Un approccio semplice per manipolare ossigeno disciolto per Osservazioni Comportamento animale
28 giugno 2016
Questo articolo descrive un protocollo semplice e riproducibile per manipolare le condizioni di ossigeno disciolto in un ambiente di laboratorio per gli studi di comportamento animale. Questo protocollo può essere utilizzato in entrambe le impostazioni di insegnamento e laboratorio di ricerca per valutare la risposta organismal di macroinvertebrati, pesci, anfibi o alle variazioni di concentrazione di ossigeno disciolto.
L'obiettivo generale di questo metodo è manipolare in modo efficace e graduale le condizioni di ossigeno disciolto (DO) in un ambiente di laboratorio, al fine di osservare le risposte comportamentali di animali acquatici. L'aspetto interessante di questo metodo è che può trovare applicazione in numerosi esperimenti sul comportamento animale.
Sia per vertebrati che per invertebrati. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzata sia per l'insegnamento in aula che per scopi di ricerca. In un sito campione selezionato, entro un'ora di trasferimento dal laboratorio, utilizzare le procedure standard con rete da calciatura per raccogliere almeno 35 mosche della pietra.
Dal corso d'acqua, raccogliere quattro litri di acqua per acquario. Più tre litri aggiuntivi per ogni esperimento. Nonché diverse rocce con un diametro massimo di due centimetri.
Di ritorno in laboratorio, distribuire le rocce in acquari posizionati in un frigorifero, impostando la temperatura registrata nel sito del corso d'acqua. Aggiungere quindi quattro litri di acqua del corso d'acqua a ciascun acquario. Successivamente, aggiungere da 20 a 30 plecoperi a ciascun acquario.
E posizionare un sasso aerante collegato a un aeratore per acquario in ciascun serbatoio per aggiungere continuamente aria ambiente all'acqua. Dopo due giorni, collegare un tubo da vuoto standard a una presa a muro al braccio laterale di un pallone da due litri con braccio laterale. E riempire il pallone con 1,9 litri di acqua di ruscello a 12 gradi Celsius.
Posizionare il pallone e il tubo su un vassoio abbastanza grande da contenere un bagno di ghiaccio senza ostacolare la vista dell'interno del pallone laterale. Riempire quindi il vassoio con ghiaccio. Inserire una sonda di ossigeno disciolto in uno dei fori di tre millimetri di un tappo di gomma appositamente preparato.
E un tubo di rame del diametro di due millimetri dotato di un raccordo maschio per tubo flessibile da tre millimetri, inserito attraverso un altro foro da tre millimetri, in modo che la lunghezza del tubo a partire dal fondo del tappo sia entro 10 centimetri dal fondo del pallone. Collegare al raccordo un tubo per gas in polietilene sottile lungo zero virgola sette metri e del diametro di tre millimetri.
Verificare che esista un sigillo sicuro tra il tappo e il pallone, nonché un adattamento stretto tra il tubo e il filo della sonda all'interno del tappo. È fondamentale che i tappi e i tubi siano sigillati ermeticamente per mantenere un ambiente a pressione costante all'interno del recipiente durante tutto l'esperimento e per evitare perdite di azoto dal recipiente. Inserire il tubo di polietilene in un pallone da un litro contenente zero virgola quattro litri di acqua di rubinetto e fissare il tubo con del nastro in modo da mantenere le estremità immerse per tutta la durata dell'esperimento.
Quindi, collegare il tubo del gas da tre millimetri di diametro dalla fiala a vuoto a un diffusore d'aria per acquario. Accendere il diffusore per ossigenare l'acqua nella fiala da due litri con l'ossigeno ambiente. Utilizzare la sonda di OD per monitorare la temperatura dell'acqua e la concentrazione di OD per circa cinque minuti.
Finché non si stabilisce un equilibrio di ossigeno disciolto (DO) all'interno della camera. Prima di aggiungere le perlace, inserire tre o quattro pietre nel matraccio da due litri in modo che gli insetti abbiano un substrato adatto per eseguire flessioni. Quindi iniziare una manipolazione sperimentale del DO staccando il tubo del gas dal diffusore e collegandolo alla linea dell'azoto gassoso.
Iniziare a far gorgogliare l'azoto a 20 piedi cubi all'ora per circa 40-60 secondi. Arrestare immediatamente il flusso di azoto non appena si raggiunge la concentrazione desiderata. Utilizzare l'aeratore dell'acquario per tornare alla concentrazione desiderata se il valore di DOD scende al di sotto dell'obiettivo.
Se il DO è instabile durante il test, verificare che il volume dell'acqua sia ancora di un punto nove litri e che non sia uscita acqua sotto forma di bolle. La temperatura dell'acqua è stabile e le guarnizioni di tutti i raccordi sono chiuse ermeticamente. Dopo aver riequilibrato il sistema, aggiungere un numero di plecotteri pari al numero di osservatori nel matraccio.
E richiudere il pallone con un tappo di gomma. Far passare bolle nell'acqua come appena dimostrato fino a quando non si raggiunge una concentrazione obiettivo di 10 milligrammi per litro. Successivamente, registrare la temperatura iniziale dell'acqua.
Lasciare che le perle si attacchino alla roccia sottostante all'interno del matraccio. Ogni osservatore conterà e registrerà il numero di flessioni esibite da una singola perla nel corso di tre minuti. Successivamente, modificare la concentrazione di ossigeno disciolto al livello sperimentale successivo e ripetere l'osservazione della durata di tre minuti.
In questa figura, il numero medio di flessioni eseguite all'interno di ciascun livello di OD, e all'interno di ognuna delle sei prove, è stato riportato per rappresentare graficamente le flessioni in funzione del livello di OD. Per questi esperimenti, solo la concentrazione di OD ha influenzato in modo significativo il numero di flessioni eseguite dalle perlacee. Nessun'altra variabile o interazione ha dimostrato di essere un predittore significativo del numero di flessioni.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere riprodotta per raggiungere gli obiettivi specifici stabiliti dal ricercatore. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante evitare variazioni di temperatura, poiché ciò potrebbe provocare cambiamenti nell'ossigeno disciolto (DO). Con questa procedura, altri metodi, come quelli che modificherebbero il pH, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande riguardo agli effetti delle variazioni di pH e di DO sugli organismi acquatici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di manipolare l'ossigeno disciolto in un ambiente di laboratorio per condurre diversi esperimenti sul comportamento animale.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo semplice e riproducibile per manipolare le condizioni di ossigeno disciolto in un ambiente di laboratorio per studi sul comportamento animale. Questo metodo consente l'osservazione delle risposte comportamentali di animali acquatici sia in contesti didattici che di ricerca.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Comportamento animale
- Ecologia acquatica
- Protocolli di laboratorio
Sfondo
- I livelli di ossigeno disciolto sono fondamentali per la vita acquatica.
- Comprendere le risposte degli animali alle variazioni di ossigeno è essenziale per gli studi ecologici.
- Questo protocollo può essere applicato a diverse specie, inclusi macroinvertebrati, pesci e anfibi.
- È adatto sia a scopi educativi che di ricerca.
Scopo dello studio
- Valutare le risposte dell'organismo a variazioni della concentrazione di ossigeno disciolto.
- Fornire un metodo riproducibile per lo studio del comportamento degli animali acquatici.
- Facilitare l'apprendimento pratico in ambienti di laboratorio.
Metodi Utilizzati
- Manipolazione progressiva delle condizioni di ossigeno disciolto.
- Utilizzo di procedure standard con rete da kick per raccogliere organismi acquatici.
- Osservazione delle risposte comportamentali in un ambiente controllato.
- Applicazione sia in contesti didattici che di ricerca.
Risultati principali
- Manipolazione efficace dei livelli di ossigeno disciolto.
- Modifiche comportamentali osservabili nelle specie acquatiche raccolte.
- Il protocollo ha dimostrato efficacia in vari esperimenti sul comportamento animale.
- Fattibilità per l'uso didattico nei laboratori di insegnamento.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce uno strumento prezioso per lo studio del comportamento animale acquatico.
- Può essere adattato per diverse specie e domande di ricerca.
- Stimola la partecipazione all'indagine scientifica in contesti educativi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente una manipolazione controllata dell'ossigeno disciolto per studiare le risposte comportamentali in organismi acquatici, supportando la validazione di bersagli in neurofarmacologia e tossicologia ambientale. Fornendo un metodo riproducibile per indurre condizioni ipossiche o anossiche, esso contribuisce alla riduzione del rischio meccanicistica di composti che influenzano le vie di rilevamento dell'ossigeno. L'approccio è scalabile da laboratori didattici a schermature ad alto rendimento, offrendo un valore predittivo per fenotipi comportamentali associati alla disponibilità di ossigeno.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche relative ai percorsi del fattore inducibile da ipossia (HIF) e alla segnalazione dipendente dall'ossigeno.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli coinvolti nell'omeostasi dell'ossigeno e nell'adattamento comportamentale.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio collegando gli effetti dei composti a modifiche comportamentali osservabili in condizioni controllate di livelli di ossigeno disciolto.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening dose-risposta di composti che influenzano l'utilizzo dell'ossigeno.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione del saggio mediante un controllo stabile della concentrazione di ossigeno disciolto durante finestre di osservazione di 5 minuti.
- Valore predittivo: Fornisce letture comportamentali quantitative (ad esempio, frequenza di flessioni) per una valutazione affidabile dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea a modelli rilevanti per malattie come ischemia, ictus o disturbi metabolici in cui la tensione di ossigeno è alterata.
- Valore operativo: Favorisce la continuità dallo screening comportamentale alla validazione preclinica mediante una manipolazione costante della DO.
- Valore predittivo: Supporta un avanzamento basato sul rischio identificando composti che modulano comportamenti sensibili all'ossigeno.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo, in particolare per composti che agiscono su meccanismi di rilevamento dell'ossigeno.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici isolando l'ossigeno come variabile indipendente in saggi comportamentali.
- Screening: Fornisce output riproducibili e quantitativi durante brevi periodi di osservazione, consentendo uno screening di media capacità.
- Analisi: Fornisce variabili dipendenti misurabili (ad esempio, frequenza dei movimenti) che si correlano alla concentrazione di ossigeno disciolto per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Si collega a modelli preclinici in cui la modulazione dell'ossigeno fornisce informazioni sull'efficacia terapeutica in condizioni di ipossia.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma modulare e scalabile applicabile in diversi progetti che studiano fenotipi sensibili all'ossigeno.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo le variabili di confondimento negli studi comportamentali legati all'ossigeno.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e stabilità dei livelli di ossigeno disciolto per sperimentazioni ripetibili tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale chiarificando i legami meccanicistici tra i livelli di ossigeno e gli esiti fenotipici.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione basata sul rischio di composti che bersagliano le vie di HIF, PHD o la percezione dell'ossigeno.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio di organismi acquatici e nel monitoraggio dell'ossigeno disciolto.
- Necessita di sistemi di controllo dei gas (azoto/aria), fiasche sigillate e sonde per l'ossigeno disciolto per una manipolazione precisa.
- Richiede la standardizzazione del volume d'acqua, della temperatura e della densità degli organismi tra le repliche.
- Limitato a finestre di osservazione inferiori a 5 minuti a causa della deriva termica e dell'instabilità dell'ossigeno disciolto oltre tale intervallo.
- L'adattamento a modelli vertebrati potrebbe richiedere modifiche alle dimensioni della camera e agli endpoint comportamentali.
