Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l'antigene alle cellule T

L'obiettivo generale di questo modello di colite indotta da antigene è determinare se i fagociti mononucleari positivi per CX3CR1 interagiscono con e attivano linfociti T CD4 positivi durante la colite specifica per antigene e se questa espansione dei linfociti T effettrici dipendente dai fagociti mononucleari avviene all'interno della lamina propria intestinale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie infiammatorie intestinali, come ad esempio quali tipi di interazione avvengano tra le cellule presentanti l'antigene e i linfociti T effettrici nella lamina propria del colon. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio delle interazioni tra cellule immunitarie e dei fattori che portano alla patogenicità delle malattie infiammatorie intestinali.

Questo metodo utilizza il modello di colite mediante trasferimento di cellule T, in cui cellule T naive CD4 specifiche per l'antigene, fluorescenti rosse, vengono trasferite in un ospite immunodeficiente che esprime la proteina fluorescente verde nelle cellule mononucleate. Successivamente al trasferimento cellulare, si somministra per via orale, mediante sondino, batteri esprimenti un antigene fluorescente blu. Gli eventi immunitari che si verificano nella lamina propria intestinale degli ospiti possono essere monitorati in diverse fasi dello sviluppo della malattia.

Utilizzare forbici da dissezione per aprire longitudinalmente il colon e lavare il tessuto in una piastra di Petri contenente 25 millilitri di PBS per rimuovere eventuali detriti e muco. Tagliare il colon in pezzi di cinque-otto millimetri e posizionare i frammenti risultanti in 20 millilitri di DPBS fresco senza calcio e magnesio, integrato con 10 millimoli di HEPES e 5 millimoli di EDTA. Vortexare il tubo con il campione per 30 secondi alla velocità massima.

Quindi, incubare a 37 gradi Celsius per dieci minuti con agitazione delicata per rimuovere l'epitelio. Al termine dell'incubazione, vortexare nuovamente per 30 secondi. Successivamente, eliminare il soprannatante contenente le cellule epiteliali.

Trasferire i pezzi di tessuto in un nuovo tubo contenente 20 millilitri di PBS fresco, tampone HEPES ed EDTA ed eseguire nuovamente l'incubazione con i passaggi di vortexaggio prima e dopo. Dopo la terza ripetizione, tutte le cellule epiteliali sono state rimosse e il soprannatante risulta limpido. Lavare delicatamente i frammenti di tessuto in PBS per rimuovere eventuali cellule epiteliali residue.

Tagliare i frammenti di tessuto in pezzi di due per due millimetri e trasferirli per la digestione in dieci millimetri di mezzo RPI, integrato con 0,5 milligrammi per millilitro di collaghenasi di tipo otto e dieci unità per millilitro di DNAasi uno. Vortexare i campioni per 30 secondi. Successivamente, incubare i pezzi di tessuto a 37 gradi Celsius con agitazione per 30-35 minuti, vortexando il tubo ogni cinque minuti durante l'incubazione.

Una volta che il tessuto è stato digerito, filtrare la sospensione risultante attraverso un filtro cellulare da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Lavare il filtro cellulare una volta e centrifugare per ottenere il pellet della sospensione di cellule singole. Infine, lavare le cellule una volta in PBS e centrifugare.

Quindi, determinare il numero di cellule vitali mediante esclusione del blu di tripano. La proteina della ovalbumina fluorescente ciano prodotta da e. coli attiva la produzione di interferone gamma nelle cellule OT-II in vitro, a differenza di e.

coli che esprimono solo CFP. L'imaging confocale 3D ex vivo del tessuto colonico di topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde, alimentati con uova di e. coli PCFP, dimostra la presenza di batteri che esprimono la proteina fluorescente all'interno delle cripte coliche vicino alle cellule epiteliali intestinali e co-localizzati con i fagociti intestinali dell'ospite.

In animali OT-II rossi, le cellule T positive per CD4 sono caratterizzate dalla loro co-espressione di proteina fluorescente rossa e V beta cinque punto uno. Quando vengono sfidati con e. coli PCFP ova, topi transgenici deficienti di linfociti BNT che esprimono proteina fluorescente verde e che sono stati sottoposti a trapianto adottivo di cellule T positive per CD4 OT-II rosse e positive per CD62 ligando perdono rapidamente peso corporeo e sviluppano segni clinici di colite.

Sette giorni dopo il trasferimento delle cellule, solo pochi fagociti dell'ospite hanno campionato le uova di e. coli PCFP e le cellule OT-II positive al rosso non vengono rilevate. Quattordici giorni dopo il trasferimento cellulare, i fagociti dell'ospite che hanno campionato l'e.

le uova di e. coli PCFP si trovano in prossimità delle cellule OT-II di colore rosso trasferite in modo adottivo. A 21 giorni dal trasferimento cellulare, un elevato numero di cellule dell'ospite ha riconosciuto le uova di e. coli PCFP e le cellule OT-II di colore rosso del donatore, che si riscontrano diffuse nell'intera lamina propria del colon, sono in contatto stretto con i fagociti intestinali dell'ospite.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore se eseguita correttamente. Dopo questo procedimento, altri metodi come la colorazione dei linfociti intestinali e l'analisi delle citochine sieriche possono essere effettuati per rispondere ad ulteriori domande riguardo lo stato di attivazione delle cellule T CD4 e per confermare la gravità della colite. Dopo ogni sviluppo, questa tecnica apre la strada alla ricerca nel campo dell'immunologia per esplorare i piccoli eventi che portano alla malattia infiammatoria intestinale nel modello murino.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule immunitarie della lamina propria del colon per l'analisi ex vivo successiva.