumiditi e 50 microlitri dell'anticorpo diluito in serie nelle righe da uno a sette della piastra a 96 pozzetti con filtro, e aggiungere 50 microlitri di PBS più BSA nella riga otto come controllo di fondo per l'anticorpo diluito. Utilizzare una pipetta multicanale per mescolare il contenuto di ciascun pozzetto su e giù per cinque volte.Quindi coprire la piastra e incubare gli anticorpi con le perle legate all'antigene al buio, a temperatura ambiente, su uno scuotitore per micropiastre a 500 rpm. Dopo un'ora, aspirare il soprannatante e lavare le pozzette con due aliquote da 100 microlitri di buffer di lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, sostituire il buffer con 50 microlitri di PBS contenente BSA.Ora diluire l'anticorpo secondario di rilevamento anti-IgG specifico per specie, fino a 16 microgrammi per millilitro in PBS più BSA, e aggiungere 50 microlitri di anticorpo secondario diluito in ogni pozzetto. Incubare le perle e gli anticorpi a temperatura ambiente al buio per 30 minuti su un agitatore per piastre. Al termine dell'incubazione, aspirare il sopranatante e lavare le perle con due aliquote da 100 microlitri di tampone di lavaggio.Dopo il secondo lavaggio, risospendere le perle in 50 microlitri di PBS con BSA e diluire il marcatore streptavidina r-ficoeritrina a 24 microgrammi per millilitro in PBS con BSA. Aggiungere 50 microlitri del marcatore a ogni pozzetto e mescolare mediante pipettaggio. Incubare la piastra al buio per 30 minuti a temperatura ambiente su agitatore, seguita da due risciacqui con 100 microlitri di buffer di lavaggio come illustrato.Quindi risospendere le perle in 100 microlitri di PBS aggiunto di BSA e valutare le perle accoppiate all'antigene sull'analizzatore. Dopo aver risospeso le scorte di perle accoppiate mediante vortex e sonificazione per 20 secondi, diluire le scorte di perle accoppiate a una concentrazione finale di 100 perle per microlitro di ciascun set unico di perle in PBS aggiunto di BSA. Preparare quindi una diluizione da uno a quattro di saliva a temperatura ambiente in PBS aggiunto di BSA in una piastra a 96 pozzetti con pozzetti profondi.Inumidire preliminarmente una piastra filtrante con 100 microlitri di soluzione di lavaggio ed aspirare il soprannatante. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di microsferette legate all'antigene e un volume uguale di saliva diluita in 95 pozzetti della piastra filtrante a 96 pozzetti per una diluizione finale da uno a otto. Allo stesso tempo, aggiungere 50 microlitri di microsferette legate all'antigene e 50 microlitri di PBS con BSA soltanto nel pozzetto di controllo.Incubare le perle al buio a temperatura ambiente per un'ora sulla piastra agitata a 500 giri al minuto. Quindi aspirare il soprannatante e lavare le pozzette due volte con 100 microlitri di soluzione di lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le perle in 50 microlitri di PBS contenente BSA.Diluire l'anticorpo secondario e aggiungere 50 microlitri di questo in ogni pozzetto. Dopo aver mescolato il contenuto dei pozzetti con una pipetta multicanale, incubare la piastra sullo shaker al buio per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare i pozzetti due volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio e risospendere le perle in 50 microlitri di PBS fresco più BSA. A questo punto diluire il marcatore e aggiungere 50 microlitri in ogni pozzetto.Mescolare accuratamente con una pipetta multicanale. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente sullo shaker al buio, lavare i pozzetti due volte come indicato, quindi risospendere le perle in 100 microlitri di PBS con BSA e analizzare i campioni sull'analizzatore. Per assicurare che le perle coniugate con l'antigene siano in grado di rientrare nel range dinamico del saggio, un corretto coniugio è definito come un'intensità media di fluorescenza maggiore o uguale a 18.000.Come dimostrato per queste conferme rappresentative dell'accoppiamento degli antigeni nel saggio per C.jejuni e T.gondii. Sulla base del punto di cutoff stabilito, i tassi di immunoprevalenza per i campioni sono variati da circa il 2% per T.gondii a quasi il 50% per il genogruppo 1.1 del Norovirus, indicando che il tasso di immunoprevalenza era più elevato per i Norovirus, seguito dall'Epatite A e da H.Pylori. Mentre il 32% dei campioni risultava immunonegativo per tutti i patogeni nel saggio, il 68% risultava immunopositivo per uno o più patogeni.Una volta padroneggiata, questa procedura può essere completata in circa quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere le perle al buio per evitare il fotoblecamento. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come ELISA e il Western blotting possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande riguardo sensibilità e specificità.Oltre alla cross-reattività degli anticorpi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nei campi dell'epidemiologia, della scienza dell'esposizione e della microbiologia clinica per esplorare i rischi umani derivanti da esposizioni ambientali. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una comprensione molto chiara di come sviluppare, analizzare e interpretare i risultati di un saggio immunoanalitico multiplex, misurando contemporaneamente gli anticorpi contro più patogeni.Non dimenticare che lavorare con fluidi corporei e azoturo di sodio può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come indossare idonei dispositivi di protezione individuale e smaltire correttamente i reagenti durante l'esecuzione di questa procedura.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Utilizzo di microsfere Luminex Corporation xMAP tecnologia, abbiamo sviluppato il immunoenzimatico Multiplexed fluorimetrico (MFIA) per sierosorveglianza di varie specie di animali da laboratorio. Il MFIA è un microarray sospensione dove antigene, controllo di tessuto o immunoglobuline sono legati covalentemente a microsfere di polistirene codice colore. Il metodo di prova MFIA così come i vari argomenti di risoluzione dei problemi è indirizzata.

Multiplex fluorimetrico Metodologia di test immunoenzimatico e risoluzione dei problemi

Questo video mostra una tecnica di immunodosaggio multiplex basata su perline per rilevare simultaneamente gli anticorpi per più agenti patogeni ambientali nella saliva umana. Le perle fluorescenti sono state accoppiate ad antigeni di diversi agenti patogeni, che sono stati catturati utilizzando anticorpi nel campione di saliva umana. Dopo aver marcato gli anticorpi utilizzando un reporter fluorescente, le perle sono state analizzate utilizzando la citometria a flusso per valutare la presenza...

Un test immunologico multiplex basato su microsfere per identificare gli anticorpi patogeno-specifici nella saliva

Descriviamo una procedura per la profilatura proteine ​​salivari utilizzo di matrici di anticorpi a base di microsfere-multiplex. Gli anticorpi monoclonali sono stati legati covalentemente a colorante fluorescente con codifica 4.5 micron microsfere polimeriche utilizzando la chimica carbodiimmide. Le microsfere modificati sono stati depositati in pozzetti in fibra ottica per misurare i livelli di proteine ​​nella saliva mediante saggi immunologici panino fluorescenza.

Multiplex fluorescente Microarray per salivare umana Protein Analysis Utilizzando polimerici Microsfere e fasci di fibre ottiche

Questo protocollo descrive una tecnica non invasiva per il campionamento del liquido di rivestimento mucoso indisturbati dalle vie respiratorie superiori. Può essere utilizzato per eseguire la quantificazione dei livelli in vivo dei mediatori di proteina, quali citochine e chemochine, in soggetti di tutte le età.

Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore

Qui presentiamo un protocollo per descrivere lo sviluppo e la convalida di una singola molecola matrice digitale analisi di ELISA, che consente la rilevazione ultra-sensibile di tutti i sottotipi di IFN-α in campioni umani.

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

Questa carta presenta un protocollo per la rilevazione di siero-specific IgE con un sistema di chemiluminescenza basati su cartuccia di microfluidica e la valutazione della sua utilità nella diagnosi di allergia.

Applicazione della tecnologia microfluidica Biochip per rilevare siero allergene-specifiche dell'immunoglobulina E (sIgE)

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un microarray proteico costruito stampando antigeni influenzali su vetrini rivestiti di nitrocellulosa per sondare simultaneamente il siero per più isotipi anticorpi contro oltre 250 antigeni provenienti da diversi ceppi di virus, quindi consentendo la misurazione dell'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus.

Uso di un microarray antigeno influenzale per misurare l'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus

Un sistema di analisi di flusso per saggi multiplexati basati su perle che fornisce una lettura a due reporter è stato utilizzato per lo sviluppo di saggi sierologici multiplex e di neutralizzazione degli anticorpi in grado di misurare contemporaneamente gli anticorpi IgG e IgM neutralizzanti per SARS-CoV-2.

Un test di neutralizzazione rapido e multiplex Dual Reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 per un sistema di analisi del flusso basato su perle multiplexate

Questo articolo descrive un metodo conveniente per monitorare i cambiamenti dinamici nei titoli anticorpali per due isotipi di immunoglobuline contemporaneamente (IgA, IgM o IgG) derivanti da una risposta immunitaria all'infezione o alla vaccinazione da SARS-CoV-2. Questo "Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel" impiega tre test immunologici indiretti costruiti su microsfere codificate che vengono lette utilizzando un lettore multiplex basato sul flusso con funzionalità "dual-channel".

Monitoraggio dinamico della sieroconversione utilizzando un test multianalyte immunobead per Covid-19

Un sistema di analisi del flusso di fluorescenza a doppio reporter a tre canali è stato utilizzato per sviluppare un test immunologico multiplex basato su microsfere che valuta simultaneamente i campioni di siero per IgG e IgM suscitati contro più antigeni di diverse specie di Borrelia che causano la borreliosi di Lyme in Europa e Nord America.

Rilevamento simultaneo di diverse classi di anticorpi in un test sierologico multiplexato

I dosaggi immunologici a fluorescenza multiplex stanno diventando un punto di riferimento per i test sierologici. La loro applicazione, tuttavia, è limitata dalla complessità e dai lunghi processi di accoppiamento perlina-analita. Questo rapporto presenta un protocollo di accoppiamento di microsfere multiplex semi-automatizzato e riproducibile che è paragonabile al metodo standard, riducendo notevolmente il tempo necessario per ottenere i risultati.

Un test sierologico multiplex per il rilevamento delle risposte anticorpali agli arbovirus

Scopri lo sviluppo di un immunoassay multiplex salivare per misurare l'esposizione umana a patogeni ambientali. Questo metodo permette di analizzare anticorpi IgG contro più agenti patogeni simultaneamente in modo rapido ed economico.

Lo sviluppo di un anticorpo salivare Multiplex immunoenzimatico per misurare l'esposizione umana ad agenti patogeni ambientali

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