Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l'antigene alle cellule T

L'obiettivo generale di questo modello di colite guidata dall'antigene è determinare se i fagociti mononucleati CX3, CR1 positivi interagiscono e attivano le cellule T CD4 positive durante la colite antigene-specifica e se questa espansione delle cellule T effettrici mononucleate fagocita dipendente si verifica all'interno della lamina propria intestinale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie infiammatorie intestinali, come ad esempio quali tipi di interazione si verificano all'interno delle cellule presentanti l'antigene e delle cellule T effettrici nella lamina propria del colon. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di studiare l'interazione delle cellule immunitarie e gli elementi che portano alla patogenicità della malattia infiammatoria intestinale.

Questo metodo utilizza il modello di colite da trasferimento di cellule T, in cui le cellule T CD4 naive fluorescenti CD4 specifiche per l'antigene rosso vengono trasferite all'ospite immunodeficiente, esprimendo la proteina fluorescente verde nelle cellule mononucleate. Il trasferimento cellulare è seguito dalla sonda orale dei batteri fluorescenti blu che esprimono l'antigene. Gli eventi immunitari che si verificano nella lamina propria intestinale degli ospiti possono essere monitorati in vari stadi dello sviluppo della malattia.

Usa le forbici da dissezione per aprire longitudinalmente il colon e lava il tessuto in una capsula di Petri contenente 25 millilitri di PBS per rimuovere eventuali detriti e muco. Tagliare il colon in pezzi da cinque a otto millimetri e posizionare i frammenti risultanti in 20 millilitri di DPBS fresco senza calcio e magnesio, integrati con dieci millimolari di HEPES e cinque millimolari di EDTA. Agitare il tubo con il campione per 30 secondi alla massima velocità.

Quindi, incubare a 37 gradi Celsius per dieci minuti agitando delicatamente per rimuovere l'epitelio. Al termine dell'incubazione, Vortex nuovamente per 30 secondi. Quindi, scartare il surnatante contenente le cellule epiteliali.

Trasferire i pezzi di tessuto in una nuova provetta contenente 20 millilitri di tampone PBS, HEPES ed EDTA freschi e ripetere l'incubazione con le fasi di vortice prima e dopo. Dopo la terza ripetizione, tutte le cellule epiteliali vengono rimosse e il surnatante è pulito. Lavare delicatamente i frammenti di tessuto in PBS per rimuovere eventuali cellule epiteliali residue.

Tagliare i frammenti di tessuto in pezzi di due millimetri per due e trasferire i pezzi per la digestione in dieci millimetri di terreno RPI, integrati con 0,5 milligrammi per millilitro di collagenasi di tipo otto e dieci unità per millilitro di DNAsi uno. Agitare i campioni per 30 secondi. Quindi, incubare i pezzi di tessuto a 37 gradi Celsius agitando per 30-35 minuti e agitare la provetta ogni cinque minuti durante l'incubazione.

Quando il tessuto è stato digerito, filtrare l'impasto risultante attraverso un colino cellulare da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Lavare una volta il filtro cellulare e centrifugare la sospensione a cellula singola. Infine, lavare una volta le celle in PBS e centrifugare.

Quindi, determinare il numero di celle vitali mediante esclusione del blu di tripano. La proteina fluorescente ciano che produce la proteina ovoalbumina e. coli attiva la produzione di interferone gamma nelle cellule OT-II in vitro in contrasto con e.

coli che esprimono solo la PCP. L'imaging confocale 3D ex vivo del tessuto del colon di topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde, alimentati con ovuli PCFP di e. coli, dimostra la presenza di batteri che esprimono la proteina fluorescente all'interno delle cripte del colon vicino alle cellule epiteliali intestinali e co-localizzati con i fagociti intestinali dell'ospite.

Negli animali rossi OT-II, le cellule T CD4 positive sono caratterizzate dalla loro co-espressione della proteina fluorescente rossa e della V beta cinque virgola uno. Quando vengono sfidati con ovuli PCFP di E. coli, i topi transgenici fluorescenti verdi che esprimono la proteina fluorescente verde carenti di linfociti BNT che sono stati trapiantati adottivamente con cellule T CD4 CD62 positive al ligando rosso OT-II perdono rapidamente peso corporeo e sviluppano segni clinici di colite.

Sette giorni dopo il trasferimento cellulare, solo pochi fagociti ospiti hanno campionato gli ovuli PCFP di E. coli e i globuli rossi OT-II positivi non sono rilevati. 14 giorni dopo il trasferimento cellulare, i fagociti ospiti che hanno campionato l'e.

coli PCFP si trovano in prossimità dei globuli rossi OT-II positivi trasferiti in modo adottivo. Entro 21 giorni dal trasferimento cellulare, un numero elevato di cellule ospiti ha campionato gli ovuli PCFP di E. coli e i globuli rossi OT-II positivi del donatore, che si trovano sparsi in tutta la lamina propria del colon, sono a stretto contatto con i fagociti intestinali dell'ospite.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore se viene eseguita correttamente. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la colorazione dei linfociti intestinali e l'analisi delle citochine sieriche per rispondere a ulteriori domande sullo stato di attivazione delle cellule T CD4 e per confermare la gravità della colite. Dopo ogni sviluppo, questa tecnica apre la strada alla ricerca nel campo dell'immunologia per esplorare i piccoli eventi che portano alla malattia infiammatoria intestinale nel modello murino.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule immunitarie della lamina propria del colon per l'analisi ex vivo a valle.