Progettazione e l'uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare il percorso evolutivo della resistenza agli antibiotici utilizzando un Morbidostat che monitora continuamente la crescita batterica e regola dinamicamente la concentrazione di antibiotici man mano che i batteri acquisiscono resistenza ai farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'allestimento è costituito da componenti elettronici a basso costo e facilmente reperibili e può essere facilmente riconfigurato per mezzi specifici. A dimostrare le procedure saranno Po Cheng Liu e Yi Tai Lee, entrambi studenti laureati del mio laboratorio.

Per assemblare il Morbidostat, iniziare utilizzando un ago calibro 18 per praticare tre fori nel tappo della fiala di coltura. Tagliare tre pezzi di tubo di polietilene lunghi circa sette centimetri e inserirli nei fori del tappo. Usa del nastro adesivo per avvolgere il bordo del tappo in modo che funga da calco per la miscela di polidimetilsilossano, o PDMS.

Quindi aggiungere cinque grammi di componente A e 0,5 grammi di componente B del PDMS in un contenitore di plastica da 150 millilitri e utilizzare uno stuzzicadenti per mescolarlo manualmente. Caricare la miscela in una siringa da 10 millilitri. Quindi, con la siringa, iniettare la miscela PDMS sul tappo.

Cuocere l'intero tappo a 70 gradi Celsius per otto ore per polimerizzare il PDMS. Quindi, utilizzando un saldatore, saldare l'anodo LED con il filo calibro 24 e il catodo LED con la resistenza al carbonio. Quindi saldare un resistore al carbonio da 680 Ohm con un filo calibro 24.

Utilizzare del nastro isolante per isolare il collegamento del cavo. Saldare il collettore del fotorivelatore con il filo calibro 24 e l'emettitore del fotorivelatore con una resistenza al carbonio da 100 Ohm. Quindi utilizzare del nastro isolante per isolare il collegamento del cavo.

Posizionare il diodo a emissione di luce nel supporto della fiala di coltura. Seguendo lo schema elettrico mostrato qui, collegare il diodo a emissione di luce e utilizzare un alimentatore a cinque volt per alimentarlo. Assicurarsi che il LED funzioni utilizzando una fotocamera digitale in grado di rilevare l'IR. Ora posiziona il rilevatore di foto nel supporto della fiala di coltura.

Quindi, seguendo lo schema, collegare il fotorilevatore e utilizzare un alimentatore a cinque volt per alimentarlo. Collegare il filo a entrambi i lati delle resistenze del fotorilevatore per misurare la tensione attraverso la scheda di controllo elettronica. Incollare un magnete sull'albero della ventola di raffreddamento che funge da unità di agitazione magnetica.

Poiché l'unità di agitazione magnetica è formata dal magnete e dalla ventola di raffreddamento, è fondamentale allineare il ripiano della ventola alla fiala di coltura. Anche la distanza tra la fiala di coltura e il magnete è molto importante per garantire un funzionamento stabile. Collegare ogni pezzo di tubo di polietilene della fiala di coltura al pezzo corrispondente di tubo in silicone per le micropompe, le bottiglie medie e la bottiglia di scarto.

Accendere la pompa per un'ora e misurare il volume totale pompato dal flacone del terreno alla fiala di coltura per determinare la velocità della pompa. La velocità di pompaggio tipica dovrebbe essere di circa quattro millilitri all'ora, che corrisponde alla velocità di diluizione di D pari a 0,33 all'ora per un volume di lavoro di 12 millilitri della fiala di coltura. Al termine dell'installazione, posizionare l'intero gruppo su un'incubatrice a scuotimento di medie dimensioni.

Per pre-testare il Morbidostat, impostare l'alimentazione voltage della ventola di raffreddamento a cinque volt per avviare il suo motore per testare l'ancoretta magnetica. Dopo aver preparato una serie di campioni di E-coli e tracciato una curva di calibrazione secondo il protocollo di testo, preparare la fiala di coltura con tre tubi Tygon ultra resistenti agli agenti chimici con un diametro interno di 132 pollici e un diametro esterno di 332 pollici per gli ingressi per formare il dispositivo. Preparare il terreno minimo M9 con lo 0,2% di glucosio e M9 contenente il farmaco Trimetoprim o TMP.

Quindi sterilizzare il terreno, il flacone del terreno, il flacone del terreno del farmaco, il flacone di scarto e la fiala di coltura in autoclave a 121 gradi Celsius. Il primo giorno dell'esperimento, scongelare un millilitro di cellule congelate di E-coli selvatico MG1655 a temperatura ambiente per cinque minuti e trasferire 120 microlitri di cellule in una fiala di coltura contenente circa 12 millilitri di terreno di crescita M9. Accendere l'incubatrice con agitazione e impostare la temperatura a 30 gradi Celsius senza agitare.

Avviare il funzionamento di Morbidostat accendendo la micropompa, l'unità di agitazione magnetica e la misurazione della densità ottica. Dopo circa 23 ore, arrestare la micropompa spegnendo la tensione di alimentazione ed estrarre la fiala di coltura. Aggiungere il 15% di glicerolo nella fiala di coltura e congelare i campioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per la conservazione.

Anche il passaggio a una nuova fiala di coltura all'inizio di ciascuno di questi esperimenti è importante per evitare la formazione di biotina. In caso contrario, la formazione di biotina può avvenire entro due o tre giorni. Dopo aver scongelato il campione congelato giornalmente a temperatura ambiente per cinque minuti, inoculare una nuova provetta con terreno M9 fresco.

Posizionare il campione in un incubatore vibrante a 37 gradi Celsius per una notte. Il giorno seguente, utilizzare il terreno M9 per diluire il campione microbico di dieci volte e caricarlo nel dispositivo microfluidico pressando il contenitore del campione microbico a cinque PSI. Quindi caricare il fluido contenente TMP nel chip premendo l'M9 con il contenitore TMP a cinque PSI.

Eseguire la miscelazione tra il microbo e il farmaco azionando la valvola micromeccanica tra le due camere sul chip microfluidico per 15 minuti. Infine, posizionare il chip microfluidico nell'incubatore del microscopio montato sul microscopio invertito. Con una telecamera CCD, acquisisci immagini cellulari nella camera di crescita ogni ora per otto ore.

Calcola i dati del numero di cella in base al protocollo di testo. Le comuni operazioni di Morbidostat, tra cui l'evoluzione sperimentale, il test di suscettibilità agli antibiotici e il controllo della morfologia cellulare, sono state invalidate utilizzando una coltura di E-coli MG1655 esposta all'antibiotico TMP, che induce un aumento graduale della resistenza ai farmaci con mutazioni raggruppate attorno al gene della diidrofolato reduttasi, o DHFR. Ogni giorno, si prevede che il microbo cresca al di sopra della soglia di densità ottica preimpostata e inneschi l'iniezione del farmaco come mostrato qui.

Si prevede che l'iniezione del farmaco inibisca la crescita e, di conseguenza, diminuisca la densità ottica. Questo grafico mostra l'aumento temporale della resistenza ai farmaci antibiotici in un esperimento per determinare l'IC50. La resistenza ai farmaci è aumentata di circa 1500 volte a 1.000 microgrammi per millilitro in circa 12 giorni.

Coerente con i risultati precedenti. Le mutazioni puntiformi del DHFR nell'ultimo giorno di mutazione sono state misurate mediante sequenziamento Sanger e sono elencate in questa tabella. L'acquisizione di resistenza ai farmaci con mutazioni multiple dimostra l'utilità del Morbidostat.

Poiché la selezione su farmaci contenenti piastre di agar tende a conferire solo la singola mutazione. Questa figura mostra le curve di crescita su chip a varie concentrazioni di TMP. I campioni mutanti mostrano un aumento significativo della resistenza ai farmaci antibiotici.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per studiare la posizione della resistenza ai farmaci antibiotici in un vero e proprio ambiente di laboratorio di controllo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre misure come la misurazione microfluidica di singole cellule per rispondere a ulteriori domande come la morfologia ancora da cambiare a causa dell'esposizione a farmaci antibiotici. Una volta padroneggiato, questo dispositivo può essere facilmente riconfigurato per tutti gli esperimenti di coltura batterica come la coltivazione di un segno di batteri o l'aumento del livello di tolleranza al costo di un ceppo batterico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare l'acquisizione della resistenza ai farmaci antibiotici in un vero esperimento evolutivo di laboratorio adattivo al controllo. Non dimenticare di maneggiare i batteri resistenti ai farmaci secondo le regole di biosicurezza per la pratica microbiologica. Può essere richiesta un'autorizzazione speciale per un esperimento che coinvolge l'addestramento di base dei batteri.