Name: Progettazione e luso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Scopri come costruire un morbidostat a basso costo per studiare l'evoluzione adattiva dei batteri sotto selezione antibiotica. Questo dispositivo monitora la crescita batterica in tempo reale e regola dinamicamente le concentrazioni di farmaci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Sze-Bi Hsu e la Sig.ra Zhenzhen per le utili discussioni e l'aiuto nell'analisi teorica e nella simulazione numerica. Y. T. Y. desidera ringraziare il sostegno finanziario del Ministero della Scienza e della Tecnologia con i numeri di sovvenzione MOST 103-2220-E-007-026 e MOST 104-2220-E-007-011, e dall'Università Nazionale Tsing Hua con i numeri di sovvenzione 103N2042E1, 104N2042E1 e 105N518CE1.

1. Montaggio e Pretesting del dispositivo Morbidostat <ol><li> Assemblea della Morbidostat <ol><li> Punzone 3 fori sul tappo del flacone di coltura con una siringa 18 G. Tagliare tre pezzi di tubo di polietilene ~ 7 cm di lunghezza. Inserire questi tre pezzi di tubo di polietilene sul tappo. </li><li> Utilizzare nastro per avvolgere il bordo della calotta per servire come il cast per la miscela polidimetilsilossano (PDMS). Miscelare 5 g di un componente e 0,5 g di componente B dei PDMS in un contenitore di plastica 150 ml agitando manualmente con uno stuzzicadenti. Caricare il composto in una siringa da 10 ml. <ol><li> Versare il composto PDMS sul tappo con la siringa. Cuocere tutto il tappo per curare il PDMS per 8 ore in forno a 70 ° C. </li></ol></li><li> Saldare l&#39;anodo LED con il filo calibro 24 e catodo LED con il resistore carbonio con un saldatore. Saldare una resistenza di 680 Ω carbonio con un filo di 24 g. Isolare il collegamento del filo con nastro isolante. </li><li> Cosìlder collettore del fotorivelatore con il filo 24 G e l&#39;emettitore del fotorivelatore con una resistenza di carbonio 100 k. Isolare il collegamento del filo con nastro isolante. </li><li> Posizionare il diodo emettitore di luce nel supporto coltura flacone. Seguendo lo schema del circuito di Figura integrativa 2, collegare il diodo emettitore di luce e potenza con una alimentazione di 5 V. Assicurarsi che il LED funziona utilizzando una fotocamera digitale in grado di rilevare IR (ad esempio, una fotocamera del cellulare). </li><li> Posizionare il fotorivelatore nel supporto coltura flacone. Seguendo lo schema circuitale di figura integrativa 2, collegare il fotorivelatore e potenza con una alimentazione di 5 V. Collegare il filo su entrambi i lati dei resistori fotorivelatori per misurare la tensione attraverso la scheda elettronica di controllo. </li><li> Colla un magnete sull&#39;albero della ventola di raffreddamento, che serve come unità di agitatore magnetico. Si noti che il alignment dell&#39;albero del ventilatore alla fiala coltura, e la distanza tra il flaconcino coltura e il magnete è molto critico per il corretto funzionamento dell&#39;unità agitazione magnetica. </li><li> Collegare ogni pezzo di tubo in polietilene del flaconcino cultura nel corrispondente pezzo di tubo in silicone per le micro-pompe, bottiglie medie, e di scarto. Accendere la pompa per 1 ora e misurare il volume totale pompato dalla bottiglia mezzo al flaconcino coltura per determinare la velocità della pompa. Notare che la velocità di pompaggio tipica dovrebbe essere ~ 4 ml / hr, che corrisponde al grado di diluizione D = 0.33 h -1 per 12 ml di volume del flacone coltura lavorativi. </li><li> Mettere il tutto in una di medie dimensioni (34 cm x 34 cm x 43,5 centimetri) agitatore incubatore. </li></ol></li><li> Pretesting il Morbidostat <ol><li> Imposta la tensione di alimentazione del ventilatore freddo a 5 V per iniziare il suo motore di testare la barra di agitazione magnetica. Si noti che l&#39;azione di agitazione può essere ispezionato visivamente. La tensione che guidanos il motore della ventola di raffreddamento è controllato con precisione da modulazione di larghezza di impulso (PWM). </li><li> Preparare una serie di wild type E. campioni coli con densità ottica a 600 nm in genere vanno 0,07-0,3 per la calibrazione. Posizionare un test E. campione coli nella fiala cultura e registrare la tensione cellula fotoelettrica. <ol><li> Inserire ~ 100 microlitri dello stesso campione nel lettore di piastre e registrare la densità ottica. Utilizzare la tensione fotorilevatore contro i dati della densità ottica per tracciare la curva di calibrazione. Si noti che in genere, una variazione unitaria di densità ottica corrisponde a ~ 7,6 V cambiamento nella cellula fotoelettrica con lo schema di polarizzazione usato qui. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. L&#39;esecuzione del Morbidostat <ol><li> Preparazione Prima di iniziare l&#39;esperimento giornaliera <ol><li> Preparare la fiala cultura con tre resistenti tubi ultra-chimici TYGON con diametro interno 1/32 pollici e diametro esterno 3/32 di pollice per ingressi per formare il dispositivo come nella sezione1.1 e nella Figura 1 supplementare. </li><li> Preparare il supporto M9 minima (0,2% di glucosio) e trimetoprim (TMP) farmaco contenente mezzo. Sterilizzare il mezzo, la bottiglia mezzo, la bottiglia mezzo droga, la bottiglia degli scarti e la fiala coltura in autoclave a 121 ° C. NOTA: Il TMP è una soluzione madre che viene utilizzato per realizzare successivamente le concentrazioni in tabella 1 e il farmaco contenente TMP mezzo non è autoclave. </li></ol></li><li> Esecuzione del Morbidostat <ol><li> Il primo giorno dell&#39;esperimento, scongelare 1 ml di tipo selvaggio congelato E. cellule coli MG1655 per 5 min a temperatura ambiente e trasferimento 120 ml di cellule al flacone di coltura contenente ~ 12 ml di mezzo di crescita M9. Dopo il primo giorno, scongelare 1 ml di E. congelati coli cellule dal giorno precedente per 5 minuti e il trasferimento 120 ml di cellule ad una nuova fiala di coltura contenente ~ 12 ml di mezzo di crescita M9. </li><li> Accendere l&#39;incubatore shaker e impostare la tempe<html> ratura di 30 ° C senza agitazione. </li><li> Avviare l&#39;operazione morbidostat accendendo la micro-pompa, l&#39;unità di agitazione magnetica, e la misurazione della densità ottica. NOTA: Durante il funzionamento, un algoritmo di soglia di feedback è utilizzato per controllare l&#39;iniezione di droga. Quando la densità ottica misurata supera una soglia prefissata, la pompa di iniezione farmaco potrebbe essere attivata e la pompa mezzo verrebbe disattivata. Altrimenti, la pompa di iniezione di droga rimane spento e la pompa del mezzo è acceso. </li><li> Monitorare la tensione di volta in volta a garantire il crescita microbica. Nota: A causa del gelo e disgelo, E. coli cellule mostrano un ritardo di ~ 4 ore durante la crescita di ogni giorno. </li><li> Dopo ~ 23 ore, fermare la micro-pompa disattivando la sua tensione di alimentazione ed estrarre la fiala cultura. Aggiungere 15% glicerolo nel flaconcino coltura e congelare il campione a -80 ° C per la conservazione. </li><li> Ripetere i passaggi da 2.2.1 a 2.2.5. </li></ol></li></ol>Le &quot;&gt; 3. antibiotico suscettibilità Misura in 96 Well Format NOTA: Eseguire la misurazione tasso di crescita in un lettore di piastre con un formato ben 96 per determinare il livello di resistenza agli antibiotici. <ol><li> Scongelare il campione congelato giornaliera a temperatura ambiente per 5 minuti e trasferire 15 microlitri della cella alla fiala di coltura contenente ~ 15 ml M9 medie. Consentire loro di crescere fino a quando la densità ottica a 600 nm raggiunge ~ 0.1. Dividere i 15 ml in 1 ml flaconi e aggiungere il farmaco TMP in questa fase per ottenere le concentrazioni di farmaco desiderati come mostrato nella Tabella 1. </li><li> Prendete 200 ml di campione dal punto 3.1 e il luogo in ciascun bene nel lettore di piastre e permettere loro di crescere per 12 ore 5. La densità ottica alla lunghezza d&#39;onda di 600 nm viene registrato automaticamente durante la misurazione. NOTA: Per ogni punto di dati, le misurazioni triplice copia sono registrati e una media per garantire la coerenza dei dati. I dati sulla densità ottica in funzione del tempo può be utilizzato per ottenere il tasso di crescita. </li><li> Tracciare i dati tasso di crescita rispetto al concentrazione di farmaco per ottenere IC50. Notare che IC 50 è definita come la concentrazione di farmaco in cui la velocità di crescita è il cinquanta per cento del tasso di crescita massimo 5. </li></ol> 4. Single Cell Morfologia ed un antibiotico suscettibilità di misura in dispositivi microfluidici <ol><li> Eseguire la fabbricazione dei dispositivi microfluidici tramite litografia soft multistrato da PDMS come descritto altrove 15. <ol><li> Utilizzare fotolitografia per fare lo stampo photoresist per gli strati di controllo e di flusso. Si noti che per il livello di controllo, utilizzare fotoresist negativo (~ 15 micron altezza) e photoresist positivo (~ 8 micron altezza) per produrre uno stampo su un wafer di silicio nudo. </li><li> Preparare miscele PDMS con rapporti reticolazione 5: 1 e 20: 1 per il livello di controllo e lo strato flusso rispettivamente. Mettere le miscele in un essiccatore sotto vuoto per eliminare eventuali bolle, Per 1 ora. </li><li> Esporre i controllo stampi strato di resina fotosensibile su wafer di silicio per trimetilclorosilano (TMCS) vapore. Rendere il livello di controllo dello spessore ~ ​​6 mm con colata la miscela PDMS (con rapporto di reticolazione 5: 1) sul wafer di silicio sullo stampo di controllo strato di resina fotosensibile. Cuocere il livello di controllo per 40 min a 80 ° C per 1 ora in forno. </li><li> Rendere lo strato flusso mediante centrifuga rivestendo una miscela PDMS (con rapporto di reticolazione 20: 1, velocità di centrifuga 3000 rpm per 60 sec) su uno stampo photoresist strato di flusso. Cuocere il livello di flusso per 30 min a 80 ° C per 1 ora in forno. </li><li> Utilizzare una lama di rasoio per tagliare il livello di controllo nella dimensione del chip desiderato (in genere tre centimetri x 2 cm) e staccare manualmente il livello di controllo. Posizionare il livello di controllo sulla parte superiore dello strato flusso e allinearli allo stereomicroscopio. Curare il gruppo allineato a 80 ° C nella notte forno. Successivamente, immergere l&#39;assemblaggio in 250 ml di acqua deionizzata in un contenitore di plastica per 5 ore per sciogliere il residuo TMCS. </li><li> Successivamente, perforare i fori di ingresso con 20 aghi G e legare l&#39;intera elastomero su un vetrino rivestito con uno strato PDMS vuoto (PDMS reticolazione rapporto 5: 1, velocità di centrifuga di 2000 rpm per 30 sec) mediante trattamento plasma ad aria per 40 sec a 1.2 pressione dell&#39;aria Torr. </li><li> Effettuare vasta cottura per 36 ore a 80 ° C per ridurre gli effetti citotossici di PDMS. Si noti che questa fase di cottura è fondamentale per minimizzare la tossicità per le cellule batteriche. </li></ol></li><li> On Chip crescita Experiment <ol><li> Prima di caricare nel dispositivo microfluidica, lavare con acqua deionizzata per 1 ora e mezzo di M9 per 1 ora. </li><li> Scongelare il campione congelato giornaliera a temperatura ambiente per 5 minuti e inoculare una nuova provetta con terreno M9 fresco. Trasferire il campione in un incubatore shaker a 37 ° C durante la notte. </li><li> Diluire il microbica campione di 10 volte con media M9 e caricarlo nel dispositivo microfluidica facendo pressioni il contenitore del campione microbica a 5 psi. Quindi caricare il farmaco TMPmedio nel chip facendo pressioni contenitore mezzo farmaco a 5 psi. Eseguire la miscelazione tra microbi e droga azionando la valvola micromeccanico tra le due camere sul chip microfluidico per 15 min. </li><li> Posizionare il chip microfluidico nell&#39;incubatore microscopio montato sul microscopio invertito. Acquisire l&#39;immagine cellule nella camera di crescita ogni ora per 8 ore con la camera CCD montata sul microscopio invertito. </li><li> Utilizzare lo script programma personalizzato per calcolare i numeri di cellulare attraverso un algoritmo di soglia sui dati di immagine cellule 18. Si noti che i dati numerici delle cellule sono in media in genere oltre tre camere microfluidica. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Levy, S. B., Marshall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+worldwide%3A+causes%2C+challenges%2C+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses.</a> Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).</li>
<li>Wang, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+in+vivo+evolution+of+multidrug+resistance+in+Staphylococus+aureus+by+whole+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Pro.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing.</a> Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451(2007).</li>
<li>Dragosits, M., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+laboratory+evolution+-+principles+and+applications+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factory%22%5BJournal%5D)">Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology.</a> Microbial Cell Factory. 12, 64(2013).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment.</a> Science. 333, 1764-1767 (2011).</li>
<li>Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+paths+to+antibiotic+resistance+under+dynamically+sustained+drug+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection.</a> Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).</li>
<li>Toprak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+morbidostast%3A+an+automated+continuous+culture+device+for+studying+bacterial+drug+resistance+under+dynamically+sustained+drug+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition.</a> Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).</li>
<li>Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+evolution+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time.</a> Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).</li>
<li>Young, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibacterial+resistance+selection+and+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro antibacterial resistance selection and quantitation.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2006).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li>
<li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li>
<li>Groisman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li>
<li>Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Use+of+Multiplexed+Chemostat+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays.</a> J. Vis. Exp. (72), e50262(2013).</li>
<li>Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost%2C+customizable+turbidostat+for+use+in+synthetic+circuit+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization.</a> ACS Synthetic Biology. , (2015).</li>
<li>Mohan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+microfluidic+platform+for+rapid+antibiotic+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectrons%22%5BJournal%5D)">A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing.</a> Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKellogg%2C+RA+%22Nat.+Protocols%22">Nat. Protocols</a>. 9, 1713(2014).</li>
<li>Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanoliter+microfluidic+serial+dilution+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor.</a> Biomicrofluidics. 9, 044126(2015).</li>
<li>Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+RC+%22Digital+image+using+Matlab+processing%22">Digital image using Matlab processing</a>. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).</li>
<li>Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimethoprim+resistance+in+Escherichia+coli+isolates+from+a+geriatric+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).</li>
<li>Flensburg, J., Skold, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+overproduction+of+dihydrofolate+reductase+in+bacteria+as+a+response+to+the+use+of+trimethoprim%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim.</a> Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).</li>
<li>Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+five-tryptophan+mutations+on+structure%2C+stability+and+function+of+Escherichia+coli+dihydrofolate+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase.</a> J. Biochem. 130, 439-447 (2001).</li>
<li>Smith, D. R., Calvo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+dihydrofolate+reductase+genes+from+trimethoprim-resistant+mutants+of+Escherichia+coli.+Evidence+that+dihydrofolate+reductase+interacts+with+another+essential+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product.</a> Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).</li>
<li>Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluidic+and+microfluidic+tools+for+quantitative+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology.</a> Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+antimicrobial+susceptibility+test+based+on+single-cell+morphological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis.</a> Sci. Transl. Med. 17, 267(2014).</li>
<li>Hsu, S. B., Waltman, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+model+of+two+competitors+in+a+chemostat+with+an+external+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22SIAM+J.+Applied+Math%22%5BJournal%5D)">Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor.</a> SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).</li>
<li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+biomass+productivity+and+cell+density+of+Chlorella+vulgaris+by+using+light-emitting+diode-based+photobioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor.</a> J. Biotech. 161, 242-249 (2012).</li>
<li>Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+developing+tolerance+to+toxic+chemicals+in+microbial+systems+and+perspectives+on+moving+the+field+forward+and+into+the+industrial+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Chem+Eng%22%5BJournal%5D)">Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting.</a> Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un dispositivo morbidostat a basso impatto da componenti a basso costo è dimostrata. Gli aumenti di livello resistenza ai farmaci registrati dal dispositivo sono coerenti con quelli di precedenti rapporti di 5. Progettato per gli studi evolutivi di resistenza ai farmaci, il dispositivo è potenzialmente applicabile a molti altri esperimenti. In primo luogo, un database completo di mutazioni indotte da farmaci può essere stabilita per un ampio insieme di antibiotici clinicamente rilevanti. Ad esempio, il percor...

Dal momento che l&#39;introduzione del primo penicillina antibiotico, microbica resistenza agli antibiotici è trasformata in un problema di salute globale 1. Sebbene l&#39;acquisizione di resistenza agli antibiotici può essere studiato retrospettivamente in vivo, le condizioni di questi esperimenti sono spesso non controllati durante l&#39;intera evoluzione 2. In alternativa, adaptive evoluzione di laboratorio può rivelare l&#39;evoluzione molecolare di una specie microbiche sotto stress ambientali o pressione selettiva da un farmaco antibiotico 3. Recentemente, molti esperimenti evolutivi ben controllati di resistenza ai farmaci antibiotici hanno chiarito la comparsa di resistenza ai farmaci antibiotici. Ad esempio, il gruppo di Austin ha dimostrato rapido emergere in un microfluidica correttamente progettato ambiente compartimenti 4. Il morbidostat recentemente sviluppato induce mutazioni sistematiche sotto farmaco pressione selettiva 5,6. Il morbidostat, un Selec microbicaDispositivo zione che regola continuamente la concentrazione di antibiotico per mantenere una popolazione quasi costante, è un importante progresso dal test di fluttuazione utilizzato in microbiologia 7,8. Nel test di fluttuazione, un antibiotico viene iniettato ad alta concentrazione, ei mutanti sopravvissuti sono schermate e contati. Invece, i microbi in un morbidostat sono costantemente in discussione e acquisiscono mutazioni multiple. Il morbidostat funziona in modo simile al chemostat, un dispositivo di cultura inventato da Novick e Szliard nel 1950 che mantiene una popolazione costante fornendo continuamente nutrienti mentre diluendo la popolazione microbica 9. Fin dalla sua introduzione, il chemostat è stata avanzata e migliorata. Attuali chemostati microfluidica hanno raggiunto capacità nanolitri e unicellulari. Tuttavia, questi dispositivi non sono adatti per esperimenti evoluzione adattativa, che richiedono una grande popolazione di cellule con molti eventi mutazione 10,11. Recentemente, mini-chemostati con volumi di lavoro del ~ 10 ml sono stati sviluppati per colmare il divario tra bioreattori scala litri e la microfluidica chemostat 12,13. Qui vi presentiamo la progettazione e l&#39;utilizzo di un basso costo, morbidostat automatizzato per uno studio della resistenza ai farmaci antibiotici. Il modulo proposto può essere impiegato in un incubatore shaker in un laboratorio di microbiologia con requisiti hardware minimi. Il firmware open-source è anche facilmente su misura per applicazioni specifiche di evoluzione adattativa, come l&#39;ingegneria metabolica 3. Infine, il morbidostat è integrato in una piattaforma microfluidica multiplato per i test di suscettibilità antibiotica 14.

<table><tbody><tr><td>Incubatore Agitatore Ambientale</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Scheda Arduino Leonardo</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Resistenza al Carbonio</td><td>Digikey</td><td></td><td>Resistenza Bias per LED</td></tr><tr><td>100k Ohm Resistenza al carbonio</td><td>Digikey</td><td></td><td>Resistenza Bias per fototransistor</td></tr><tr><td>940 nm diodo a emissione luminosa</td><td>Bright LED Elettronica</td><td>BIR-BM13E4G-2</td><td>Fototransistor per la misurazione della densità ottica</td></tr><tr><td>940 nm</td><td>Kodenshi&nbsp;</td><td>ST-2L2B</td><td>Misura della densità ottica</td></tr><tr><td>Darlington coppia IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>questo IC aziona micropompe e unità di agitazione magnetica</td></tr><tr><td>Ventilatore brushless 5 V DC</td><td>Specifiche ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>: tensione di alimentazione 5 V e 80&nbsp; mamma; disponibile www.jameco.com</td></tr><tr><td>Micropompa piezoelettrica</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Pressione > 3&nbsp; kPa; Portata >5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32" OD: 3/32" L:50'&nbsp;</td></tr><tr><td>Ancorone magnetica</td><td>COWIE</td><td></td><td>forma conica dim: 10&nbsp; mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Scintillazione in vetro Fiala da 20 ml</td><td>DGS</td><td></td><td>Vetro Pyrex 28 mm (diametro) x 61 mm (altezza)</td></tr><tr><td>Porta</td><td></td><td></td> fiala per coltura <td>Realizzato su misura in Poliformaldeide&nbsp;</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td><td>utilizzato per sigillare la fiala di vetro</td></tr><tr><td>Bottiglia media</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 sale minimo 5x</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido cadamino</td> medio <td>BD</td><td></td><td>Glucosio medio</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Oxoid</td><td></td><td></td> baterologico <td>per piastra</td></tr> <tr><td>di agarLuria Bertani medio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI-LED</td><td>utilizzato per la misurazione microfluidica Utilizzare l'obiettivo 40X NA = 0,55</td></tr><tr><td>Microscopio Incubatore</td><td>Cella viva Strumento</td><td>CU-109</td><td>utilizzato per la misurazione microfluidica</td></tr><tr><td>Valvole solenoidali</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normalmente aperto 1,3 Watt 12 Vdc</td></tr><tr><td>Scheda di interfaccia USB</td><td>Modulo</td><td>I/O digitale Hobby Engineering USBIO24-R&nbsp;</td><td>per misura microfluidica</td></tr><tr><td>Compressore d'aria</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Sorgente di pressione per microfluidcs; Pressione massima 80 psi</td></tr><tr><td>Raccordi luer-lock maschio a 1/8"</td><td>ValuePlastics.com</td><td>MTLL230-1</td><td>utilizzati per il controllo microfluidico</td></tr> da <tr><td>1/8" a attacco filettato 10-32</td><td>ValuePlastics.com</td><td>B-1</td><td>utilizzati per il controllo microfluidico</td></tr><tr><td>Raccordi luer-lock femmina a attacco</td> <td>filettato 10-32ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>utilizzato per il controllo microfluidico</td></tr><tr><td>NPN darlington transistor 500 mA, 40&nbsp; V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>utilizzato per il controllo microfluidico</td></tr><tr><td>10 kOhm, resistore a film di carbonio, 0,25 W</td><td></td><td>DigiKey.com P10KBACT-ND</td><td>utilizzato per il controllo microfluidico</td></tr><tr><td>Condensatore al tantalio, 10&nbsp; &mu; F, 25 V, 10%</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>utilizzato per il controllo microfluidico</td></tr><tr><td>Telecamera CCD Andor</td><td></td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td><td>utilizzato per l'imaging microfluidico su chip</td></tr><tr><td>Lettore</td><td></td><td></td><td></td>di piastre ELISA</tr> a <tr><td>due componenti in silicone&nbsp;</td><td>Momentive</td><td>RTV 615</td><td>utilizzato per la fabbricazione di chip microfluidici</td></tr><tr><td>Fotoresist SU-8</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>utilizzato per la fabbricazione di chip microfluidici</td></tr><tr><td>Fotoresist AZ4620</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>utilizzato per la fabbricazione di chip microfluidici</td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>utilizzato per la fabbricazione di chip microfluidici</td></tr><tr><td>Ago per siringa calibro 20</td><td>BD</td><td></td><td>utilizzato per la fabbricazione di chip microfluidici</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>DNA polimerasi</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>Amplificazione PCR</td></tr><tr><td>Trimetoprim</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 ibrido</td><td>Misurazione della resistenza agli antibiotici</td></tr></tbody></table>

progettazione e l&#39;uso di un basso costo, automated morbidostat per adaptive evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Descriviamo un basso costo, morbidostat configurabile per caratterizzare il percorso evolutivo della resistenza agli antibiotici. Il morbidostat è un dispositivo di coltura batterica che controlla continuamente la crescita batterica e regola dinamicamente la concentrazione di farmaco di sfidare costantemente i batteri si evolvono per acquisire resistenza ai farmaci. Il dispositivo è dotato di un volume di lavoro di ~ 10 ml ed è completamente automatizzato e dotato di misura della densità ottica e micro-pompe per medio e la somministrazione di farmaci. Per convalidare la piattaforma, abbiamo misurato l&#39;acquisizione graduale della resistenza trimetoprim in Escherichia coli MG 1655, e integrato il dispositivo con una piattaforma microfluidica multiplex per indagare la morfologia cellulare e sensibilità agli antibiotici. L&#39;approccio può essere up-scalata a studi di laboratorio di resistenza ai farmaci antibiotici, ed è estendibile a adattivo evoluzione per i miglioramenti di deformazione in ingegneria metabolica e altri esperimenti di coltura batterica.

Il morbidostat sopra descritto è schematizzato in Figura 1. Le operazioni morbidostat comuni, tra evoluzione sperimentale, test di sensibilità agli antibiotici e controllo della morfologia cellulare, sono stati convalidati in E. cultura coli MG1655 esposti a trimetoprim (TMP), un antibiotico comunemente usato 5,6. TMP induce molto particolari graduali aumenti di resistenza ai farmaci, e le mutazioni sono raggruppati intorno al gene diidrofola...

Descriviamo un morbidostat configurabile a basso costo che consente la caratterizzazione della resistenza ai farmaci antibiotici regolando dinamicamente la concentrazione del farmaco. Il dispositivo può essere integrato con una piattaforma microfluidica multiplexata. L'approccio può essere ampliato per studi di laboratorio sulla resistenza ai farmaci antibiotici.

Progettazione e l&#39;uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è caratterizzare il percorso evolutivo della resistenza agli antibiotici utilizzando un morbidostato che monitora continuamente la crescita batterica e regola dinamicamente la concentrazione dell'antibiotico man mano che i batteri acquisiscono resistenza al farmaco. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'apparato è costituito da componenti elettronici economici e facilmente reperibili, ed è facilmente riadattabile per scopi specifici. Le procedure saranno dimostrate da Po Cheng Liu e Yi Tai Lee, entrambi studenti laureati del mio laboratorio.Per assemblare il Morbidostato, iniziare utilizzando un ago da 18 gauge per praticare tre fori nel tappo del vial di coltura. Tagliare tre pezzi di tubo in polietilene di circa sette centimetri di lunghezza e inserirli nei fori del tappo. Utilizzare del nastro adesivo per avvolgere il bordo del tappo, in modo da formare la stampo per la miscela di polidimetilsilossano, o PDMS.Quindi aggiungere cinque grammi del componente A e 0,5 grammi del componente B della PDMS in un contenitore di plastica da 150 millilitri e utilizzare uno stuzzicadenti per mescolare manualmente. Caricare la miscela in

design-use-low-cost-automated-morbidostat-for-adaptive-evolution

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Qui mostriamo un semplice protocollo per creare una libreria casuale mutante per una sequenza bersaglio determinato. Mostriamo come questo metodo, che viene eseguita in vivo in Escherichia coli, possono essere accoppiati con selezioni funzionali ad evolvere nuove attività enzimatiche.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

Fonte: Liu, P. C., et al. Progettazione e utilizzo di un morbidostat automatizzato a basso costo per l'evoluzione adattativa dei batteri nella selezione di farmaci antibiotici. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'uso di un chip microfluidico per visualizzare e confrontare la crescita e la morfologia di ceppi di E. coli wild-type e resistenti al trimetoprim sotto stress antibiotico trimetoprim.

Crescita batterica su un chip microfluidico per studiare la resistenza ai farmaci antibiotici

Fonte: Jian, X., et al., Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura di microgoccioline microbiche (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Questo video mostra l'uso di un sistema di coltura di microgoccioline microbiche per guidare l'evoluzione adattativa dei batteri verso la tolleranza al metanolo. Mescolando colture batteriche ingegnerizzate con un mezzo di stress ad alto contenuto di metanolo e segmentandole in microgoccioline, il sistema seleziona i...

Evoluzione adattiva dei batteri utilizzando un sistema di coltura microbica a microgocce

Il tasso di crescita delle cellule è un processo regolato e un determinante fondamentale della fisiologia cellulare. Coltura continua utilizzando chemostati consente il controllo estrinseco di crescita cellulare mediante limitazione nutritiva facilitare lo studio delle reti molecolari che controllano la crescita cellulare e come tali reti evolvono per ottimizzare la crescita cellulare.

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Abbiamo sviluppato e validato un piccolo ingombro serie di chemostati in miniatura costruito da prontamente parti disponibili per basso costo. Risultati evoluzione fisiologiche e sperimentali sono stati simili a chemostati volumi più grandi. La matrice Ministat fornisce una piattaforma compatta, poco costoso, e accessibile per gli esperimenti chemostato tradizionali, genomica funzionale, e le applicazioni di screening chimici.

Progettazione e utilizzo di matrici chemostato multiplexing

I batteri possono accumulare mutazioni dannose o benefiche durante la loro vita. In una popolazione di cellule individui che hanno accumulato mutazioni benefiche possono rapidamente sovracompetire i loro simili. Qui presentiamo una procedura semplice per visualizzare la competizione intraspecie in una popolazione di cellule batteriche nel tempo utilizzando individui etichettati fluorescentmente.

Monitoraggio della concorrenza intraspecie in una popolazione di cellule batteriche mediante cocultivazione di ceppi marcati fluorescentmente

Qui, vi presentiamo un protocollo per ottenere adattativa evoluzione laboratorio di microrganismi in condizioni che utilizzano la cultura chemostat. Inoltre, l'analisi genomica del ceppo evoluto è discusso.

Procedura per l&#39;Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

Qui presentiamo un metodo sperimentale per testare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico.

Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico

Il Framework eVOLVER consente una coltura microbica continua ad alta produttività con alta risoluzione e controllo dinamico sui parametri sperimentali. Questo protocollo illustra come applicare il sistema per condurre un esperimento di fitness complesso, guidando gli utenti a programmare il controllo automatizzato su molte culture individuali, misurando, raccogliendo e interagendo con i dati sperimentali in tempo reale.

Progettare esperimenti di crescita cellulare automatizzati, ad alta produttività e continui utilizzando eVOLVER

La quantificazione rapida ed efficiente della crescita intracellulare di M. tuberculosis è fondamentale per perseguire terapie migliori contro la tubercolosi (TB). Questo protocollo descrive un test di rilevamento colorimetrico basato sul brodo utilizzando un sistema di coltura liquida automatizzato per quantificare la crescita di Mtb nei macrofagi trattati con terapie candidate dirette dall'ospite.

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

Questo protocollo fornisce un metodo per l'ottimizzazione globale sistematica di biosensori geneticamente codificati attraverso la generazione e la valutazione di librerie genetiche assistite dall'automazione. A ciò si aggiungono metodologie di progettazione dell'esperimento per semplificare la sperimentazione e consentire la selezione di componenti genetici per regolare i biosensori in base a risultati di progettazione specifici.

Campionamento efficiente dello spazio di progettazione di biosensori geneticamente codificati grazie alla progettazione di esperimenti e al flusso di lavoro di automazione

Scopri come costruire un morbidostat a basso costo per studiare l'evoluzione adattiva dei batteri sotto selezione antibiotica. Questo dispositivo monitora la crescita batterica in tempo reale e regola dinamicamente le concentrazioni di farmaci.

Progettazione e luso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci (Video) | JoVE Journal

Progettazione e l'uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

Esplora altri video