Progettazione e l'uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

L'obiettivo generale di questo esperimento è caratterizzare il percorso evolutivo della resistenza agli antibiotici utilizzando un morbidostato che monitora continuamente la crescita batterica e regola dinamicamente la concentrazione dell'antibiotico man mano che i batteri acquisiscono resistenza al farmaco. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'apparato è costituito da componenti elettronici economici e facilmente reperibili, ed è facilmente riadattabile per scopi specifici. Le procedure saranno dimostrate da Po Cheng Liu e Yi Tai Lee, entrambi studenti laureati del mio laboratorio.

Per assemblare il Morbidostato, iniziare utilizzando un ago da 18 gauge per praticare tre fori nel tappo del vial di coltura. Tagliare tre pezzi di tubo in polietilene di circa sette centimetri di lunghezza e inserirli nei fori del tappo. Utilizzare del nastro adesivo per avvolgere il bordo del tappo, in modo da formare la stampo per la miscela di polidimetilsilossano, o PDMS.

Quindi aggiungere cinque grammi del componente A e 0,5 grammi del componente B della PDMS in un contenitore di plastica da 150 millilitri e utilizzare uno stuzzicadenti per mescolare manualmente. Caricare la miscela in una siringa da 10 millilitri. Poi, con la siringa, iniettare la miscela di PDMS sul coperchio.

Scaldare l'intero cappuccio a 70 gradi Celsius per otto ore per indurire il PDMS. Successivamente, utilizzando un saldatore, saldare l'anodo del LED con il filo da 24 gauge e il catodo del LED con la resistenza al carbonio. Quindi saldare una resistenza al carbonio da 680 Ohm con un filo da 24 gauge.

Utilizzare del nastro isolante per isolare il collegamento dei fili. Saldatare il collettore del foto rilevatore con un filo da 24 gauge e l'emettitore del foto rilevatore con una resistenza al carbonio da 100 Ohm. Successivamente, utilizzare del nastro isolante per isolare il collegamento dei fili.

Posizionare il diodo ad emissione luminosa nel supporto per provette di coltura. Seguendo lo schema del circuito mostrato qui, collegare il diodo ad emissione luminosa e utilizzare un alimentatore da cinque volt per alimentarlo. Verificare il funzionamento del LED utilizzando una fotocamera digitale in grado di rilevare l'infrarosso. Posizionare ora il rilevatore di luce nel supporto per provette di coltura.

Quindi, seguendo lo schema, collegare il fotodetettore e alimentarlo con un alimentatore da cinque volt. Collegare il cavo ai due capi dei resistori del fotodetettore per misurare la tensione attraverso la scheda di controllo elettronico. Incollare un magnete sull'albero del ventilatore di raffreddamento, che funge da unità di agitazione magnetica.

Poiché l'unità di agitazione magnetica è composta dal magnete e dalla ventola di raffreddamento, è fondamentale allineare lo scaffale della ventola al vial della coltura. Inoltre, la distanza tra il vial della coltura e il magnete è molto critica per garantire un funzionamento stabile. Collegare ciascun pezzo di tubo in polietilene del vial della coltura al corrispondente pezzo di tubo in silicone delle micro pompe, delle bottiglie di mezzo e della bottiglia dei rifiuti.

Accendere la pompa per un'ora e misurare il volume totale pompato dalla bottiglia del mezzo al vial di coltura per determinare la velocità della pompa. La velocità di pompaggio tipica dovrebbe essere di circa quattro millilitri all'ora, il che corrisponde a una velocità di diluizione di D uguale a 0,33 all'ora per un volume di lavoro di 12 millilitri del vial di coltura. Una volta completato il montaggio, posizionare l'intero apparato su un incubatore agitatore di dimensioni medie.

Per pre-testare il Morbidostato, impostare la tensione dell'alimentatore del ventilatore di raffreddamento a cinque volt per avviare il motore e testare la barretta magnetica di agitazione. Dopo aver preparato una serie di campioni di E-coli e tracciato una curva di calibrazione secondo il protocollo descritto nel testo, preparare la provetta di coltura con tre pezzi di tubo Tygon ultra resistente ai prodotti chimici lunghi sette centimetri e con un diametro interno di 1/132 di pollice e un diametro esterno di 3/32 di pollice per i collegamenti in ingresso per assemblare il dispositivo. Preparare il mezzo minimo M9 con glucosio allo 0,2% e il mezzo M9 contenente il farmaco Trimetoprim o TMP.

Quindi sterilizzare il mezzo di coltura, la bottiglia del mezzo, la bottiglia del mezzo con farmaco, la bottiglia dei rifiuti e la provetta di coltura in un'autoclave a 121 gradi Celsius. Nel primo giorno dell'esperimento, scongelare un millilitro di cellule di E-coli MG1655 selvagge congelate a temperatura ambiente per cinque minuti e trasferire 120 microlitri delle cellule in una provetta di coltura contenente circa 12 millilitri di mezzo di crescita M9. Accendere l'incubatore agitatore e impostare la temperatura a 30 gradi Celsius senza agitazione.

Avviare l'operazione del Morbidostato accendendo la micropompa, l'unità di agitazione magnetica e la misurazione della densità ottica. Dopo circa 23 ore, arrestare la micropompa spegnendo l'alimentazione elettrica e rimuovere il flacone di coltura. Aggiungere il 15% di glicerolo nel flacone di coltura e congelare i campioni a 80 gradi sotto zero per la conservazione.

È inoltre importante passare a un nuovo vial di coltura all'inizio di ciascuno di questi esperimenti per evitare la formazione di biotina. In caso contrario, la formazione di biotina può verificarsi entro due o tre giorni. Dopo aver scongelato il campione congelato giornalmente a temperatura ambiente per cinque minuti, inoculare un nuovo tubo di prova con mezzo M9 fresco.

Posizionare il campione in un incubatore agitato a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, diluire il campione microbico nel mezzo M9 di dieci volte e caricarlo nel dispositivo microfluidico applicando una pressione di cinque PSI al contenitore del campione microbico. Successivamente, caricare nel chip il mezzo contenente TMP applicando una pressione di cinque PSI al contenitore di M9 con TMP.

Eseguire il mescolamento tra il microrganismo e il farmaco attivando la valvola micro-meccanica tra le due camere del chip microfluidico per 15 minuti. Infine, posizionare il chip microfluidico nell'incubatore del microscopio montato sul microscopio invertito. Mediante una telecamera CCD, acquisire immagini delle cellule nella camera di crescita ogni ora per otto ore.

Calcolare i dati del numero di cellule seguendo il protocollo descritto nel testo. Le operazioni comuni del morbidostato, incluse l'evoluzione sperimentale, il test di suscettibilità agli antibiotici e il controllo della morfologia cellulare, sono state validate utilizzando una coltura di E-coli MG1655 esposta all'antibiotico TMP, che induce un caratteristico aumento graduale della resistenza al farmaco con mutazioni raggruppate intorno al gene della diidrofolato reduttasi, o DHFR. Ogni giorno, si prevede che il microrganismo cresca oltre la soglia prestabilita di densità ottica e attivi l'iniezione del farmaco come mostrato qui.

Ci si aspetta che l'iniezione del farmaco inibisca la crescita e, di conseguenza, riduca la densità ottica. Questo grafico mostra l'aumento temporale della resistenza al farmaco antibiotico in un esperimento volto a determinare la IC50. La resistenza al farmaco è aumentata di circa 1500 volte, raggiungendo 1.000 microgrammi per millilitro in circa 12 giorni.

In accordo con risultati precedenti. Le mutazioni puntiformi di DHFR nel ceppo mutante dell'ultimo giorno sono state misurate mediante sequenziamento Sanger ed elencate in questa tabella. L'acquisizione di resistenza ai farmaci con multipli mutazioni dimostra l'utilità del Morbidostat.

Poiché la selezione su piastre di agar contenenti il farmaco tende a conferire soltanto una singola mutazione, questa figura mostra le curve di crescita in chip a diverse concentrazioni di TMP. I campioni mutanti mostrano un significativo aumento della resistenza all'antibiotico.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per studiare la posizione della resistenza ai farmaci antibiotici in un ambiente di laboratorio a controllo reale. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre misurazioni, come la misurazione microfluidica di singole cellule, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio se la morfologia persiste o cambia a seguito dell'esposizione ai farmaci antibiotici. Una volta padroneggiato, questo dispositivo può essere facilmente riadattato per tutti gli esperimenti di coltura batterica, come la coltivazione di un ceppo batterico o l'aumento del livello di tolleranza agli antibiotici di un ceppo batterico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare l'acquisizione della resistenza ai farmaci antibiotici in un reale esperimento evolutivo adattativo di laboratorio con controllo. Non dimenticare di manipolare i batteri resistenti ai farmaci seguendo le norme di sicurezza biologica per la pratica microbiologica. Potrebbe essere richiesta un'autorizzazione speciale per un esperimento che coinvolge l'addestramento di base dei batteri.