Il colorimetrico rilevamento visivo del Multi-nucleotide polimorfismi su una piattaforma di manipolazione pneumatica Droplet

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di combinare un metodo semplice per rilevare visivamente polimorfismi multinucleotidici con una piattaforma di manipolazione pneumatica delle gocce. La piattaforma di rilevamento del DNA si trova su una superficie aperta ed è semplice da utilizzare per i ricercatori biochimici. Abbiamo studiato un semplice strumento per rilevare ripetutamente mutazioni genetiche e malattie genetiche.

Ha un potenziale maggiore aiutandoci a capire come la variazione genetica porta alla malattia. Abbiamo combinato due metodi nuovi e semplici. Il polimorfismo multinucleotidico può essere rilevato sulla piattaforma di manipolazione pneumatica delle goccioline ad occhio nudo e senza alcuno strumento aggiuntivo.

Il metodo per rilevare il polimorfismo multinucleotidico sarà dimostrato da Tzu-Ming Wang, il medico del nostro gruppo. Per iniziare questa procedura, preparare una soluzione di 100 micromolari di DNA sonda come indicato nel protocollo di testo. Quindi, aggiungere il DNA della sonda a una soluzione di nanoparticelle d'oro di un OD per millilitro.

Portare la concentrazione finale di SDS a 0,01% e di PBS a 0,01 molare. Lasciare incubare la soluzione per 20 minuti. Successivamente, aumentare la concentrazione di cloruro di sodio a 0,05 molari aggiungendo una soluzione di due molari di cloruro di sodio e 0,01 molari di PBS.

Mantenere la concentrazione di SDS allo 0,01% e lasciare incubare la soluzione per altri 20 minuti. Aumentare la concentrazione di cloruro di sodio con incrementi di 0,1 molari a intervalli di 20 minuti fino a raggiungere la concentrazione finale di un molare. Incubare la soluzione a 23 gradi Celsius per una notte su un rotatore.

Dopo che i campioni di DNA e le nanoparticelle d'oro si sono coniugati, centrifugare la soluzione a 7.000 volte g per 30 secondi. Rimuovere il surnatante. Quindi, preparare una soluzione di nanoparticelle d'oro a 25 nanomolari risospendendo il pellet in acqua deionizzata.

Preparare i campioni di DNA target come indicato nel protocollo di testo. Aggiungere sei microlitri di soluzione di sonda di nanoparticelle d'oro in ciascun campione di DNA con cloruro di sodio. Utilizzando un miscelatore a vortice, agitare ogni soluzione campione per cinque minuti a 23 gradi Celsius.

Quindi, aggiungere sei microlitri di 400 millimolari di idrossilammina e sei microlitri di acido cloroaurico 25,4 millimolare a ciascuna soluzione del campione di DNA. Metti da parte questi campioni poiché si verificherà un costante cambiamento di colorazione nell'ora successiva. le dimensioni, le proprietà ottiche dipendenti dalla forma della nanoparticella, il numero di discrepanze in un campione di frammento di DNA tipico possono essere distinti a occhio.

Per iniziare a fabbricare la piattaforma di manipolazione delle gocce, utilizzare una macchina a controllo numerico computerizzato dotata di una punta da trapano da 0,5 millimetri per produrre mastermold basati su PMMA con microstrutture. Per il trapano, utilizzare una velocità di avanzamento di sette millimetri al secondo e una velocità di rotazione di 26.000 giri/min e ispezionare gli stampi dopo la perforazione. Utilizzare un soffiatore d'aria e acqua deionizzata per pulire la superficie dei mastermold e rimuovere eventuali residui di PMMA.

Successivamente, preparare una miscela 10 a uno di base PDMS e agente indurente. Degassare la miscela in un essiccatore fino a rimuovere tutte le bolle d'aria. Quindi, versare la miscela PDMS nello stampo master.

Infornare per tre ore a 60 gradi Celsius per ottenere le microstrutture inverse nelle camere d'aria e nei canali d'aria. Al termine della cottura, rimuovere lo strato PDMS dallo stampo master e praticare dei fori per le prese d'aria di aspirazione. Utilizzare un sistema di trattamento al plasma di ossigeno per pulire la membrana PDMS e lo strato PDMS.

Dopo il trattamento, incollare la membrana PDMS e lo strato PDMS, quindi praticare dei fori in questa struttura coniugata. Quindi, incollare insieme il PDMS e il substrato di vetro utilizzando una piastra calda a 90 gradi Celsius per 10 minuti. Una volta che gli strati sono stati incollati insieme, posizionare la piastra composita in una macchina da taglio laser PDMS con la membrana rivolta verso l'alto.

Importa il file dwg per definire l'area super idrofobica e nota che questo verrà inciso direttamente nella membrana PDMS. Pulire la superficie superidrofobica appena incisa con acqua deionizzata. Questo laverà via eventuali residui carbonizzati.

Dopo aver pulito la superficie, collegare l'ingresso di aspirazione dell'aria e la pompa del vuoto tramite un'elettrovalvola. Quindi, collegare l'elettrovalvola a un computer per controllarla con un modulo USB IO digitale. Una volta installata la piattaforma pneumatica di manipolazione delle gocce, aggiungere 10 microlitri di DNA bersaglio 0,5 micromolare sull'area superidrofobica.

Quindi, aggiungere 10 microlitri di soluzione di sonda di nanoparticelle d'oro 25 nanomolari appena ibridata accanto alla goccia di DNA bersaglio. Utilizzare un semplice programma per controllare l'aspirazione dell'aria alla piattaforma tramite un'elettrovalvola. Impostare la pressione a meno 80 kilopascal e la frequenza di guida a cinque hertz.

Fornire aspirazione lungo i percorsi di vibrazione della gocciolina, provocandone la collisione e la fusione. Quindi, mescolare la gocciolina coalescente manipolando l'aspirazione per far rotolare il campione per tre minuti. Aggiungere due microlitri di idrossilammina da 400 millimolari e due microlitri di acido cloroaurico da 25,4 millimolari all'area superidrofobica della piattaforma di manipolazione pneumatica delle goccioline.

Manipolare l'aspirazione in modo che le goccioline si scontrino e si fondano. Quindi, mescola la gocciolina unita facendola rotolare per un minuto. Osserva il colore della gocciolina finale ad occhio nudo.

In questo studio, i polimorfismi multinucleotidici sono rilevati coloremetricamente utilizzando la crescita mediata dall'ibridazione del DNA di sonde di nanoparticelle d'oro. Qui, i campioni di DNA possiedono diverse affinità con il DNA della sonda, causando differenze nella crescita delle nanoparticelle d'oro, viste come un cambiamento di colore. Il campione di DNA non corrispondente a tre coppie di basi ha una minore ibridazione rispetto al DNA completamente complementare, che può essere visto come notevoli distinzioni di colore, specialmente a concentrazioni più elevate.

Il DNA a sei basi non corrispondenti ha una debole affinità di ibridazione con la sonda, e quindi la dimensione di crescita delle nanoparticelle d'oro era piccola. Questa analisi coloremetrica si è dimostrata ripetibile quando i campioni vengono manipolati tramite una piattaforma di aspirazione pneumatica, poiché i risultati della mancata corrispondenza del DNA sono facilmente osservabili ad occhio nudo. Una volta padroneggiata, l'intera procedura richiede meno di cinque minuti dall'aggiunta del campione e del reagente fino al risultato degli stessi, che è molto più veloce del metodo tradizionale.

Il totale in ogni operazione è di soli 10 microlitri, che è significativamente inferiore a quanto richiesto in un sistema di grandi dimensioni. Seguendo questa procedura, una volta confermata la variazione di sequenza dello spazio del frammento di DNA, è responsabile di una specifica malattia. Il prodotto appositamente progettato può essere utilizzato per acquisire una serie di discrepanze del DNA del campione.

La piattaforma pneumatica di manipolazione delle goccioline è più biocompatibile di altri metodi come la ponderazione ottica, l'elettrofluorescenza del colorante, l'elettroponderazione e l'attuazione capillare di shoomoo. Il metodo di rilevamento del polimorfismo multinucleotidico proposto è stato condotto su una piattaforma di manipolazione pneumatica delle goccioline, il che significa che i campioni e i reagenti possono essere caricati e raccolti direttamente con la pipetta. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha un alto potenziale per lo screening del DNA e altre applicazioni chimiche e biomatiche.